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酶联免疫吸附法步骤（大纲）一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述1.1ELISA的定义及原理1.2ELISA的分类及应用二、实验准备2.1试剂与材料准备2.1.1主要试剂2.1.2主要材料2.2仪器设备准备2.2.1温度与湿度控制设备2.2.2混合与振荡设备2.2.3其他仪器设备三、实验步骤3.1微孔板的包被3.1.1包被抗原/抗体3.1.2包被后处理3.2封闭3.2.1封闭液的选择3.2.2封闭处理3.3样本及标准品的加入3.3.1样本稀释3.3.2加入标准品与样本3.4抗原/抗体结合3.4.1结合时间与条件3.4.2洗涤3.5酶标二抗的加入3.5.1酶标二抗的稀释3.5.2酶标二抗的结合3.6洗涤3.6.1洗涤次数与条件3.6.2洗涤液的选择3.7显色反应3.7.1底物的选择3.7.2显色条件3.8终止反应3.8.1终止液的选择3.8.2终止反应操作四、结果与分析4.1光密度值（OD值）测定4.2标准曲线的制作4.3结果计算与判断五、实验注意事项及质量控制5.1实验操作注意事项5.2质量控制措施5.2.1试剂质量控制5.2.2设备与操作规范5.2.3数据处理与分析六、实验结果的临床应用与意义6.1ELISA在临床检测中的应用6.2ELISA结果的临床意义及局限性6.3检测结果与临床诊断的关联分析一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述酶联免疫吸附法（ELISA），是一种常用于检测和分析生物样本中蛋白质、多肽、抗体等生物大分子的分析技术。
ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。
IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。
在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。
因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。
这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。
目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。
具体操作步骤如下：1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。
3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。
4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。
5．加入酶底物，温育显色测定本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。
RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。
ELISA法检测HIV抗体影响因素分析作者：李志明来源：《中外医疗》 2011年第5期李志明(滨州市中心血站山东滨州 256600)【摘要】目的探讨ELISA法在检测HIV抗体中的影响因素,提高实验结果准确性。
方法从试剂的准备、样品的采集和储存以及仪器和操作等方面分析每一环节的质量控制对检验结果的准确性所起到的影响。
结果做好试剂的选择和准备,规范操作,做好每一环节的质量控制,在ELISA法检测HIV抗体中非常重要。
结论选择灵敏度高、特异性好的试剂,严格按照试剂说明书要求,注意操作中的诸多影响因素,能有效保证检测结果的准确性。
【关键词】 ELISA法 HIV抗体影响因素【中图分类号】 R187 【文献标识码】 A 【文章编号】 1674-0742(2011)02(b)-0191-02随着艾滋病流行形势的日趋严峻,新发现的感染者数量不断增加,艾滋病检测也显得越来越重要。
目前国内艾滋病初筛试验室检测HIV抗体的方法主要是酶联免疫法(ELISA)。
ELISA法是敏感性高、特异性强、重复性好的试验诊断方法,其试剂具有稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素,既适用于大规模筛查试验,又可以使用于少量标本的检测等优点。
但ELISA法的实验过程中有很多影响因素,如何消除诸多影响因素,保证检测结果的准确性,笔者在实际工作中经长期观察总结,对ELISA法检测HIV抗体影响因素分析如下。
1 试剂的准备《全国艾滋病检测技术规范》(2009版)规定,HIV抗体检测试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准,在有效期内的试剂,其中酶联免疫试剂应批批检合格,推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。
ELISA多为单纯HIV抗体检测试剂,HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。
HIV抗原或抗体被包于固相载体,加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体,加底物显色,用酶标仪测定结果。
ELISA实验中的假阳与假阴分析医学实验中，ELISA是一种常用的特异性强、灵敏度高、操作简便的检测方法。
然而在实际应用中，ELISA操作的各方面均会对结果产生影响，优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件，另外一些非主观因素会对结果造成较大偏差。
ELISA假阳性与假阴性的原因与解决办法：1.假阳性：假阳性的出现通常是样本中掺杂有同源或同工物质，例如类风湿因子、补体、交叉反应物质和其它物质等。
A.原因：溶血会使样本中具有弱过氧化物酶活性的亚铁血红素催化底物四甲基联苯胺（TMB）显色，产生假阳性结果。
解决办法：在处理ELISA最常检查的血清样本时，注意凝集过程、离心过程等细节，避免出现溶血和掺杂血细胞；B.原因：类风湿因子（一种能结合多种动物IgG Fc的自身IgM抗体）可与酶标二抗Fc结合造成假阳性。
解决办法：在检测抗原时可加入2-巯基乙醇使其降解，或用热变性IgG（63℃，10 min）进行封闭处理，另外，使用F(ab)2替代完整的IgG也可达到目的。
一些其他的嗜靶抗原自身抗体，如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素球蛋白等在检测时，可能与靶抗原结合形成复合物，干扰测定结果，所以在测定前需用理化方法将其解离后再测定；C.原因：补体一方面会使一抗和酶标二抗分子发生变构暴露出Fc段C1q分子结合位点，从而将二者连接起来造成假阳性。
另一方面也可能会结合固相抗体从而封闭其与抗原的结合表位而造成假阴性。
解决办法：对细胞培养用血清、动物血清样本进行56 ℃，30 min的补体灭活，另外，通过用EDTA稀释样本也可降低这种作用；D.原因：类地高辛、类AFP等物质能与抗原产生交叉反应。
尤其在使用单抗测定抗原时，如果正好交叉反应的抗原决定簇是单抗结合位点时，会出现假阳性结果；E.原因：样本中因实验处理或污染含有某些细菌，如表皮球菌，菌体释放的内源性HRP可能会对检测结果造成假阳性；F.原因：血液标本未完全抗凝即开始离心，析出的纤维蛋白易在孔板中形成白色薄膜或者絮状物，若清洗不干净，残余在孔板中极易使吸光度值偏高，造成假阳性；G：原因：血液标本保存过久易滋生细菌，影响检测结果，时间过长的标本，血清标本IgG聚集成多聚体，AFP形成二聚体，造成假阳性；H.原因：试验温度过高或过低都有可能引起血清蛋白异常，造成假阳性。
一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。
根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本，保温反应。
标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
（3）加酶标抗体，保温反应。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
（4）加底物显色。
固相上的酶催化底物成为有色产物。
通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
酶联免疫吸附试验的影响因素酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
它的原理是通过特异性抗体与抗原结合，再利用酶标记的二抗介导的颜色反应，来定量分析和检测目标物质。
在进行ELISA实验时，有多个因素会对实验结果产生影响，下面将详细介绍其中的几个主要影响因素。
1.试剂的质量ELISA实验的试剂质量对实验结果至关重要。
这包括酶标记抗体和底物酶的纯度、活性，抗原或抗体的纯度和浓度，以及稀释缓冲液的组成和pH值等。
选择高质量的试剂可以提高实验结果的准确性和重复性。
2.样本处理和储存条件样本的处理和储存条件也会对ELISA结果产生影响。
样本的收集、保存和处理方法需要标准化，以确保稳定性和一致性。
如血液或组织样本的离心速度、温度和时间等要控制一致。
另外，样本的冻结和解冻过程也需要避免反复，以防止损坏细胞结构和影响实验结果。
3.特异性抗体的选择ELISA实验需要选择特异性抗体与目标抗原结合。
抗体的选择要考虑其亲和力、特异性和纯度等特性。
如果抗体不够特异性，可能会导致非特异性结合和假阳性结果。
因此，在实验中选择合适的抗体对实验结果至关重要。
4.孵育条件和时间孵育条件和时间对ELISA实验结果也起着重要影响。
这包括孵育温度、时间和摇床的震荡速度等。
不同的试剂和实验需要不同的孵育条件。
孵育温度过高或过低，孵育时间太长或太短，都可能导致结果的偏差。
5.光度计的精度和校准ELISA测量实验结果时需要使用光度计，光度计的精度和校准对结果的准确性和可重复性至关重要。
定期检查和校准光度计以确保其准确性，并遵循使用指南来保持恒定的测量条件。
6.数据分析和计算ELISA实验得到的数据需要进行合理的分析和计算。
如对标准曲线进行拟合和计算待测样品的浓度等。
合理的统计分析和数据处理能够提高实验结果的可靠性。
【摘要】分析基层中心血站实验室手工操作ELISA时，影响检测结果的相关因素。
分别对用于临床ELISA测定标本收集、试剂准备，加样、温育时间与温度控制，洗板，以OPD 和TMB为底物的显色，比色测定及报告结果和准确解释行问题进行探讨。
对受血者和献血者采用ELISA定性和定量测定操作简便可行。
【关键词】酶联免疫吸附试验献血质量控制在血站质量管理工作中，检测试剂质量优劣直接影响到临床用血安全和血液检测的准确率。
基层中心血站实验室ELISA测定现通常采用手工操作,以微孔板条为固相的测定模式。
任何一个步骤处理不当都会影响测定结果，因此最大限度地保证检测结果的可靠及输血的安全就显得十分重要。
1 临床标本的收集和保存用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）其次为唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。
血清标本测定的标志物为传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、特种蛋白时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：1）要注意避免出现严重溶血。
血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，故在以HRP为标记酶的ELISA 测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色［1］。
2）样本的采集及血清分离中要注意避免细菌污染。
细菌生长分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；此外一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。
3）血清标本如是以无菌操作分离，则可在2～8℃下保存1周。
如为有菌操作，则建议冰冻保存。
样本的长时间保存应在- 70℃以下。
4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。
标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。
此外冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。
5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。
与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。
ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。
该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。
根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。
该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。
一、直接ELISA原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。
缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。
二、间接法ELISA原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。
缺点：交叉反应几率升高。
三、双抗夹心法ELISA原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。
一、①一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30 ~60 min，各试剂在使用前充分混匀。
②酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。
二、操作不当导致1、加样多、操作持续时间长，尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异；2、除包被外，都宜采取45°加样，且要避免加到侧壁上；3、加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会对结果造成较大影响。
4、孵育时间过长，会导致非特异性反应增强；5、显色和终止加液时应避免气泡产生，以免影响检测读数；6、酶标板不宜叠放以减少受热不均，可采取水浴；7、贴密封膜，防止污物浸入和液体蒸发。
8、Elisa 实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸馏水都可导致空白值或背景值升高。
三、检测样品处理不当引起溶血或污染1、血清或血浆标本分离不好或发生溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；2、待检标本污染，菌体中可能含有内源性HRP也会产生假阳性反应；3、在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA 测定中会导致本底过深、造成假阳性；4、标本凝固不完全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，18〜24h完全凝固。
如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。
为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。
5、标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，30使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。
此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可，产生泡沫或样品的过度混合将引起血清蛋白的变性。
ELISpot检测技术操作要求及质量控制作者：刘佳来源：《兽医导刊》 2017年第9期酶联免疫斑点检测技术(enzyme-link immunospot assay，ELISpot) 是近年来发展起来的检测细胞因子免疫学检测技术，是在酶联免疫吸附技术(ELISA) 基础上与细胞培养技术充分结合而建立起来的一种可以在体外检测单细胞水平培养的特异性抗体分泌细胞的新型检测技术，此技术可以快捷、简便的对细胞因子分泌量进行定量，目前已经成为国际公认的抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。
由此可以预见，该检测方法在动物免疫研究领域将会得到广泛应用，发挥其重要作用。
但是，此项技术尚未形成标准化，对细胞含量、细胞浓度、孵育、显色时间等优化条件还没有形成完整体系。
因此，在检测工作实践中，总结实验操作步骤注意事项，提高检测水平，对提高ELISpot技术检测的准确性以及对各个因素进行优化，建立稳定的检测体系具有重要意义。
一、细胞质量控制1. 采血。
选取45 ～ 50 日龄，没有疫苗接种经历的仔猪，从前腔静脉采集外周静脉血，保证无菌操作，抗凝剂抗凝。
采血后轻摇，使血液与抗凝剂充分混匀，避免出现血凝块，影响分离效果。
震荡过于剧烈或保存不当，会出现溶血现象。
2. 淋巴细胞分离。
6 h 内进行外周血单个核细胞(PBMC) 的分离，时间过长会影响活细胞数，淋巴细胞的活细胞比例直接影响酶联免疫斑点的形成。
将稀释好的细胞悬液沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液液面上，2 000 转/ 分钟离心10 min，转速不宜过高，否则会使细胞壁破裂。
离心后，离心管中由上至下细胞分为四层，即血浆或者组织匀浆液层、环状乳白色淋巴细胞富集层、透明分离液层、红细胞层。
吸出中间环状乳白色PBMC 富集层，吸取方法可以将组织匀浆层用吸管去掉，将乳白色淋巴细胞吸出，也可以直接将吸管插入淋巴细胞富集层吸出。
吸液要慢、稳，避免吸出红细胞。
洗涤后，如果有红细胞存在，可以使用红细胞裂解液，将红细胞去除。
ELISA法检测乙肝两对半的影响因素及处理方法作者：张琴来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第05期【摘要】目的：讨论了ELISA法对乙肝两对半检测的影响因素与处理方法。
方法：分析了ELISA法对乙肝两对半的检测步骤，探讨了乙肝两对半的影响因素处理方法。
结果：影响ELISA法对乙肝两对半检测的因素主要有实验前的标本准备、检验人员、试剂盒、检验过程标准的操作规程与检验结果研读等，两对半各指标对乙肝诊治具有重要的指导意义。
结论：在乙肝临床治疗当中，乙肝两对半是重要的指标治疗依据，而ELISA法则是乙肝检测的灵敏手段，只有严格按操作步骤实施，方能强化质量控制，有效去除影响因素的干扰。
【关键词】ELISA法；检测；乙肝对半；影响因素；处理方法【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）05-0208-01在医学检验中，常用ELISA法对乙肝两对半进行检测，该方法特异性强、灵敏性高、试剂稳定且易操作，在乙肝两对半检测中受到了广泛应用，但在乙肝两对半的实际工作当中，因实验环境的差异性，试剂盒的质量不同，以及检测人员的操作熟练性等因素，均会对乙肝的两对半检测产生影响，其检测结果无法排除假阴性与假阳性可能，因此，采取一定处理方法，加强两对半影响因素的处理是必要的。
1 实验前的影响因素及处理方法1.1试剂盒影响及处理方法在ELISA法实验当中，试剂盒质量是实验结果正确性的基本保证，因各商家的试剂盒特异性、灵敏性、稳定性与精密性等存在一定差异，因此，为了避免试剂盒所带来的影响，应采取下列处理方法：实验所用的试剂盒应均是国家相关部门检定的合格品，对于商家试剂盒存在的差异性，各实验室可依据自身实际状况，尽量选择灵敏性好、特异性强与操作简单的试剂盒，并符合相关部门的质量要求，同时，试剂盒要保存在2℃-8℃的环境中，并做好温度记录，当试验时，应把试剂盒放在室温中，对其平衡0.5h，确保反应时间的一致性与准确性。
影响细胞ELISA 结果的主要因素
The major factors influencing the result of cell ELISA
李蓉芬, 陈 敏, 康运生, 钟小林, 何凤田
(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室,重庆400038)
细胞ELISA(酶联免疫吸附试验) 是用细胞代替可溶性抗原包被于96 孔酶联板(或细胞培养板) 进行免疫学检测的一种有效方法,该方法特别适用于抗原位于细胞膜上而相应抗原的特性又不十分清楚或抗原难于纯化等情况[1～3] 。
我们在实际操作过程中体会到细胞ELISA 的结果理想与否与多种因素有关, 概括起来包括以下几方面。
1 细胞状态
应使用对数生长期的细胞。
此期细胞的活力最好,抗原表达水平最高。
对贴壁细胞来讲,此期细胞贴壁最牢。
2 细胞固定
2.1 悬浮生长细胞的固定
将细胞用PBS 洗涤后,重悬于PBS 计数。
按(4～5) ×105/ 孔加于96 孔酶标板中,1 200 r/ min 离心12～15 min, 弃上清,充分干燥后,每孔加入50μl PBS 配制的0.25 % 戊二醛作用10～12 min, 弃固定液,PBS 洗3 次。
此处应注意的问题有: ①细胞洗涤:目的是去除培养基中的血清,利于后续固定。
②最初每孔悬浮细胞用的液体量:至少应在200μl/ 孔左右,否则会因液体量少而在后续离心中使细胞不均匀分布,进而影响酶联检测结果。
③离心:速度不能过高(为1 200～1 800 r/ min) ,离心时间不能过长(为10～18 min) ,否则可能破坏细胞。
④镜检:离心后的细胞置显微镜下观察,对细胞分布明显不均的孔进行标记, 在后续实验中弃用。
⑤固定前细胞应充分干燥:否则残液可使细胞固定不牢。
⑥固定液的选择:通过比较,在相同时间内(室温) ,0. 25 % 的戊二醛较4% 的多聚甲醛的固定效果好。
2.2 贴壁细胞的固定
将细胞接种于96 孔新细胞培养板中,培养36 h 左右,使细胞达80 %～90 % 满孔密度,弃培养基,温PBS 洗2 次,充分干燥后,同上固定8 min ,PBS 洗3 次。
此处应注意的问题有: ①细胞接种前应计数: 旨在尽量使每孔中的细胞数一致。
②细胞洗涤:应用温PBS 洗涤,否则会因骤冷而使细胞脱落。
这一点在冬天操作时尤为重要。
③其它注意事项:同悬浮细胞固定中应注意的问题“④～⑥”。
3 封闭液的选择
我们使用PBS 配制的10 % 小牛血清、2% 牛血清白蛋白、5% 绵羊血清、5% 市售脱脂奶粉等几种不同试剂进行封闭,结果以5% 脱脂奶粉的封闭效果最好。
4 细胞内源性过氧化物酶的检测和去除
对固定过的细胞,直接加入邻苯二胺(OPD) 底物显色,观察内源性过氧化物酶的情况。
对内源性过氧化物酶水平很低的细胞无需进行内源性过氧化物酶的处理,而对内源性过氧化物酶水平较高的细胞则需用甲醇配制的0.3 % 双氧水于室温下作用30 min 予以去除。
5 反应后洗涤
为了避免细胞非特异性吸附抗体,每步反应后应进行充分洗涤。
洗涤次数和时间均应较常规ELISA (常规ELISA 指包被物为可溶性物质) 增加。
①洗涤次数和时间:每步反应后至少应洗5 次,每次洗涤时间不少于5 min 。
②振荡洗涤:在洗涤过程中,使酶联板处于温和振荡状态,以保证洗
涤充分。
③在洗涤液中加入终浓度为1.0 %～1.5 % 的吐温-20, 以降低反应的非特异性。
6 应设多孔重复
尽管采取了上述措施,但有时无法确保每孔的细胞数完全一致,也不能保证细胞100 % 均匀铺于孔底,故无论是对照孔, 还是实验孔,都应设4～5 个复孔,取其结果平均值,从而最大限度消除系统误差。
综上所述,细胞ELISA 与常规ELISA 相比,影响因素较多, 操作过程中应多加注意。
关键词: 细胞;酶联免疫吸附试验;影响因素
中图法分类号: R446. 61 文献标识码:B
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