微生物生物量的测定方法研究

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

《环境微生物新技术》课程作业2.微生物数量测定方法有哪些？空气、水、土壤样品分别适用哪些方法？请举例说明。

常见微生物数量的测定方法<1>1.计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。

取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。

由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。

本法简便易行，可立即得出结果。

本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。

2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。

因此，要求菌悬液中不含任何碎片。

3、活细胞计数法 :常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。

取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出活菌数。

此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。

使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。

广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。

4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。

细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。

此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。

5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。

湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。

微生物量的测定方法
常见的微生物量测定方法包括：
1. 平皿计数法：将样品按一定稀释倍数加入琼脂平皿中，培养后通过计数器统计微生物在平皿上的数量，以此计算原样品中微生物的数量。

2. 滤膜计数法：将样品过滤后将滤膜放在富含营养的琼脂平板上培养，通过计数器统计滤膜上微生物的数量，以此计算原样品中微生物的数量。

3. 光密度法：利用菌落浑浊作用测定微生物规模大小的方法，称为“比色法”，并以光密度来表示菌落数量的多少。

4. 电极测定法：利用特定的氧化还原反应来测定微生物量，例如，生物化学需氧量（BOD）和化学需氧量（COD）。

5. 溶解氧测定法：利用溶解氧在水中的含量来推算微生物的存在量。

6. 分子生物学方法：利用PCR、DNA芯片等技术检测微生物数量，也可通过它们的遗传物质（如rRNA）来推算微生物的存在量。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

微生物量磷测定方法微生物量磷是生物地球化学循环中的重要元素之一，对于评估生态系统的健康状况和功能发挥具有重要意义。

本文将介绍硫酸钾溶液提取法、酸水解法、紫外线辐射法、高温分解法、氢氧化钠溶液提取法、氯仿处理法、硝酸银滴定法、磷钼蓝比色法、酚红指示剂法以及同位素标记法等微生物量磷的测定方法。

1.硫酸钾溶液提取法硫酸钾溶液提取法是一种常用的测定微生物量磷的方法。

其原理是利用硫酸钾溶液中的钾离子与细菌细胞膜上的磷酸盐进行交换，使细胞膜上的磷释放到溶液中。

通过测定溶液中磷的含量，可以计算出微生物量磷的含量。

2.酸水解法酸水解法是通过在样品中加入强酸，使样品中的有机磷转化为无机磷，再通过测定总磷含量，从而计算出微生物量磷的含量。

该方法具有操作简单、快速等优点，但可能会对样品中的其他元素产生干扰。

3.紫外线辐射法紫外线辐射法是一种利用紫外线辐射分解样品中有机磷的方法。

其原理是紫外线辐射能够破坏有机磷中的化学键，使其转化为无机磷。

该方法具有操作简便、快速等优点，但可能会对样品产生一定的破坏作用。

4.高温分解法高温分解法是通过在高温条件下对样品进行分解，使样品中的有机磷转化为无机磷。

该方法具有操作简便、快速等优点，但可能会对样品产生破坏作用，且不适用于含有活性菌的样品。

5.氢氧化钠溶液提取法氢氧化钠溶液提取法是一种利用氢氧化钠溶液提取样品中有机磷的方法。

其原理是氢氧化钠能够与样品中的有机磷反应，使其转化为可溶性无机磷。

通过测定无机磷含量，可以计算出微生物量磷的含量。

该方法具有操作简便、快速等优点，但可能会对样品产生一定的破坏作用。

6.氯仿处理法氯仿处理法是一种利用氯仿等有机溶剂分离样品中脂类物质的方法。

通过氯仿处理可以去除样品中的脂类物质，从而减小其对磷测定的干扰。

该方法具有操作简便、快速等优点，但需要使用氯仿等有害有机溶剂，需要注意安全问题。

7.硝酸银滴定法硝酸银滴定法是一种利用硝酸银滴定剂测定样品中无机磷含量的方法。

微生物生物量微生物生物量是指在特定环境中存在的微生物的总量。

微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。

它们广泛存在于地球上的各个环境中，如土壤、水体、大气等。

微生物生物量的研究对于了解生态系统的结构和功能具有重要意义。

微生物生物量的测定方法有多种，常用的方法包括直接计数法、间接计数法和生物量估算法。

直接计数法是通过显微镜观察和计数微生物来测定其数量，适用于微生物生物量较低的样品。

间接计数法是通过测定微生物的代谢产物或特定标志物来推测其数量，如菌落计数法、蛋白质含量测定法等。

生物量估算法是通过测定微生物的生物量指标来估算其生物量，如细胞质量、DNA含量、膜脂含量等。

微生物生物量的大小受到多种因素的影响，包括环境因素和生物因素。

环境因素包括温度、湿度、营养物质的供应等，这些因素会影响微生物的生长和繁殖。

生物因素包括微生物的种类、代谢活性等，不同种类的微生物在不同环境条件下生物量的变化也不同。

微生物生物量在生态系统中起着重要的作用。

首先，微生物是生态系统中的重要生物转化者。

它们能够分解有机物质，促进有机物质的循环和再利用。

例如，细菌和真菌能够分解植物残体和动物尸体，将有机物质转化为无机物质，并释放出二氧化碳和营养盐。

其次，微生物还参与了生态系统中的能量流动和营养物质循环。

微生物通过光合作用和化学合成作用，能够将太阳能和无机物质转化为有机物质，为生态系统的能量来源和营养物质提供。

此外，微生物还能够参与土壤形成和水体净化等过程，对维持生态系统的平衡和稳定起着重要作用。

微生物生物量的变化对生态系统的稳定性和功能具有重要影响。

当微生物生物量过高或过低时，都可能对生态系统的结构和功能产生负面影响。

例如，当水体中的藻类生物量过高时，会引起水华现象，导致水体富营养化和氧气缺乏，进而影响水生生物的生存。

另外，微生物生物量的变化还会影响生态系统的稳定性。

微生物在分解有机物质和转化无机物质的过程中产生了一系列的酶和代谢产物，这些物质能够影响生态系统中其他生物的生长和繁殖。

2 土壤微生物量测定土壤微生物量（MB）是指土壤中体积小于5x103叩3的生物总量，但活的植物体如植物根系等不包括在内］。

它通过调控土壤中能量和养分循环以及有机物转化，来反映土壤同化和矿化能力。

土壤微生物生物量包括土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量磷和土壤微生物生物量硫，但一般情况下土壤微生物生物量的大小以土壤微生物生物量碳来表示。

2.1熏蒸浸提法2.1.1原理利用不同的浸提剂，通过氧化滴定法来测定土壤浸提液中有机C、N和P提取的可溶性有机碳含量和微生物量C之间存在较稳定的比例关系。

2.1.2则定步骤1.根据土壤样品含水量，调节土壤含水量为田间持水量的50%，25 ℃下密封培养10 d，以保持土壤均匀和不同地方所得结果的可比性。

2.氯仿熏蒸24 h后，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。

根据所测对象不同选择不同的提取剂浸提，振荡浸提30 min后，立即分析浸提液中所测对象的含量或放入-15 ℃下保存。

表1指出氯仿熏蒸浸提法测定不同土壤微生物量所选用的浸提剂及其条件。

表1姓熏薪髓喉土就生帽条件Table I F'E fcrdieneasuirm aitcondiocnsof soilm riobialbmass土情即鄢Detemiia血cfhdicaMr Eitatnt土觥生醯K(=D,3S 或D.45土觥物1小K国加士躺蜘M恻般注®拓牖腌雄魂航觥刎楠融脑机装痴螭定雕耐帕帆小麒眼3 土壤酶活性测定土壤酶活性均用风干土壤。

土壤转化酶活性和过氧化氢酶活性、脲酶活性、磷酸酶活性依次用硫代硫酸钠滴定法、高锰酸钾滴定法、靛酚蓝比色法和磷酸苯二钠比色法测定（关松荫,1986）3.1脲酶一一靛酚蓝比色法脲酶的活性可以用来表示土壤供氮能力（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

土壤微生物生物量的测定方法1.直接计数法：直接计数法是通过显微镜观察土壤样品中微生物数量来测定土壤微生物生物量。

常用的直接计数法包括滴定法、薄层计数法和电镜计数法。

滴定法是将土壤样品溶解后，通过滴定法来计数微生物细胞的数量。

滴定法主要包括用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为参比菌，将细菌与土壤样品混合，经一系列稀释后进行滴定。

通过观察滴定液中菌落的数量，可以推算出原始土壤样品中微生物的生物量。

薄层计数法是将土壤样品制成薄层，然后在显微镜下进行计数。

这种方法可以直接观察微生物的形态特征，通过计算单位面积上微生物的数量来估算微生物生物量。

电镜计数法是利用电镜的高分辨率特性，观察土壤样品中微生物的形态和数量。

这种方法可以观察到更小的微生物和微生物的形态细节，但是操作复杂，成本较高。

2.间接测定法：间接测定法通过测定土壤中微生物活性代谢产物来估算微生物生物量。

常用的间接测定法包括ATP测定法、细胞膜脂肪酸测定法和氮素代谢产物测定法等。

ATP测定法是通过测定土壤中的三磷酸腺苷(ATP)含量来估算微生物生物量。

微生物的ATP含量与其生物量有一定的关系，因此可以通过测定ATP含量来间接估算土壤微生物生物量。

细胞膜脂肪酸测定法是通过测定土壤样品中微生物细胞膜中的脂肪酸含量来估算微生物生物量。

微生物细胞膜中的脂肪酸种类和含量与微生物群落的组成和数量有关，因此可以通过测定脂肪酸的含量来间接估算微生物生物量。

氮素代谢产物测定法是通过测定土壤样品中微生物氮素代谢产物的含量来估算微生物生物量。

微生物的氮素代谢活动与其生物量有关，因此可以通过测定氮素代谢产物的含量来间接估算微生物生物量。

3.分子生物学方法：分子生物学方法是利用PCR技术对土壤样品中微生物的DNA或RNA进行扩增和测定来估算微生物生物量。

常用的分子生物学方法包括引物扩增法、荧光原位杂交法和高通量测序法等。

引物扩增法是通过设计特定的引物对微生物的DNA或RNA进行扩增，并通过PCR反应的产物数量来估算微生物生物量。

土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。

配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。

待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。

（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。

（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。

要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。

（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。

值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。

（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。

土壤微生物生物量的测定方法汇总操作步骤：1.准备工作：采集土壤样品，并将土壤样品分为适量的小样品。

2.氯仿熏蒸：将一定量的小样品放入氯仿熏蒸瓶中，然后加入适量的氯仿，并快速将瓶口封紧。

3.震荡：用震荡器对氯仿与土壤样品进行充分的混合震荡，使氯仿充分与土壤样品接触。

4.放置：将瓶子放置在室温下静置一段时间，一般为24小时，使土壤样品中的微生物充分溶解到氯仿中。

5.分液：将上清液和沉淀物分离。

上清液中含有溶解在氯仿中的微生物细胞，沉淀物中含有没有溶解的土壤颗粒和其他杂质。

6.校验：对上清液进行校验，可以采用PFLA（没有悬浮杂质时的上清液）或PFLA-Na2CO3（有悬浮杂质时的上清液）校验液。

7.测定：将校验液填入比色皿中，使用分光光度计对比色皿中的液体进行测定，并记录吸光度值。

原理：氯仿熏蒸法通过将土壤样品与氯仿混合，可以将土壤中的微生物细胞全部溶解到氯仿中。

通过将溶解在氯仿中的微生物细胞与校验液比色，在分光光度计上测定吸光度值，从而确定土壤中微生物的生物量。

氯仿熏蒸法的优点：1.操作简单，不需要复杂的设备和技术支持。

2.适用于各种类型的土壤，包括砂土、壤土、黏土等。

3.测定结果可靠，具有较高的重复性和准确性。

氯仿熏蒸法的缺点：1.只能测定细菌和放线菌等氧气需氧微生物，不能测定厌氧微生物的生物量。

2.氯仿对环境和人体有一定的毒性和危险性，操作时需要注意安全。

总结：氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物生物量的方法。

通过将土壤样品与氯仿混合，将微生物细胞溶解到氯仿中，然后通过比色法测定吸光度值，从而确定土壤中微生物的生物量。

氯仿熏蒸法操作简单，适用于各种类型的土壤，且结果可靠。

但需要注意操作时的安全性。

除了氯仿熏蒸法外，还有其他一些方法也可用于测定土壤微生物生物量，如酚酸法、磷酸化氧化法等，可以根据实际需求选择合适的方法进行测定。