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酶联免疫吸附法检测梅毒抗体假阳性产生的原因梅毒是苍白螺旋体引起的危害人类健康较为严重的一种性传播性疾病之一，近年来在我国的发病率呈逐年上升的趋势，对梅毒作出快速、准确的诊断是非常重要的。
目前临床上梅毒的诊断主要是根据临床症状和血清学检查，酶联免疫吸附法(ELISA)对IgG、IgM都有很好的检测能力［1］，因其灵敏度高、价格低廉、操作方便、结果客观在国内广泛使用。
但在工作中遇到的最大问题是出现假阳性的问题，而大多数是由于弱阳性反应引起的，这给医疗工作带来麻烦，甚至引起医疗纠纷。
为避免假阳性结果的出现，现将产生假阳性的原因作以总结，供同仁参考。
1 机体的内在因素1.1 年龄因素有些老年人梅毒检测结果阳性，而无临床症状，也无发病史和疾病接触史［2］。
ELISA试剂盒主要是选自梅毒螺旋体外膜的脂蛋白47 KD、17 KD、15 KD为分子抗原，用基因重组表达和BOC 氨基固相法得到多肽抗原，为使小分子多肽有较好的吸附性，再用人血清白蛋白与之连接，而且合成后的多肽一般不做提纯，直接作为试剂抗原使用。
由于抗原不纯和使用了人血清白蛋白，增加了意外假阳性抗原位点的可能。
老年人容易出现免疫功能的异常，易产生一些针对连接用的白蛋白的抗体或一些异常蛋白质而干扰了检测的结果出现假阳性。
1.2 疾病因素有些疾病如其他螺旋体感染、淋巴肉瘤、糖尿病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、丙型肝炎、肝硬化、海洛因成瘾、妊娠等可使患者体内含有治疗性抗体、嗜异性抗体、自身抗体、类风湿因子、甲胎蛋白等。
这些特殊成分在反应过程中有一定的吸附作用，产生假的显色反应而出现假阳性。
2 标本因素2.1 标本处理不完全血液抽取后未完全凝固即离心分离血清，纤维蛋白未完全析出，容易在板孔中形成纤维蛋白薄膜或絮状物，造成洗板时清洗不干净，酶残留在相应的板孔中，使吸光度值偏高，造成假的阳性结果。
2.2 标本溶血标本溶血时细胞内液的各种活性酶及具有酶样活性的物质可与底物非特异性结合；Hb具有类过氧化物酶的活性，其效应与辣根过氧化物酶类似，溶血后反应孔非特异性吸附Hb，洗涤时不易洗去，催化底物产生一定程度的显色，使本底吸光度值升高而造成假阳性［3］。
ELISA实验中的假阳与假阴分析医学实验中，ELISA是一种常用的特异性强、灵敏度高、操作简便的检测方法。
然而在实际应用中，ELISA操作的各方面均会对结果产生影响，优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件，另外一些非主观因素会对结果造成较大偏差。
ELISA假阳性与假阴性的原因与解决办法：1.假阳性：假阳性的出现通常是样本中掺杂有同源或同工物质，例如类风湿因子、补体、交叉反应物质和其它物质等。
A.原因：溶血会使样本中具有弱过氧化物酶活性的亚铁血红素催化底物四甲基联苯胺（TMB）显色，产生假阳性结果。
解决办法：在处理ELISA最常检查的血清样本时，注意凝集过程、离心过程等细节，避免出现溶血和掺杂血细胞；B.原因：类风湿因子（一种能结合多种动物IgG Fc的自身IgM抗体）可与酶标二抗Fc结合造成假阳性。
解决办法：在检测抗原时可加入2-巯基乙醇使其降解，或用热变性IgG（63℃，10 min）进行封闭处理，另外，使用F(ab)2替代完整的IgG也可达到目的。
一些其他的嗜靶抗原自身抗体，如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素球蛋白等在检测时，可能与靶抗原结合形成复合物，干扰测定结果，所以在测定前需用理化方法将其解离后再测定；C.原因：补体一方面会使一抗和酶标二抗分子发生变构暴露出Fc段C1q分子结合位点，从而将二者连接起来造成假阳性。
另一方面也可能会结合固相抗体从而封闭其与抗原的结合表位而造成假阴性。
解决办法：对细胞培养用血清、动物血清样本进行56 ℃，30 min的补体灭活，另外，通过用EDTA稀释样本也可降低这种作用；D.原因：类地高辛、类AFP等物质能与抗原产生交叉反应。
尤其在使用单抗测定抗原时，如果正好交叉反应的抗原决定簇是单抗结合位点时，会出现假阳性结果；E.原因：样本中因实验处理或污染含有某些细菌，如表皮球菌，菌体释放的内源性HRP可能会对检测结果造成假阳性；F.原因：血液标本未完全抗凝即开始离心，析出的纤维蛋白易在孔板中形成白色薄膜或者絮状物，若清洗不干净，残余在孔板中极易使吸光度值偏高，造成假阳性；G：原因：血液标本保存过久易滋生细菌，影响检测结果，时间过长的标本，血清标本IgG聚集成多聚体，AFP形成二聚体，造成假阳性；H.原因：试验温度过高或过低都有可能引起血清蛋白异常，造成假阳性。
ELISA实验操作中常见问题分析严峻溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时刻快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不完全、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。
2、试剂的阻碍a.分子量大。
合成肽采纳化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
d.纯化难度大。
基因工程抗原的纯化技术难度较大。
合成多肽抗原是按照蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
合成肽抗原有以下特点：a.分子量太小；b.一样只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳固性差。
国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏锐性分别为89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。
有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳固比较差。
使用质劣的试剂必定导致结果的假阳性或假阴性。
因此。
选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。
•选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳固性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的要紧依据。
•要注意试剂的批号和出厂日期，尽管试剂的有效期多为1年。
最好选择刚出厂的试剂使用。
不同厂家的试剂不能混用。
不同方法学的检测试剂，会使两对半结果显现一些不同。
例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。
浅谈ELISA的影响因素ELISA即酶联免疫吸附试验,ELISA是一种敏感性高、重复性好的固相酶联免疫测定广泛用于各种抗原抗体的检测,但影响因素较多,有时易出现假阳性或假阴性,本文重点针对内源性、外源性因素对ELISA测定结果的影响进行探讨。
标签：酶联免疫吸附试验(ELISA);测定结果;影响因素如今病毒性疾病的诊断主要依赖对其抗原、抗体的检测。
而检测方法大多采用酶联免疫吸附试验(ELISA),如何保证实验结果的准确性,现结合自己的实际工作经验,总结了下列影响因素,希望对检验工作者有所帮助。
1内源性干扰因素1.1类风湿因子(RF)在类风湿患者、其他自身免疫性疾病及正常人的血清中,常含有较高或不同浓度的RF,RF一般为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可以充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。
1.2补体补体易激活C1q起到铰链作用,结果易出现假阳性。
1.3嗜异性抗体人类血清中含有天然的嗜异性抗体,将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,造成假阳性。
1.4自身抗体由于B细胞的超反应性,患者血清中常出现一些自身抗体,能与靶抗原结合形成复合物。
1.5溶菌酶可致假阳性。
2外源性干扰因素2.1标本溶血,分离不完全、加有血球。
2.2标本被细菌污染。
2.3标本储存时间过长。
2.4标本凝固不全。
2.5冰冻保存标本反复冻融。
2.6试剂在室温下平衡<30分钟,配洗液的水不符合要求。
2.7加样速度过快,加样时加在孔壁上或产生气泡。
2.8温育时关键因素之一,尽量选择温度低的,温育时间长的试剂盒。
2.9洗涤要彻底。
2.10双波长比色可减少容器上的划痕和指印等造成的光干扰。
2.11试剂质量的影响。
选用高质量的试剂是保证结果准确的关键因素之一。
3高值鉤状效应(HOOK效应)在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时出现钩状效应。
过量抗原分别和固相抗体和酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物”类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常规法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应,因为标准曲线到达高峰后钩状弯落。
ELISA实验假阴性假阳性的原因分析ELISA 即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。
引起 ELISA 测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。
标本因素血清是最常用的 ELISA 标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。
一、内源性物质有人认为大约 40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。
常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s) 抗体、交叉反应物质和其它物质等。
1、类风湿因子人血清中 IgM、IgG 型类风湿因子（RF）可以与 ELISA 系统中的捕获抗体及酶标记二抗的 FC 段直接结合，从而导致假阳性。
2、补体ELISA 系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其 FC 段的补体 C1q 分子结合位点被暴露出来，使 C1q可以将二者连接起来，从而造成假阳性。
3、嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体，可将 ELISA系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。
4、嗜靶抗原的自身抗体抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在 ELISA 方法中均可干扰抗原抗体测定结果。
5、医源性诱导的抗鼠 Ig (s) 抗体临床开展的用鼠源性 CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠 Ig (s) 抗体。
这些病人 ELISA测定时均可产生假阳性。
6、交叉反应物质类地高辛、类 AFP 样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。
在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。
ELISA检测HBsAg假阳性和假阴性的原因分析ELISA法假阴性原因1、标本用肝素或EDTA等抗凝处理易造成HBsAg检测结果假阴性，肝素抗凝血浆会增加OD值,可能与高浓度肝素具有强大的负电荷,能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中的辣根过氧化物酶活性，造成假阴性。
2、标本保存不当,在冰箱内保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体。
标本放置时间延长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，便出现假阴性。
因此若采血后不能及时检测，5天内检测标本分离血清置于4℃冰箱内；超过5天不能检测的，应放在-20℃低温冰箱中。
3、低浓度HBsAg标本（弱阳性HBsAg）易受加样时间（特别是大批量标本）、试剂平衡时间、溶血程度的影响，出现假阴性。
如加样时间在30分钟内的差异是最大的。
4、高浓度HBsAg在ELISA一步法检测中易出现假阴性，即HBsAg的钩状效应。
从原理来讲，一步法中HBsAg与包被板上的HBsAb及酶结合的HBsAb结合是双向的，当HBsAg浓度过高时，HBsAg与包被板上的抗体及酶结合物中的抗体均是单向结合，不能形成抗体－抗原－抗体酶复合物，使酶标记抗体在随后的洗板中洗掉，从而显出阴性结果。
但是在ELISA两步法中，高浓度的HBsAg只能与包被的HBsAb“饱和”地结合，多余部分被洗掉，随后加入的酶结合的HBsAb正好通过HBsAg的“桥梁”作用而结合在酶标板上，显示阳性结果。
因此当HBsAg强浓度时用ELISA一步法检测存在假阴性现象。
解决此问题的最好办法有：对标本进行稀释；不单检测HBsAg；采用ELISA两步法检测可消除漏检现象。
5、由于慢性病毒携带者(低水平HBsAg携带者)或HBV感染的潜伏期,HBsAg浓度低于检测水平的下限，由此造成假阴性。
6、S基因突变导致HBsAg的氨基酸结构改变，由于多数商用试剂盒检测系统采用的为多克隆抗体检测HBsAg的a决定簇，这一区域的点突变即可导致临界观测值或阴性结果，造成假阴性。
ELISA检测弱阳性结果原因分析ELISA检测时常出现的弱阳性结果是每个免疫实验室经常遇到的问题,笔者将从以下五个方面进行阐述。
1常见问题①同一实验室重复结果不一致;②不同实验室结果不一致;③同一实验室不同方法间(如手工与仪器)结果不一致;④准确性问题。
2原因分析2.1不同方法间以及不同实验室结果不一致:①不同方法灵敏度、特异性差异;②不同实验室使用的试剂差异;③判断标准(CUTOFF)不同;④室间质量评价的作用。
2.2ELISA检测主要影响因素:①标本的质量;②加酶结合物前放置不同时间对竞争法的影响;③不同方法对检测结果的影响;④温育;⑤洗板;⑥CUTOFF值。
2.3可能导致假阳性结果的标本因素内源性干扰因素:如类风湿因子、补体、嗜异性抗体、溶菌酶;②外源性干扰因素:如溶血、细菌污染、标本保存时间过长、凝固不全。
2.4结果不一致另外的主要原因:“张冠李戴”。
2.5实验室操作时差的影响。
3解决方法3.1标本的处理①做好三查三对,保证标本正确;②“张冠李戴”解决办法:制定规则、质量监督、严格复查、人员固定、适当的工作强度;③离心3000r/min离心10min;④非抗凝血;⑤保证血清清亮、无混浊。
3.2干扰因素的排除①补体干扰的排除:56°加热30min;②类风湿因子的排除:稀释标本,改变酶标抗体;③孵育时间温度一致:37℃水浴箱中温育,每天监测水温、水浴箱中水量,确保水要浸至板条的1/3,均匀孵育,避免边缘效应(见表1)4结果的解释与报告4.1弱阳性结果的报告①保存实验记录;②保存标本一周;③根据比较选择CUTOFF值;④使用室内质控;⑤建立SOP杜绝违规操作。
4.2临界结果的处理对策①建立进一步检测的程序;②标本的重复检测;③第二份标本的检测(另取标本);④数周或数月后采取标本检测;⑤可能的话,用另一个更敏感特异的方法检测;⑥检测标准化。
4.3结果的报告①认真阅读试剂盒说明书,按其要求报告结果;②如出现临界结果,应明确进行复查,确定是否需对患者进一步追踪观察;③清楚结果对特定疾病诊断意义(如梅毒抗体),如需进一步检测应在报告中说明。
影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。
但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。
因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。
1实验室操作人员的基本素质因素实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。
因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。
如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。
其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。
还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。
有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。
所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。
2标本处理因素实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。
提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。
从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。
3操作过程的影响因素3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。
3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。
加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。
3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。
不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。
3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。
ELISA实验中本底及假阳性产生的原因分析？1. 基因工程抗原与合成肽抗原的区别1.1 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。
该类抗原与合成肽相比具有以下特点：a.分子量大。
合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
b.稳定性好。
包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。
d.纯化难度大。
基因工程抗原的纯化技术难度较大。
1.2 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
合成肽抗原有以下特点：a.分子量太小b.一般只含有一个抗原决定簇c.纯度高d.稳定性差由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性，ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。
就HCV ELISA 试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。
第三代试剂的敏感度大大提高了。
由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。
值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学得对待反应结果。
2．假阳性本底产生的原因2. 1 抗原因素2.1. 1 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。
以丙肝诊断试剂盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。
2.1.2 错误排序的影响。
合成肽在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特异性改变而产生假阳性。
另外，在构建基因工程表达载体时引入的HCV 核苷酸发生相位改变或点突变也会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不断进步，由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。
2.2. 3 抗原纯度对特异性的影响。
以HCV 抗原为例，利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞、盐析、粒子交换柱等分离纯化步骤才能最后的到一定纯度的HCV 抗原。
目前的工艺还不能做到抗原纯度为100％，因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。
2.2 人血清中的正常IgG人血清中IgG 的浓度对HCV 试剂盒有较大的影响。
HCV 试剂盒采用的间接法，酶标抗抗体能与人所有IgG 结合，而IgG 吸附于板孔的能力很强，因此我们采用100 微升样稀加10 微升血清来将其稀释以降低本底。
到成人时，据统计学调查，成人的IgG 为12mg/ml，而有些人的IgG 浓度会远远高于此，这部分人的血清经ELISA 反应后往往会显色。
2.3 人血情中异常的IgG结缔组织病（系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤等）等病症时，血清中的风湿小体和其它异常IgG （IgG 浓度达到50mg/ml）会引起本底升高或假阳性。
2.4 溶血的影响当溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，当其通过吸附或“PP 效应”（蛋白质间相互吸附的现象）结合后，可催化A、B 液显色而造成假阳性。
2.5 操作不当引起任何操作不当都会影响结果，因此在操作过程中保证操作的规范，严格按照说明书进行是得到准确结果的关键和基础。
2.5.1 加样2.5.1.1 样品稀释液少加，或血清多加，都会引起本底增高。
对于间接法来说，受上述两个因素影响更大。
因为血清中受检的特异性IgG 只占总IgG 中的一小部分。
IgG 的吸附性很强，非特异IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。
这些非特异的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。
如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，必将带来阴性高值。
2.5.1.2 酶结合物的不正确加入。
一般来讲，酶也有一定的非特异吸附，将包被好的酶联板再封闭，一方面也可避免酶的非特异性吸附。
通常每孔加入的封闭液为120μl。
如果加入的酶多于120μl 或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。
2.5.2 温育5.2.1 由于试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点，升高反应的温度，会加快反应，同样增加时间会延长反应，这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度多，也会引起阴性高值或假阳性。
5.2.2 由于试剂盒通常设定的反应温度为37 度，在这个温度下放置30 分钟，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断增加，这样必会导致反应最后的值升高。
因此温育时应盖上胶贴。
5.2.3 试剂盒在设计时，反应是在静置条件下完成的，如果反应改变为振动条件，会加快分子的热运动，增加反应的机会。
5.2.4 试剂盒的温育过程是在培养箱中进行，这和水浴的条件不一样。
水浴可是酶联板迅速升温，但较难将温度控制在较稳定的温度，往往高于37 度，同样会引起高值阴性。
2.5.3.洗板2.5.3.1 各个厂家使用的洗液配方是不同的，是根据各自试剂的条件配制的，采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果，包括本底过高。
本公司的洗液采用独特的洗涤系统不能和其它公司的试剂盒混用。
2.5.3.2 试剂盒中提供的洗液是浓缩的，应该稀释到规定的倍数使用，过多稀释洗液，会影响洗液的效果，而使反应的本底过高。
2.5.3.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水，电导率小于1.2μs。
如果水中含有过多的Ca2+、Mg2+，这些离子会占用表面活性剂，影响洗涤效果。
2.5.3.4 洗板时，应每孔加满洗液，如果加入的洗液液量不够，对洗涤的效果影响也是很大的。
本公司的酶联板板孔为400μl，比别的厂家的板孔大，因此洗了别公司的板后要及时调整液量，以避免加液量不满。
2.5.3.5 洗板的次数不够孔内多余的抗原（抗体）或酶结合物不能彻底去除，也会因此本底升高。
2.5.3.6 洗板的强度和洗板的浸泡时间是密切相关的。
洗板机不同，使用的泵不同，液体加入时的冲力不同。
如果加入洗液的冲力不大，也没有设定浸泡时间，同样会使结果的A 值偏高。
2.5.3.7 洗板完毕后，要进行拍板，尽量采用质量好的毛巾和吸水纸，使用易掉渣的纸，纸屑会留在板孔中，由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。
2.5.4 显色。
加A、B 液准确，顺序不能颠倒，要及时终止显色。
终止后要在3 分钟内读数，否则强阳性会变低。
2.5.5.枪头、加样槽或其它来源的污染如果使用的枪头、加样槽是反复使用的，必须肯定其没有来自酶或阳性的污染。
酶作为反应的催化剂，及其微量也会很明显影响反应。
反复使用的枪头、加样槽清洗不当，也会干扰反应。
如将枪头使用84 消毒液浸泡而没有冲洗干净，因为84 是强氧化剂，加入AB 液后就会显色。
同样枪头和加样槽不正确清洗，改变加入试剂的PH 值，反应的结果也会不正常。
常常有人用手纸将加样槽擦干，但是如果使用的手纸容易掉渣，会将纸上的强氧化剂留在槽中而影响反应。
2.5.6.测A 值时，微孔条底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面都可能引起A 值的升高。
酶联免疫吸附试验；影响因素；控制方法论文摘要：酶联免疫吸附试验(enayme liked immunosorbent assay，ELISA)是20世纪70年代发展起来的一种检测技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，被广泛应用于各种抗原和抗体的测定，为辅助临床诊断与生物科研起到了积极的推动作用。
但ELISA测定中影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。
现笔者对影响实验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨1 试剂的因素1.1 试剂的选择试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。
虽然国家采用批批检定的形式对ELISA 试剂严格把关，但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在在差异。
要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。
更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。
1.2 试剂的准备在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。
因此，在ELISA 测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。
2 样本的因素2.1 内源性干扰因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等[1]。
1.1 类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF)，其一般为IgM 型，亦有IgG和IgA型，具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在E LISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG 以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。
避免其发生的方法有：①用F(ab)2替代完整的IgG。
②标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理。
③检测抗原时，可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF 降解。
1.2 补体在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。
一方面，固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构，使Fc段的补体C1q结合点暴露出来，使C1q成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果。
另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。
解决的办法是：①用EDTA稀释标本。
②56℃30 min 加热血清使C1q灭活[1，2]。
2.2 外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。
2.1 标本的溶血血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA 测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP 底物反应显色。
所以在采血时应注意手法，采集的血液勿用力振荡，严防标本溶血。
