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酶联免疫吸附法步骤（大纲）一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述1.1ELISA的定义及原理1.2ELISA的分类及应用二、实验准备2.1试剂与材料准备2.1.1主要试剂2.1.2主要材料2.2仪器设备准备2.2.1温度与湿度控制设备2.2.2混合与振荡设备2.2.3其他仪器设备三、实验步骤3.1微孔板的包被3.1.1包被抗原/抗体3.1.2包被后处理3.2封闭3.2.1封闭液的选择3.2.2封闭处理3.3样本及标准品的加入3.3.1样本稀释3.3.2加入标准品与样本3.4抗原/抗体结合3.4.1结合时间与条件3.4.2洗涤3.5酶标二抗的加入3.5.1酶标二抗的稀释3.5.2酶标二抗的结合3.6洗涤3.6.1洗涤次数与条件3.6.2洗涤液的选择3.7显色反应3.7.1底物的选择3.7.2显色条件3.8终止反应3.8.1终止液的选择3.8.2终止反应操作四、结果与分析4.1光密度值（OD值）测定4.2标准曲线的制作4.3结果计算与判断五、实验注意事项及质量控制5.1实验操作注意事项5.2质量控制措施5.2.1试剂质量控制5.2.2设备与操作规范5.2.3数据处理与分析六、实验结果的临床应用与意义6.1ELISA在临床检测中的应用6.2ELISA结果的临床意义及局限性6.3检测结果与临床诊断的关联分析一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述酶联免疫吸附法（ELISA），是一种常用于检测和分析生物样本中蛋白质、多肽、抗体等生物大分子的分析技术。
ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。
IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。
在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。
因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。
这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。
目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。
具体操作步骤如下：1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。
3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。
4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。
5．加入酶底物，温育显色测定本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。
RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。
ELISA法检测HIV抗体影响因素分析作者：李志明来源：《中外医疗》 2011年第5期李志明(滨州市中心血站山东滨州 256600)【摘要】目的探讨ELISA法在检测HIV抗体中的影响因素,提高实验结果准确性。
方法从试剂的准备、样品的采集和储存以及仪器和操作等方面分析每一环节的质量控制对检验结果的准确性所起到的影响。
结果做好试剂的选择和准备,规范操作,做好每一环节的质量控制,在ELISA法检测HIV抗体中非常重要。
结论选择灵敏度高、特异性好的试剂,严格按照试剂说明书要求,注意操作中的诸多影响因素,能有效保证检测结果的准确性。
【关键词】 ELISA法 HIV抗体影响因素【中图分类号】 R187 【文献标识码】 A 【文章编号】 1674-0742(2011)02(b)-0191-02随着艾滋病流行形势的日趋严峻,新发现的感染者数量不断增加,艾滋病检测也显得越来越重要。
目前国内艾滋病初筛试验室检测HIV抗体的方法主要是酶联免疫法(ELISA)。
ELISA法是敏感性高、特异性强、重复性好的试验诊断方法,其试剂具有稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素,既适用于大规模筛查试验,又可以使用于少量标本的检测等优点。
但ELISA法的实验过程中有很多影响因素,如何消除诸多影响因素,保证检测结果的准确性,笔者在实际工作中经长期观察总结,对ELISA法检测HIV抗体影响因素分析如下。
1 试剂的准备《全国艾滋病检测技术规范》(2009版)规定,HIV抗体检测试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准,在有效期内的试剂,其中酶联免疫试剂应批批检合格,推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。
ELISA多为单纯HIV抗体检测试剂,HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。
HIV抗原或抗体被包于固相载体,加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体,加底物显色,用酶标仪测定结果。
ELISA实验中的假阳与假阴分析医学实验中，ELISA是一种常用的特异性强、灵敏度高、操作简便的检测方法。
然而在实际应用中，ELISA操作的各方面均会对结果产生影响，优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件，另外一些非主观因素会对结果造成较大偏差。
ELISA假阳性与假阴性的原因与解决办法：1.假阳性：假阳性的出现通常是样本中掺杂有同源或同工物质，例如类风湿因子、补体、交叉反应物质和其它物质等。
A.原因：溶血会使样本中具有弱过氧化物酶活性的亚铁血红素催化底物四甲基联苯胺（TMB）显色，产生假阳性结果。
解决办法：在处理ELISA最常检查的血清样本时，注意凝集过程、离心过程等细节，避免出现溶血和掺杂血细胞；B.原因：类风湿因子（一种能结合多种动物IgG Fc的自身IgM抗体）可与酶标二抗Fc结合造成假阳性。
解决办法：在检测抗原时可加入2-巯基乙醇使其降解，或用热变性IgG（63℃，10 min）进行封闭处理，另外，使用F(ab)2替代完整的IgG也可达到目的。
一些其他的嗜靶抗原自身抗体，如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素球蛋白等在检测时，可能与靶抗原结合形成复合物，干扰测定结果，所以在测定前需用理化方法将其解离后再测定；C.原因：补体一方面会使一抗和酶标二抗分子发生变构暴露出Fc段C1q分子结合位点，从而将二者连接起来造成假阳性。
另一方面也可能会结合固相抗体从而封闭其与抗原的结合表位而造成假阴性。
解决办法：对细胞培养用血清、动物血清样本进行56 ℃，30 min的补体灭活，另外，通过用EDTA稀释样本也可降低这种作用；D.原因：类地高辛、类AFP等物质能与抗原产生交叉反应。
尤其在使用单抗测定抗原时，如果正好交叉反应的抗原决定簇是单抗结合位点时，会出现假阳性结果；E.原因：样本中因实验处理或污染含有某些细菌，如表皮球菌，菌体释放的内源性HRP可能会对检测结果造成假阳性；F.原因：血液标本未完全抗凝即开始离心，析出的纤维蛋白易在孔板中形成白色薄膜或者絮状物，若清洗不干净，残余在孔板中极易使吸光度值偏高，造成假阳性；G：原因：血液标本保存过久易滋生细菌，影响检测结果，时间过长的标本，血清标本IgG聚集成多聚体，AFP形成二聚体，造成假阳性；H.原因：试验温度过高或过低都有可能引起血清蛋白异常，造成假阳性。
影响细胞ELISA 结果的主要因素The major factors influencing the result of cell ELISA李蓉芬, 陈 敏, 康运生, 钟小林, 何凤田(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室,重庆400038)细胞ELISA(酶联免疫吸附试验) 是用细胞代替可溶性抗原包被于96 孔酶联板(或细胞培养板) 进行免疫学检测的一种有效方法,该方法特别适用于抗原位于细胞膜上而相应抗原的特性又不十分清楚或抗原难于纯化等情况[1～3] 。
我们在实际操作过程中体会到细胞ELISA 的结果理想与否与多种因素有关, 概括起来包括以下几方面。
1 细胞状态应使用对数生长期的细胞。
此期细胞的活力最好,抗原表达水平最高。
对贴壁细胞来讲,此期细胞贴壁最牢。
2 细胞固定2.1 悬浮生长细胞的固定将细胞用PBS 洗涤后,重悬于PBS 计数。
按(4～5) ×105/ 孔加于96 孔酶标板中,1 200 r/ min 离心12～15 min, 弃上清,充分干燥后,每孔加入50μl PBS 配制的0.25 % 戊二醛作用10～12 min, 弃固定液,PBS 洗3 次。
此处应注意的问题有: ①细胞洗涤:目的是去除培养基中的血清,利于后续固定。
②最初每孔悬浮细胞用的液体量:至少应在200μl/ 孔左右,否则会因液体量少而在后续离心中使细胞不均匀分布,进而影响酶联检测结果。
③离心:速度不能过高(为1 200～1 800 r/ min) ,离心时间不能过长(为10～18 min) ,否则可能破坏细胞。
④镜检:离心后的细胞置显微镜下观察,对细胞分布明显不均的孔进行标记, 在后续实验中弃用。
⑤固定前细胞应充分干燥:否则残液可使细胞固定不牢。
⑥固定液的选择:通过比较,在相同时间内(室温) ,0. 25 % 的戊二醛较4% 的多聚甲醛的固定效果好。
2.2 贴壁细胞的固定将细胞接种于96 孔新细胞培养板中,培养36 h 左右,使细胞达80 %～90 % 满孔密度,弃培养基,温PBS 洗2 次,充分干燥后,同上固定8 min ,PBS 洗3 次。
