浅析影响ELISA实验结果因素

浅析ELISA测定错误结果的影响因素ELISA即酶联吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。

Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。

ELISA的基本原理是：①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。

ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。

血清是最常用的ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。

1、内源性物质有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。

常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig ( s )抗体、交叉反应物质和其它物质等。

（1）类风湿因子人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕捉抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。

影响ELISA试验因素叙述酶联免疫吸附试验（Enzyme—Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到快速的发展和广泛应用。

尽管早期的ELISA由于特异性不足高而阻碍了其在实际中应用的步调，但随着方法的不绝改进、料子的不绝更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便应用和标准化，从而使其成为广泛应用的检测方法之一、基本原理：ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会转变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。

此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。

滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，显现颜色反应。

因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。

此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

一、试剂的影响因素：应选用有国家批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。

试剂应妥当保管于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。

试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。

过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。

二、影响因素：酶联免疫（ELISA）是目前检验科常用的免疫学检测方法之一，其操作简单，无须特殊设备，使其在各级医院都有应用。

但是，假如忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性，因此，了解影响试验的因素，减少过错事故的发生是极其必需的。

ELISA检测的影响因素的分析【关键词】 ELISA检测；影响因素；分析ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。

Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为“enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)”。

由于ELISA方法灵敏，特异性强不需要特殊设备，所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定［1］。

如乙肝、丙肝抗体等等。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。

本文就ELISA检测的影响因素做如下讨论。

1 标本的影响1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性［2］。

所以严重溶血标本禁用。

1.2 标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。

1.3 标本保存不当在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。

1.4 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性最好使用真空采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。

1.5 标本凝固不全在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。

一、①一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30~60 min，各试剂在使用前充分混匀。

②酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。

二、操作不当导致1、加样多、操作持续时间长，尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异；2、除包被外，都宜采取45°加样，且要避免加到侧壁上；3、加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会对结果造成较大影响。

4、孵育时间过长，会导致非特异性反应增强；5、显色和终止加液时应避免气泡产生，以免影响检测读数；6、酶标板不宜叠放以减少受热不均，可采取水浴；7、贴密封膜，防止污物浸入和液体蒸发。

8、Elisa实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸馏水都可导致空白值或背景值升高。

三、检测样品处理不当引起溶血或污染1、血清或血浆标本分离不好或发生溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；2、待检标本污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；3、在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；4、标本凝固不完全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。

如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。

为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。

5、标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。

此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可，产生泡沫或样品的过度混合将引起血清蛋白的变性。

浅谈ELISA的影响因素ELISA即酶联免疫吸附试验,ELISA是一种敏感性高、重复性好的固相酶联免疫测定广泛用于各种抗原抗体的检测,但影响因素较多,有时易出现假阳性或假阴性,本文重点针对内源性、外源性因素对ELISA测定结果的影响进行探讨。

标签：酶联免疫吸附试验(ELISA);测定结果;影响因素如今病毒性疾病的诊断主要依赖对其抗原、抗体的检测。

而检测方法大多采用酶联免疫吸附试验(ELISA),如何保证实验结果的准确性,现结合自己的实际工作经验,总结了下列影响因素,希望对检验工作者有所帮助。

1内源性干扰因素1.1类风湿因子(RF)在类风湿患者、其他自身免疫性疾病及正常人的血清中,常含有较高或不同浓度的RF,RF一般为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。

用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可以充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。

1.2补体补体易激活C1q起到铰链作用,结果易出现假阳性。

1.3嗜异性抗体人类血清中含有天然的嗜异性抗体,将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,造成假阳性。

1.4自身抗体由于B细胞的超反应性,患者血清中常出现一些自身抗体,能与靶抗原结合形成复合物。

1.5溶菌酶可致假阳性。

2外源性干扰因素2.1标本溶血,分离不完全、加有血球。

2.2标本被细菌污染。

2.3标本储存时间过长。

2.4标本凝固不全。

2.5冰冻保存标本反复冻融。

2.6试剂在室温下平衡<30分钟,配洗液的水不符合要求。

2.7加样速度过快,加样时加在孔壁上或产生气泡。

2.8温育时关键因素之一,尽量选择温度低的,温育时间长的试剂盒。

2.9洗涤要彻底。

2.10双波长比色可减少容器上的划痕和指印等造成的光干扰。

2.11试剂质量的影响。

选用高质量的试剂是保证结果准确的关键因素之一。

3高值鉤状效应(HOOK效应)在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时出现钩状效应。

过量抗原分别和固相抗体和酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物”类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常规法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应,因为标准曲线到达高峰后钩状弯落。

影响ELISA试验结果操作的因素总结操作的影响因素酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一种特别的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上进展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果推断较为客观，是目前试验室检测抗原抗体*经济、*普遍的试验诊断方法。

影响ELISA试验结果操作的因素总结如下：1 、试剂的预备试剂的质量如抗原抗体的纯度及亲和力、标记物的比活性、滴度及特异性等直接影响检测结果，为保证检测质量，全部试剂必需经国家食品药品监督管理总局注册批准、批检测合格，临床评估特异性、敏感性、稳定性较高且在有效期内才有使用价值。

不同厂家试剂敏感性、特异性不尽相同，有报道不同厂家酶标板孔间 A 值差大小可达 15%，标记酶的活性及显色液的稳定性也相差较大，所以合理有效的试剂选择尤为重要，对 ELISA 试剂盒应正确选择，定期评价并建立科学的接收标准，结合常规血液筛查状况，对实际的均一性、适用性、稳定性，选出灵敏度、特异度及精密性合适的试剂保证检测结果的精确。

有报道不同厂家-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶结合物溶液对检测结果有区分，配制抗 HCV-cAg 酶结合物溶液前应检测小鼠-IgG 与产品的适配性。

其次试剂盒的储存方式、运输条件及有效期均为影响检测结果的重要因素，试剂盒一般2~8℃冰箱保存，留意不要紧贴冰箱储存室后壁以防止试剂冻结失效，可避开使用时试剂受温差影响导致酶标板上凝集小水珠及反应消失温差而影响抗原抗体的反应。

使用前需将试剂盒放置37℃恒温箱温育30min，且不同厂家、不同批号的试剂不能混合使用。

剩余试剂应准时放入干燥剂密封保存在2~8℃冰箱，试剂打开后一周内有效，同时留意做好室内质检，确保试验结果的牢靠性。

不同方法学的检验试剂会使乙肝两对半结果消失不同，如临床操作中电化学检测 HBsAg 呈阳性，而采纳 ELISA 检测则呈阴性，此外，使用单抗或多抗试剂对检测结果同样造成肯定的影响。

酶联免疫吸附试验的影响因素酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。

它的原理是通过特异性抗体与抗原结合，再利用酶标记的二抗介导的颜色反应，来定量分析和检测目标物质。

在进行ELISA实验时，有多个因素会对实验结果产生影响，下面将详细介绍其中的几个主要影响因素。

1.试剂的质量ELISA实验的试剂质量对实验结果至关重要。

这包括酶标记抗体和底物酶的纯度、活性，抗原或抗体的纯度和浓度，以及稀释缓冲液的组成和pH值等。

选择高质量的试剂可以提高实验结果的准确性和重复性。

2.样本处理和储存条件样本的处理和储存条件也会对ELISA结果产生影响。

样本的收集、保存和处理方法需要标准化，以确保稳定性和一致性。

如血液或组织样本的离心速度、温度和时间等要控制一致。

另外，样本的冻结和解冻过程也需要避免反复，以防止损坏细胞结构和影响实验结果。

3.特异性抗体的选择ELISA实验需要选择特异性抗体与目标抗原结合。

抗体的选择要考虑其亲和力、特异性和纯度等特性。

如果抗体不够特异性，可能会导致非特异性结合和假阳性结果。

因此，在实验中选择合适的抗体对实验结果至关重要。

4.孵育条件和时间孵育条件和时间对ELISA实验结果也起着重要影响。

这包括孵育温度、时间和摇床的震荡速度等。

不同的试剂和实验需要不同的孵育条件。

孵育温度过高或过低，孵育时间太长或太短，都可能导致结果的偏差。

5.光度计的精度和校准ELISA测量实验结果时需要使用光度计，光度计的精度和校准对结果的准确性和可重复性至关重要。

定期检查和校准光度计以确保其准确性，并遵循使用指南来保持恒定的测量条件。

6.数据分析和计算ELISA实验得到的数据需要进行合理的分析和计算。

如对标准曲线进行拟合和计算待测样品的浓度等。

合理的统计分析和数据处理能够提高实验结果的可靠性。

论影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法[论文关键词] 酶联免疫吸附试验；影响因素；控制方法论文摘要：酶联免疫吸附试验(enayme liked immunosorbent assay，ELISA)是20世纪70年代发展起来的一种检测技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，被广泛应用于各种抗原和抗体的测定，为辅助临床诊断与生物科研起到了积极的推动作用。

但ELISA测定中影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。

现笔者对影响实验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨如下：1 试剂的因素1.1 试剂的选择试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。

虽然国家采用批批检定的形式对ELISA 试剂严格把关，但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在在差异。

要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。

更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。

1.2 试剂的准备在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。

因此，在ELISA 测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。

2 样本的因素2.1 内源性干扰因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等[1]。

2.1.1 类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF)，其一般为IgM 型，亦有IgG和IgA型，具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG 以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。

酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定蛋白质或抗原的浓度。

然而，在进行ELISA实验时，存在许多可能影响实验结果的因素。

本文将介绍一些常见的影响因素及如何处理这些问题。

1.样品质量：样品质量是影响ELISA实验结果的一个重要因素。

如果样品质量不合格，可能会导致错误的实验结果。

处理方法包括：-选择合适的样品储存条件，避免样品的变性、降解等问题。

-对样品进行适当的纯化和浓缩处理，以提高样品的纯度和浓度。

2.抗体选择：在ELISA实验中，正确选择适合的抗体也是非常重要的。

处理方法包括：-确保抗体的特异性和亲和力，避免与其他非特定蛋白结合。

-对抗体进行亲和纯化，以提高抗体的纯度和活性。

3.反应条件：ELISA实验中的反应条件包括温度、时间、pH等，这些条件的选择直接影响到实验结果的准确性。

处理方法包括：-对反应条件进行优化，确定最佳的温度、时间、pH等参数。

-控制反应时间，避免反应过长或过短而引起实验结果的偏差。

4.检测方法：ELISA实验中常用的检测方法有酶标记物检测、放射性同位素检测、荧光检测等。

不同的检测方法对实验结果的影响也不同。

处理方法包括：-选择合适的检测方法，根据实验的目的和需要进行选择。

-对检测方法进行优化和标准化，以提高检测的准确性和灵敏性。

5.交叉反应：ELISA实验中，样品中的其他成分可能会引起交叉反应，导致实验结果的误差。

处理方法包括：-使用对特定抗原具有高度特异性的抗体，避免与其他非特定抗原结合。

-对样品进行适当的稀释，以减少交叉反应的可能性。

6.数据分析：ELISA实验的数据分析是实验结果的重要环节。

处理方法包括：-使用适当的统计方法对实验数据进行分析，确定浓度或活性的可靠性。

-进行实验重复和平行实验，以确保实验结果的可重复性和准确性。

１８６ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｊｕｎ．２００８，Ｖ０１．１５，Ｎｏ．３・检测技巧・ＥＬＩＳＡ测定中影响因素简析李卫杨（株洲市第一医院，湖南株洲４１２０００）ＥＬＩＳＡ方法被广泛用于各种抗原和抗体测定。

但ＥＬＩＳＡ测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中如果处理不当，会出现一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。

引起ＥＬＩＳＡ测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②操作因素；③试剂因素。

本文主要就标本因素和操作因素对ＥＬＩＳＡ测定的影响做如下讨论。

１标本因素血清是最常用的ＥＬＩＳＡ标本，血浆一般可视为与血清同等的标本。

标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性干扰物质和外源性干扰物质两种。

１．１内源性干扰物质有人认为大约４０％的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。

常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体、交叉反应物质和其它物质等。

１．１．１类风湿因子人血清中ＩｇＭ、ＩｇＧ型类风湿因子（ＲＦ）可以与ＥＬＩＳＡ系统中的捕获抗体及酶标记二抗的ＦＣ段直接结合，从而导致假阳性。

解决该情况的办法是：①用Ｆ（ａｂ）２替代完整的ＩｇＧ；②标本用偶联有热变性（６３℃，１０ｍｉｎ）ＩｇＧ的固相吸附剂处理（将热变性ＩｇＧ加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可用２一巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使ＲＦ降解。

１．１．２补体它能够与固相一抗，标记二抗Ｆｅ结合或影响它们的结合而造成假阳性。

解决的办法是：①用ＥＤＴＡ稀释标本；②用５６℃，３０ｍｉｎ加收稿日期：２００７—１１—１５；修回日期：２００７－１２－２０热血清使Ｃｌｑ灭活［１］。

１．１．３嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ｉｇ（ｓ）结合的天然嗜异性抗体，可将ＥＬＩＳＡ系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。

浅谈影响ELISA结果因素分析ELISA法即酶联免疫吸附测定法，该方法的检测原理主要是通过待测物和酶连接，使得抗原与抗体发生特异反应，通过观察底物和酶颜色的变化得出检测结果，ELISA法根据种类和变化能够分成双抗体夹心法、间接法、竞争法以及捕获法，其中双抗体夹心法主要用于抗原的检测，间接法主要用于抗体的检测，竞争法可用于抗原与抗体的检测，捕获法则用于测定血清中某种抗体亚型的成分[1]。

酶联免疫吸附测定法具有灵敏性高以及特异性高的特点，在临床上应用十分广泛，发挥出十分积极的临床价值，然而存在诸多因素诸如试剂、标本、操作方法以及环境等方面会影响检测结果的准确性，本文主要对影响ELISA结果因素进行分析，并给出针对性的解决措施，具体信息如下。

1 试剂方面的因素ELISA法的检测结果直接受到试剂质量优劣的影响，试剂盒的生产厂家和质量、标记物的免疫活性、抗原抗体的纯度、试剂是否有效与试剂的储存方式等方面均会对ELISA法的检测结果有程度不一的影响[2]。

为避免上述情况影响检测结果的准确性，①在检测过程中需要确保ELISA 试剂盒中阴性对照的质量，从而避免假阴性与假阳性的出现；②抗原的中和必须准确滴定，防止由于抗原浓度过低或者过高影响试剂盒的敏感性而导致假阴现象的发生；③重视试剂的质量，给予完善的室内质控与定期开展室间质量评估；④根据试剂盒的开封时间与保存的状况来实施全点定标，进而保障检测结果的准确性；⑤有研究显示ELISA法的检测结果不准确很大程度上是受到试剂质量的影响，因此生产厂家必须重视试剂的质量，有必要时可通过人新鲜标本方法学来评估试剂的质量。

2 标本方面的因素实验标本对ELISA法的检测结果也具有很大的影响[3]，主要包括内源性与外源性物质干扰。

内源性物质干扰主要包括药物、嗜异性抗体、人抗动物抗体、代谢产物、类风湿因子以及补体等，然而在ELISA法的检测过程中可通过下述方法处理标本来降低内源性物质干扰：①通过将抗原结合片段取代免疫球蛋白（IgG），将结晶片段（即Fc片段）消除，这样能够很大程度降低类风湿因子、嗜异性抗体以及人抗动物抗体对检测结果的干扰；②通过热处理的手段（56℃处理30min，63℃处理10min）与应用乙二胺四乙酸（EDTA）对标本进行稀释与2一巯基乙醇对标本进行稀释，以降低补体与类风湿因子对检测结果的干扰；③在标本中添加阻断剂如10％正常人血清和1％正常动物血清；④若检查发现标本中存在血红蛋白、胆红素以及血脂等成分时，必须重新采血检查[4]。

ELISA实验的影响因素及问题分析摘要：ELISA 实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA 的高灵敏，强特异的优点。

因此，应建立实验项目的标准操作程序（SOP）。

关键词：ELISA；实验；影响因素；问题分析1971 年Engvall 等人把免疫组化的EIA 技术应用于临床检验发展为ELISA 技术。

其特点为灵敏度和特异性相对较高，现广泛应用于乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等的检测，现就我多年的实验经验，浅谈整个ELISA实验过程中的影响因素及问题分析。

实验前检验人员需知首先检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：1、检验项目的基本原理（ELISA 原理）及临床意义2、熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；3、熟悉检测试剂性能（包括试剂的灵敏度，特异性，精密度，稳定性，安全性等）；4、熟悉检测仪器的原理及性能；为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。

酶标仪应经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。

5、某些特殊项目的检测如抗HIV 等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。

标本的采集和保存1、可用作ELISA 的标本十分广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成份，一般使用血清。

2、标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，可造成假阳性；长菌的标本同样的道理易产生假阳性。

3、抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂的抗凝血。

4、标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。

一般血清置4℃冰箱应5天内完成测试。

影响ELISA实验效果常见分析一个在医学上很有参考价值的文章ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。

我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。

在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。

现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。

操作步骤可能原因解决办法选择试剂选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。

加样1.血清或血浆标本分离不好即进行加样；2.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；3.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。

1.标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。

一个在医学上很有参考价值的文章2.加样后及时放入孵箱。

3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

4.如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。

5.标本较多时，请分批操作。

孵育 1.孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。

1.贴封片或加盖；2.按说明步骤严格控制操作时间。

洗板1.采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。

2.采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。

影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。

但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。

因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。

1实验室操作人员的基本素质因素实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。

因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。

如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。

其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。

还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。

有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。

所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。

2标本处理因素实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。

提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。

从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。

3操作过程的影响因素3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。

3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。

加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。

3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。

不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。

3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。