氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷一、采样与样品预处理（同微生物生物量碳）土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。

采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。

如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。

过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。

预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。

二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE）1、方法原理土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的磷大幅度增加。

通过测定浸提液中磷的增加量，估算土壤微生物量磷。

浸提液中磷用钼锑抗比色法测定。

2、仪器及设备培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；分光光度计3、试剂1.无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[ϕ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。

再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。

得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。

（试剂浓硫酸ϕ(H2SO4)=95~98% ，稀释19倍）2.0.5mol/L NaHCO3：42.0g NaHCO3(化学纯)溶于800mL水中，用0.5mol/L NaOH调节溶液的pH至8.5，用去离子水稀释至1L。

溶液贮存于塑料瓶中。

长时间放置，使用前必须检验pH值。

3.钼锑抗试剂：称取酒石酸锑钾0.5g，溶解于100mL水中，制成0.5%的溶液。

另称取钼酸铵10g，溶于450mL水中，徐徐加入153mL浓H2SO4，边加边搅。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。

将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。

注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。

硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。

六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。

过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。

磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。

2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

2 土壤微生物量测定土壤微生物量（MB）是指土壤中体积小于5x103叩3的生物总量，但活的植物体如植物根系等不包括在内］。

它通过调控土壤中能量和养分循环以及有机物转化，来反映土壤同化和矿化能力。

土壤微生物生物量包括土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量磷和土壤微生物生物量硫，但一般情况下土壤微生物生物量的大小以土壤微生物生物量碳来表示。

2.1熏蒸浸提法2.1.1原理利用不同的浸提剂，通过氧化滴定法来测定土壤浸提液中有机C、N和P提取的可溶性有机碳含量和微生物量C之间存在较稳定的比例关系。

2.1.2则定步骤1.根据土壤样品含水量，调节土壤含水量为田间持水量的50%，25 ℃下密封培养10 d，以保持土壤均匀和不同地方所得结果的可比性。

2.氯仿熏蒸24 h后，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。

根据所测对象不同选择不同的提取剂浸提，振荡浸提30 min后，立即分析浸提液中所测对象的含量或放入-15 ℃下保存。

表1指出氯仿熏蒸浸提法测定不同土壤微生物量所选用的浸提剂及其条件。

表1姓熏薪髓喉土就生帽条件Table I F'E fcrdieneasuirm aitcondiocnsof soilm riobialbmass土情即鄢Detemiia血cfhdicaMr Eitatnt土觥生醯K(=D,3S 或D.45土觥物1小K国加士躺蜘M恻般注®拓牖腌雄魂航觥刎楠融脑机装痴螭定雕耐帕帆小麒眼3 土壤酶活性测定土壤酶活性均用风干土壤。

土壤转化酶活性和过氧化氢酶活性、脲酶活性、磷酸酶活性依次用硫代硫酸钠滴定法、高锰酸钾滴定法、靛酚蓝比色法和磷酸苯二钠比色法测定（关松荫,1986）3.1脲酶一一靛酚蓝比色法脲酶的活性可以用来表示土壤供氮能力（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。

配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。

待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。

（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。

（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。

要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。

（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。

值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。

（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳一、实验原理：用氯仿杀死土壤中的微生物，并接种新的土壤，培养微生物使之释放二氧化碳。

测量一定时间内熏蒸土壤与为熏蒸土壤中微生物释放的二氧化碳量来估算土壤中微生物的生物量碳。

二、实验步骤：1.氯仿去乙醇。

用锡箔纸包裹分液漏斗（纵向留出一条细缝，以便观察分层情况）。

向分液漏斗中加入氯仿和氯仿一半体积的蒸馏水，盖上分液漏斗的盖子，上下摇晃数次。

静置片刻，放出分液漏斗下层的氯仿。

2.抽气。

用细筛筛选250g土壤于500mL烧杯中，并将烧杯至于干燥器中。

干燥器内放入盛有少量蒸馏水的小烧杯。

另取100mL干燥的烧杯一个，向其中加入50mL去乙醇氯仿和干燥的玻璃珠（防止氯仿爆沸，且要铺满整个烧杯底部）后，将之放入干燥器中。

在盖子内侧贴上一条蒸馏水润湿的滤纸条。

盖好干燥器的盖子，用真空泵抽气至氯仿沸腾，关闭干燥器的活塞。

把干燥器放入遮光恒温（25℃）的条件下培养24小时。

3.排出氯仿。

取出干燥器内的氯仿和湿润的滤纸条，在次抽气三分钟后打开盖子散发土壤中的氯仿，如此连续反复三次，就能排出土壤中的氯仿。

4.另筛取250g土壤，不熏蒸。

分别在熏蒸土壤和未熏蒸土壤中加入1g新鲜土壤且充分混匀。

调节土壤水分至罪大含水量的55％。

将两份土壤各放入一个未放干燥剂的干燥器中。

在干燥器中放入盛有20mL蒸馏水的烧杯盛有100mL 1mol/L NaOH溶液，盖好盖子，培养十天。

5.滴定。

取出NaOH溶液，取25mL于250mL容量瓶中，定溶。

从容量瓶中取出20mL于150mL三角瓶中，用1mol/L的HCl溶液调节Ph至10。

再用0.05mol/L的HCl溶液滴定至Ph为8.3，继续滴定至Ph为3.7，记录Ph从8.3到3.7所消耗HCl溶液的体积。

.三、计算K YX B -=土壤微生物生物量碳其中，X为熏蒸土壤释放的CO2量，Y为未熏蒸土壤释放的CO2量，由滴定所消耗的HCl溶液的体积计算得出。

旱作条件下不同覆盖及耕作方式对土壤微生物量磷的影响张丽华1,黄高宝2,张仁陟1(1.甘肃农业大学资源与环境学院,甘肃兰州　730070;2.甘肃农业大学农学院,甘肃兰州　730070) 摘要:在干旱半干旱的定西市安定区李家堡镇进行了田间定位试验,运用氯仿熏蒸浸提法测定了土壤微生物量磷含量,研究了不同覆盖、不同耕作方式及不同轮作方式对土壤微生物量磷的影响.结果表明:轮作次序对不同耕作方式及不同覆盖条件下土壤微生物量磷没有影响;0～5cm土层中土壤微生物量磷含量免耕秸秆覆盖比传统耕作增加了29.1%,比免耕增加了6.9%,比传统耕作配合秸秆覆盖增加了5.8%;免耕地膜覆盖土壤微生物量磷比传统耕作增加了15.7%,免耕对土壤微生物量磷的影响主要表现在耕层;土壤微生物量磷的季节性变化呈冬季显著高于其他季节的趋势. 关键词:土壤微生物量磷;耕作方式;覆盖 中图分类号:S154.3 文献标识码:A 文章编号:100324315(2006)0620098204Eff ects of different cover and rotation o n soil micro bial biomassphosp hor us in rain2fed agricultureZHAN G Li2hua1,HUAN G G ao2bao2,ZHAN G Ren2zhi1(College of Re source s and Enviro nmental Science s,G ansu Agricultural Univer sity,G ansu,La nzhou730070;2.College of Agro n o my,G a nsu Agricultural Univer sity,G ansu,La nzhou730070,China) Abst ract:The effect s of diffe rent cover,cult ivation and rot ation syst em on soil mi crobial biomass phosphorus(SMB P)of arid and semi2ari d area were st udied in t hi s paper ba sed on located fi el d e xperiment i n Liji abu village of Di ngxi count y,G ansu provi nce.The soil mi crobial biomass phosphor us was measured by t he met hod of chloroform f umi gation ext rat ion.The result s showed t hat t he rot ation sequence had lit tl e effect on SMB P of different cover and cult ivation syst ems.No2ti ll wi t h st raw cover increased29.1%,6.9% and5.8%of SMB P when compared wit h t hat of convent io nal t illage wit h no st raw,no2till wit h no st raw cover and conve ntional tillage wi t h st raw0～5cm tie r.SMB P t hrough no2till wi t h plast ic m ul ch increased 15.7%i n cul ti vat io n ti er.The biological acti vi ty of no2t ill showe d mainl y in culti vation tier.The sea son cha nge al so showed t hat SMB P i n wi nt er was hi gher. K ey w or ds:soil microbial biomass p hosp horus;cover;culti vation 土壤矿物对磷有强烈的吸附和固定作用,因此土壤磷的植物有效性普遍较低,但土壤中有相当数量的微生物具有将难溶性的磷转化为植物可利用磷作者简介:张丽华(1964-),甘肃兰州人,副教授,学士,主要从事土壤微生物研究工作资助基金甘肃农业大学与澳大利亚合作I R项目收稿日期668的能力[1].土壤微生物量磷(Soil microbial biomass p hosp horus,SMB P)是土壤微生物量的重要组成部分,也是土壤有机磷最活跃的部分,由于其周转速率快,可迅速参与养分循环,因而成为植物有效磷的重要来源.微生物量磷的年流通量至少是微生物量磷的倍,在数量上是植物每年吸收磷的～倍因此,微生物量磷对调控土壤磷的植物有效性及磷的2006年12月第6期98～101甘　肃　农　业　大　学　学　报J OURNAL OF GANSU A GRICUL TURAL UN IV ERSI TY第41卷双月刊.:A C A.:200-0-02410.生态循环具有十分重要的意义[2]. 本研究在干旱半干旱的定西市李家堡镇布置田间定位试验,通过小麦2碗豆轮作,对在传统耕作和免耕体系下采取未覆盖、秸秆覆盖和薄膜覆盖3种处理后土壤微生物量磷的变化进行了对比研究,以探索不同耕作方式、不同覆盖对土壤微生物量磷的影响,揭示土壤磷的微生物学特征,以期为通过生物学途径提高土壤磷的利用率提供理论依据.1　材料与方法1.1　试验区概况 试验点设在地处甘肃中南部的定西市,属黄土高原丘陵沟壑区.海拔为1700～2580m,年日照时数2500h,年均气温6.3℃,无霜期为141d,年平均降水量390m m,雨热同期,热量可满足一般喜温作物的需要.土壤为典型的黄绵土,土质松软,土层深厚,质地均匀,贮水性能良好.1.2　试验设计 试验始于2001年8月,共设6个处理,4次重复,小区面积4m×20m,采用随机区组排列.实行春小麦2豌豆双序列轮作制度,春小麦各处理施纯氮105kg/hm2,纯P2O5105kg/hm2.豌豆各处理均施纯氮20kg/hm2,纯P2O5105kg/hm2.所有肥料都作为基肥在播种时一同施入,并施加化学除草剂进行土壤处理. 传统耕作不覆盖(T,conventional tilla ge wit h no st raw):试验地在前茬收获后三耕两耱.8月份收获后马上进行第1次耕作,8月底和9月份分别进行第2、3次耕作,耕深依次为20c m、10cm和5cm. 9月份第3次耕后耱1次,10月份冻结前再耱1次,这是定西地区很典型的传统耕作方式. 传统耕作结合秸秆还田(TS,conve ntional til l2 age wit h st raw i ncorporated):试验地耕耱同T(三耕两耱),但在第1次耕作的同时将秸秆翻入.前茬作物收获的所有秸秆脱粒后立即还原小区,并随耕作翻入土壤.2001年所有的小区都用铡过的麦草(6750kg/hm2). 传统耕作结合薄膜覆盖(TP,conventional til l2)此处理的犁地方式和耱地方式与处理T基本相同不同之处是在月最后次耱地后用塑料覆盖塑料薄膜覆盖在作物行间,覆盖带宽度为40cm. 免耕不覆盖(N T,no2till wi t h no st raw cover):整个试验期免耕,不覆盖任何材料,也称铁茬. 免耕秸秆覆盖(N TS,no2ti ll wit h st raw cov2 er):整个试验期免耕.从8月至第2年整个生育期地面覆盖铡过的小麦秸秆(6750kg/hm2). 免耕地膜覆盖(N TP,no2t ill wit h plast ic mulch):塑料薄膜将在10月份覆盖,使用的机器与处理TP相同.为了避免损坏塑料薄膜,在收获后将作物残茬(应短于5cm)刈除或耙除.1.3　采样方法及前处理 采样时间为2004年3月15日即作物播种前,采样深度依次为0～5cm,5～10cm,10～30cm,多点(5～6个)取样混合均匀,保存在4℃冰箱中. 测定前仔细除去土样中可见植物残体、根系和土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2mm)彻底混匀,处理过程中应尽量避免破坏土壤结构,并调节新鲜土样含水量至45%田间持水量为宜[4].1.4　样品预培及测定方法 为了消除土壤水分限制对微生物的影响,以及植物残体组织对测定的干扰,土壤微生物量测定的全部样品要在统一条件下进行预培养.将待测样品放在烧杯中,与装500mL自来水和200mL稀碱(1mol/L NaO H)溶液的烧杯一起放在密闭的容器中,在室温下培养1周[5]. 针对本区土壤特点,土壤微生物量磷的测定参照B rookes[1]和Hedley[6]等人的方法,即采用氯仿熏蒸法,用Ol se n提取剂(0.5mol/L Na HCO3, p H8.5)在1∶4的土水比中提取30min,提取液中P的测定用钼酸铵2抗坏血酸比色法[7]. 计算公式:SMB P=E p/K 式中:SMB P———土壤微生物量磷质量分数, mg/kg; E p———熏蒸土样提取液中的磷与未熏蒸土样之间的差值,mg/kg K———熏蒸杀死的微生物中的磷被提取的比例,常取0.4.　结果与分析　轮作次序对土壤微生物量磷的影响 小麦2豌豆轮作(W22W2)、豌豆2小麦轮作(299第6期 张丽华等:旱作条件下不同覆盖及耕作方式对土壤微生物量磷的影响 age wit h plastic:.101.22.1P P PW2P2W)土壤微生物的磷测定结果如表1:表1　轮作次序对土壤微生物量磷的影响Tab.1　Effect of differ ent rotation system onmicrobial bioma ss P in soil轮作次序不同土层中土壤微生物量磷含量/mg kg-1 0～5cm5～10cm10～30c mW2P2W2P7.91a7.91a 3.77aP2W2P2W7.93a7.58a 3.74a 从表1可知,轮作对土壤中微生物量磷无太大的影响,W2P2W2P序列和P2W2P2W序列土壤微生物量磷在0～5cm、5～10cm、10～30cm土层中差异均不显著,但在2个轮作序列中表层土壤与10～30cm土层中微生物量磷有显著差异(P<0.05).这说明轮作次序对土壤微生物量磷影响不大.2.2　耕作方式与秸秆覆盖对土壤微生物量磷的影响 从表2可以看出,在不同的耕作方式下秸秆覆盖的各处理间土壤微生物量磷在各土层变大不一致.0～5cm表层土壤微生物量磷含量N TS>TS> N T>T,5～10cm亚表层土壤微生物量磷含量TS >N TS>N T>T,10～30cm土层土壤微生物量磷含量TS>T>N TS>N T.在表层土壤中,传统耕作结合秸秆还田(TS)、免耕(N T)、免耕秸秆覆盖(N TS)3者之间土壤微生物量磷含量差异不显著,但这3个处理与传统耕作(T)相比土壤微生物量磷含量都有所提高.免耕秸秆覆盖(N TS)比传统耕作(T)、免耕(N T)、传统耕作结合秸秆覆盖(TS)土壤微生物磷含量分别高了29.14%、6.85%、5.82 %.在亚表层土壤中各处理的土壤微生物磷含量与表层土壤基本相似.免耕秸秆覆盖比传统耕作增加了29.7%,比单纯免耕高了12.8%。

土壤微生物生物量的测定方法土壤微生物生物量是衡量土壤生态系统功能的重要指标之一、测定土壤微生物生物量可以帮助我们了解土壤生态系统的活跃度和健康状况，进而指导土壤环境修复以及农田生产管理。

氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物生物量的方法，本文将对该方法进行详细介绍。

首先，介绍氯仿熏蒸法的原理。

氯仿是一种广谱杀菌剂，可以破坏土壤中的微生物细胞膜，使微生物失去活性。

在测定土壤微生物生物量时，将土壤样品放置在含有适量氯仿的密闭容器中，通过熏蒸的方式杀灭土壤中的活性微生物。

熏蒸时间通常为24小时。

然后，通过测定氯仿熏蒸前后土壤中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。

其次，介绍氯仿熏蒸法的操作步骤。

首先，将采集到的土壤样品通过筛网筛选除去杂质。

然后，将土壤样品平均分配到已预先称量好的量筒中。

每个量筒中的土壤样品重量应保持一致。

为了保证测定的准确性，通常会设置重复样品。

接下来，在密闭容器的底部放置氟化钾和含有适量氯仿的吸附剂。

然后，将装有土壤样品的量筒设置在容器的顶部，将密闭容器封闭并在室内温度下进行熏蒸。

熏蒸时间通常为24小时。

熏蒸结束后，取出含有氯仿的吸附剂，并将土壤样品离心以去除残余的溶液。

最后，用适量的蒸馏水冲洗残留在土壤样品中的溶解态氮，并测定冲洗液中溶解态氮的浓度。

最后，介绍氯仿熏蒸法的数据分析和结果解释。

首先，通过测定熏蒸前后土壤样品中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。

常用的计算公式为：其中，溶液体积为冲洗液的体积，土壤样品质量即为放置在量筒中土壤样品的质量。

通过计算，可以得出土壤微生物生物量的结果。

根据测定结果，我们能够了解土壤微生物的数量和活性程度。

较高的土壤微生物生物量通常表示土壤中的微生物丰富多样且活跃，土壤生态系统功能较好。

而较低的土壤微生物生物量则提示土壤中微生物数量和活性较低，土壤生态系统功能受到一定程度的抑制。

因此，通过氯仿熏蒸法测定土壤微生物生物量，可以为土壤环境修复和农田生产管理提供科学依据。

土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸氯仿熏蒸法是一种在实验室中用氯仿处理土壤样品，然后测定氯仿处理前后土壤微生物生物量差异的方法。

通过加入氯仿，能够杀死土壤中的微生物，从而减少微生物的数量，然后利用一些生物学或化学方法来测定残留的微生物生物量。

氯仿熏蒸法的步骤如下：1.准备土壤样品：将采集到的土壤样品经过干燥和破碎，使其能够尽可能均匀地参与后续的熏蒸过程。

2.加入氯仿溶液：将准备好的土壤样品分装到烧杯或烧瓶中，加入一定比例的氯仿溶液。

氯仿的浓度一般为10%～30%，取决于土壤类型和研究目的。

3.熏蒸土样：将装有土壤和氯仿溶液的容器密封，熏蒸一定的时间。

通常熏蒸时间为24～48小时。

4.蒸发氯仿：打开容器，在通风条件良好的环境中将氯仿挥发，一直蒸发到气味完全消失。

5.提取微生物细胞：将氯仿处理后的土壤样品用适当的提取剂提取，以从土壤中提取微生物细胞。

6.测定微生物生物量：使用适当的方法，如直接计数法、生物量焦磷酸法或基于生物标记物的测定法，来测定氯仿处理前后土壤样品中微生物生物量的差异。

氯仿熏蒸法的优点是操作简单、成本低廉，并且对土壤样品中的细菌、真菌和原生动物等各类微生物都具有较好的破壁效果，能够有效地杀灭土壤中的微生物。

同时，氯仿处理还可以去除土壤样品中的有机物质，从而减少后续测定中的干扰。

然而，氯仿熏蒸法也存在一些局限性。

首先，由于氯仿是一种有机溶剂，熏蒸过程中可能对土壤样品的结构和性质造成一定的改变。

其次，氯仿处理只能杀灭土壤中的微生物，对于土壤中的其他生物物种如线虫、螨虫等则不具备同样的杀灭效果。

此外，氯仿熏蒸法只能提供微生物生物量的总量信息，无法区分不同类群的微生物。

总结起来，氯仿熏蒸法是测定土壤微生物生物量的一种常用方法，其操作简便、费用低廉，且能够有效地杀灭土壤中的微生物。

但需要注意的是，在实际应用中要综合考虑其局限性，并根据研究目的选择合适的测定方法。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

方法:（1）土壤培养称取风干土（高砂土）9克于培养皿，加入1克煤灰（80目），混合均匀。

加入1ml新鲜土壤的浸提液作为接种菌液，再加入蒸馏水10ml，在28度恒温条件下7天。

(2)氯仿熏蒸将25ml无乙醇氯仿和培养的样品放入抽气皿，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5min，关紧活塞，关闭抽气机。

置于黑暗中24小时后取出氯仿，反复抽真空3～5次（每次5min）,排除氯仿。

同时做不熏蒸的处理（但同时进行暗培养）。

（3）浸提将上述经过氯仿熏蒸与未经过氯仿熏蒸的样品转移【注】到塑料瓶中，加入0.5mol/L K2SO4 Xml,在25度、200rpm 的水平恒温振荡机上振荡30min离心过滤，上TOC仪测定。

【注】为确定样液比，转移前称整个培养皿重(W1)，转移后再称重(W2)，二者之差再减去原来加入的样重（W3），即为转移时样品中的水分重量。

样液比＝W3/（W1-W2-W3+VK2SO4）样重W3＝煤灰重＋土重W1(g)W2(g)水分重量（g)VK2SO4(ml)W3(g) 样液比TOC结果（ppm)全＋熏蒸41.531.05 5.454050.1100128.2厌＋熏蒸54.0139.15 4.8640100.2229129.6好＋熏蒸45.1134.940.1735100.284332.9全47.7242.470.253550.14188.366厌52.2736.09 6.1835100.242820.56好42.3532.36-0.0135100.285831.34样品有机C含量(ppm)Ec(ppm)微生物碳Bc(ppm)全＋熏蒸1165.31106.42456.1厌＋熏蒸581.4496.71102.7好＋熏蒸115.7 6.113.4全59.0厌84.7好109.7。

土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

土壤微生物量N的测定一、实验原理氯仿熏蒸浸提法的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。

通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量氮二、试剂与仪器1. 试剂无乙醇氯仿、蒸馏水、0.15mol/L K2SO42.仪器可抽气干燥器、紫外可见分光光度计三、实验步骤1.取样在一片区域内，找五株植株分别取样，每株取三份土样，以20cm深为一个单位，分三次取样，取样深度为60cm，作为一份土样。

以此，取样45份。

2. 预培养常温下，保持水分通气培养10d。

预培养的目的是为了减少熏蒸后培养期间有机氮矿化的干扰,减少采样时土壤水分和温度的差异,使各土壤测定结果有可比性。

3. 土壤样品熏蒸每个土样各称取6.000g，12份分别置入25mL小瓶中,6份熏蒸,6份不熏蒸。

将欲熏蒸土样置于内径29cm可抽气的干燥器内隔板上,干燥器底部放置装有30mL无乙醇氯仿的100mL烧杯,并另外放置1个装有蒸馏水的小烧杯,使熏蒸时土壤含水量不变。

随之抽气,直到氯仿出现气泡沸腾后持续5min,停止抽气,紧接着密闭干燥器,并将其置于室温(与黑暗处。

24h后取出土样,在通气良好的地方放置2~3h,使残留土壤中的氯仿尽可能挥发。

不熏蒸的土样置于另一干燥器中,用蒸馏水代替氯仿,与用氯仿熏蒸一样处理,作为不熏蒸对照。

3. 熏蒸-280nm紫外比色法另取3份熏蒸和3份未熏蒸的土样,转入100mL三角瓶中,加50mL0.15mol/LK2SO4,振荡30 min后,过滤,立即在280nm 紫外光下测定吸光度。

熏蒸和未熏蒸作相同处理。

用单位土中的吸光度增量表示,即:v/g,烘干土=(abs熏/G熏)-(abs未/G未),其中:abs代表280nm紫外光下的吸光度,G代表称的土重相当的烘干土重。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h ），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK 2SO 4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC ），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC ）分析仪（Shimadzu Model TOC —500,JANPAN ）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL 3）；2）0.5mol/L 硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4溶于1L 蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L 硫酸钾溶液配制10ugC/L 、30ugC/L 、50ugC/L 、 70ugC/L 、100ugC/L 系列标准碳溶液。

（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g ，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO，干燥器底部加入少量2水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。