土壤微生物生物量碳测定方法

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

土壤微生物生物量碳测定方法一、呼吸法通过测定土壤中微生物呼吸释放的CO2量来间接估算土壤微生物生物量碳。

该方法的原理基于微生物在代谢过程中产生的CO2量与其生物量碳之间的正相关关系。

常用的测定方法包括静态方法和动态方法。

1.静态方法：在采样后立即封闭土壤样品容器，然后测定一定时间内容器内CO2的累积释放量，并利用其中一种模型计算微生物生物量碳。

例如，利用静态方法可以测定土壤有机碳浓度和总CO2浓度，通过两者的比值计算微生物生物量碳。

2.动态方法：将土壤样品装入氧气通气的大容器中，测定一定时间内容器中CO2的连续释放量，并通过外推法计算微生物生物量碳。

例如，可以通过监测土壤样品容器中CO2的连续释放曲线，然后利用微生物呼吸速率和微生物生物量碳之间的关系计算微生物生物量碳。

二、估算法利用土壤中微生物生物量碳与其中一种土壤性质之间的相关性来估算土壤微生物生物量碳。

常用的估算法包括土壤学习法、土壤酶学法和土壤微生物生态法。

1.土壤学习法：根据不同土壤类型的土壤微生物生物量碳数据进行学习建模，然后根据土壤性质数据进行预测。

常用的学习方法包括主成分分析、判别分析和回归分析等。

2.土壤酶学法：通过测定土壤中一些酶活性与微生物生物量碳之间的相关性来预测微生物生物量碳。

常用的酶活性指标包括脲酶、蔗糖酶和脱氢气酶等。

3.土壤微生物生态法：通过测定土壤微生物多样性和群落结构与微生物生物量碳之间的相关性来估算微生物生物量碳。

常用的方法包括16SrRNA和ITS基因测序、脂肪酸指纹技术和磷脂脂肪酸分析等。

三、标记法通过标记的同位素技术测定土壤微生物生物量碳。

其中，最常用的标记同位素是^13C和^14C。

通过给土壤样品添加同位素标记物并追踪其在土壤中的分布和转化，可以计算微生物生物量碳。

总结起来，土壤微生物生物量碳的测定方法主要包括呼吸法、估算法和标记法等。

不同的方法适用于不同的土壤类型和测定目的，综合运用多种方法可以更准确地评估土壤微生物生物量碳。

土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomasS不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。

近40 年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。

由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳（Microbial biomass carbon, Be来表示土壤微生物生物量的大小。

测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigatio n-i ncubatio n. Fl）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。

熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加-1入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。

Voro ney（1983）发现熏蒸土壤用0.5mol LK2SO4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。

Vanee等（1987）建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol L-1K2SO4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数KEC取值0.38）来计算土壤微生物碳。

Wu 等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。

该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。

林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。

对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数KEC的取值，有很多研究进行了大量的14研究。

测定KEC值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。

一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。

将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。

注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。

硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。

六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。

过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。

磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。

2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物量碳测定方法：1、试剂配制：1、0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶液于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加热）定容至1 L。

2、去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。

再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次，将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。

3、0.8000 mol.L-1 1/6 K2Cr2O7 标准溶液；称取39.2245g重铬酸钾（K2Cr2O7分纯）加400 ml蒸馏水加热溶解，冷却定容1L4、02 mol.L-1 FeSO4 溶液，56.0g硫酸亚铁【FeSO1.7H2O】溶解蒸馏水中，加15ml浓硫酸，用蒸馏水定容至1L5、邻啡罗啉指示剂：1.485g邻啡罗啉（C2H8N2.H2O）及0.695g硫酸亚铁（FeSO4.7H2O）溶于100ml 蒸馏水，形成红棕色络合物【（FeC12H8.N2）8 2+】,贮存于棕色瓶中2、试验步骤：1、制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%的水在25℃下培养7~15d【day】，取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，精制5分钟，再抽滤5分钟，同样操作重复三次。

干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。

按照土：0.5M K2SO4=1:4（烘干土算，一般就是湿土；0.5M K2SO4=1:2），加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。

氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳一、采样与样品预处理土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。

采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。

如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。

过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。

预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。

土壤田间持水量采用改进的Shaw（1958）方法测定。

在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗用玻璃纤维堵塞。

取50.00 g土壤于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50 ml水，保持30 min，再打开夹子使多余的水流入量筒，30 min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量，用烘干土壤质量表示。

——林启美老师文件内容二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE）1、方法原理土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。

通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。

浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定，也可用微量碳分析仪测定。

此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。

2、仪器及设备培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。

3、试剂1.无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[ϕ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。

再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。

得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。

（试剂浓硫酸ϕ(H2SO4)=95~98% ，稀释19倍）2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1]: 称取硫酸钾（K2SO4,化学纯）87.10g，加热溶于去离子水中，稀释至1L。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物量碳氮测定方法土壤微生物量碳氮测定是评估土壤有机质含量和土壤微生物活性的重要方法之一、它可以帮助我们了解土壤中有机质的分解和氮素的转化过程，对土壤健康和养分循环有重要意义。

下面将从土壤微生物量碳氮的测定原理、方法以及应用等方面进行详细的阐述。

一、原理与意义：土壤微生物量碳（Microbial Biomass Carbon, MBC）是土壤中微生物所含有的碳量，包括微生物本体的碳和微生物产生的胞外有机物的碳。

土壤微生物量氮（Microbial Biomass Nitrogen, MBN）则是土壤微生物所含有的氮量。

土壤微生物量碳氮的测定主要利用的是微生物生物量对有机碳氮的吸收和蓄积能力，在土壤中有机质降解与微生物活动之间存在着紧密的关系。

测定土壤微生物量碳氮的主要意义在于：1.评估土壤质量：土壤微生物是土壤中的重要组成部分，对土壤生态系统的功能发挥起着重要作用。

通过测定土壤微生物量碳氮，可以判断土壤中的微生物含量和活性，进而评估土壤的质量和健康状况。

2.预测土壤肥力：土壤微生物参与了有机质的降解和养分的转化过程，因此它们的代谢活动直接影响土壤肥力。

测定土壤微生物量碳氮可以预测土壤中有机质的分解速率和养分的供应状况，为合理施肥提供依据。

3.监测土壤生态系统的健康：土壤微生物对环境变化非常敏感，其数量和活性的变化可以反映土壤生态系统的稳定性和健康状况。

通过定期测定土壤微生物量碳氮，可以监测土壤生态系统的变化，帮助我们了解土壤的自净能力和恢复能力。

二、测定方法：目前，常用的土壤微生物量碳氮测定方法主要有不同源于Chen et al. (1998) 和Jenkinson及仪器方法（如戴弗尔仪器、百威仪器等）。

1.直接抑制剂法：该方法基于土壤微生物量碳氮含量对微生物生长的抑制作用。

通过向土壤样品中加入抑制剂（如消费抑制剂氟愈刀或氯化丙夫），抑制土壤中微生物的生长，然后测定加入抑制剂后土壤中微生物量碳氮的变化。

1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪一、方法原理土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。

1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。

2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。

直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。

直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。

现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。

本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。

二、主要仪器振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。

二、试剂1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。

将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。

2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57 g分析纯K2SO4 定溶至1 L。

四、操作步骤称取过2 mm筛的新鲜土样12.5 g六份，置于小烧杯中。

将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。

抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。

熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。

另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。

将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50 mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30 min，过滤。

土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。

配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。

待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。

（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。

（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。

要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。

（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。

值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。

（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物量碳测定方法土壤微生物量碳（Soil microbial biomass carbon，SMBC）是指活体微生物在土壤中的碳含量，是土壤微生物数量的指标之一，反映了土壤中微生物活动的水平。

测定土壤微生物量碳的方法有多种，包括气体护膜冻融法、氟化钠浸提法、氯仿蒸腾法等。

下面将介绍常用的土壤微生物量碳测定方法。

一、气体护膜冻融法（gas chromatographic method with chloroform fumigation extraction，CFE-GC）气体护膜冻融法是一种基于微生物细胞内的总碳测定方法。

具体操作步骤如下：1.取一定量土壤样品，将样本均匀摊在烟斗滤纸上；2.用氯仿制备一定浓度的蒸腾液；3.将氯仿蒸腾液均匀喷洒在土壤样品表面；4.将喷洒后的土样与烟斗滤纸一起放入长颈瓶中，用橡皮塞封口；5.将长颈瓶放入液态氮中，使其迅速冷冻；6. 将冷冻后的样品研磨至细腻，并与含量已知的标准样一起送入气相色谱仪（gas chromatograph，GC）进行测定；7.根据标准曲线计算土壤微生物量碳含量。

二、氟化钠浸提法（NaF method）氟化钠浸提法是一种利用氟离子抑制土壤中微生物的酶活性，从而测定微生物量碳含量的方法。

具体操作步骤如下：1.取一定量土壤样品，加入含有一定浓度的氟化钠溶液；2.震荡混合一段时间，使土壤中的微生物碳与氟离子进行结合；3.将样品置于高速离心机中离心，分离土壤颗粒与液相；4.将上清液倒入瓶中，加入酸进行中和；5.酸中和后，将溶液进行干燥，得到土壤微生物量碳的干重；6.根据干重计算土壤中微生物量碳的含量。

三、氯仿蒸腾法（chloroform fumigation-extraction，CFE）氯仿蒸腾法是一种基于微生物细胞内溶质增加量来计算微生物量碳的方法。

具体操作步骤如下：1.取一定量土壤样品，将样本均匀摊在烟斗滤纸上；2.用氯仿蒸腾液均匀喷洒在土壤样品表面；3.将氯仿蒸腾的土样与烟斗滤纸一起放入密封瓶中，使其在常温下进行蒸发；4.将蒸发后的土样与烟斗滤纸一起进行提取，得到提取液；5.对提取液进行化学分析，测定其中的微生物量碳含量；6.根据微生物量碳的含量计算土壤中微生物量碳的含量。

熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳一、实验原理：用氯仿杀死土壤中的微生物，并接种新的土壤，培养微生物使之释放二氧化碳。

测量一定时间内熏蒸土壤与为熏蒸土壤中微生物释放的二氧化碳量来估算土壤中微生物的生物量碳。

二、实验步骤：1.氯仿去乙醇。

用锡箔纸包裹分液漏斗（纵向留出一条细缝，以便观察分层情况）。

向分液漏斗中加入氯仿和氯仿一半体积的蒸馏水，盖上分液漏斗的盖子，上下摇晃数次。

静置片刻，放出分液漏斗下层的氯仿。

2.抽气。

用细筛筛选250g土壤于500mL烧杯中，并将烧杯至于干燥器中。

干燥器内放入盛有少量蒸馏水的小烧杯。

另取100mL干燥的烧杯一个，向其中加入50mL去乙醇氯仿和干燥的玻璃珠（防止氯仿爆沸，且要铺满整个烧杯底部）后，将之放入干燥器中。

在盖子内侧贴上一条蒸馏水润湿的滤纸条。

盖好干燥器的盖子，用真空泵抽气至氯仿沸腾，关闭干燥器的活塞。

把干燥器放入遮光恒温（25℃）的条件下培养24小时。

3.排出氯仿。

取出干燥器内的氯仿和湿润的滤纸条，在次抽气三分钟后打开盖子散发土壤中的氯仿，如此连续反复三次，就能排出土壤中的氯仿。

4.另筛取250g土壤，不熏蒸。

分别在熏蒸土壤和未熏蒸土壤中加入1g新鲜土壤且充分混匀。

调节土壤水分至罪大含水量的55％。

将两份土壤各放入一个未放干燥剂的干燥器中。

在干燥器中放入盛有20mL蒸馏水的烧杯盛有100mL 1mol/L NaOH溶液，盖好盖子，培养十天。

5.滴定。

取出NaOH溶液，取25mL于250mL容量瓶中，定溶。

从容量瓶中取出20mL于150mL三角瓶中，用1mol/L的HCl溶液调节Ph至10。

再用0.05mol/L的HCl溶液滴定至Ph为8.3，继续滴定至Ph为3.7，记录Ph从8.3到3.7所消耗HCl溶液的体积。

.三、计算K YX B -=土壤微生物生物量碳其中，X为熏蒸土壤释放的CO2量，Y为未熏蒸土壤释放的CO2量，由滴定所消耗的HCl溶液的体积计算得出。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

土壤微生物生物量(碳、氮）的测定(滴定法)一、实验目的和内容土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。

耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。

近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。

目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（ATP）法。

氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。

通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。

二、实验材料和用具仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）试剂：1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。

方法为：量取500ml氯仿于1000ml 分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。

再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。

将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。

2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。

最后定容至1L；3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。