固定底物技术酶底物法 技术参数

微生物固定底物技术酶底物法测定仪原理：科立得--DST酶底物法是可在24小时内快速定量和定性检测“总大肠菌群及大肠埃希氏菌及粪大肠菌群”，其原理是利用了MMO-MUG特异性培养基的呈色和荧光反应，该方法比传统的滤膜法和多管法的假阳性和假阴性发生率更低，培养时间更短。

技术特点：1、DST酶底物法试剂完全符合《生活饮用水标准检验方法》的MMO-MUG 培养基，采用固定底物技术（DST）酶底物法，Snap包装。

200个/包。

能够精确检出100ml水样中单个的活性总大肠菌群和大肠埃希氏菌，以及粪大肠菌群，假阴性率低。

每个单位试剂可抑制200万个异养细菌，假阳性率低。

能够消除传统方法中的主观判断影响，准确性高于滤膜法及多管发酵法。

2006年被列入到《生活饮用水标准检验方法》（GB/T5750.12-2006），是国标认可的MMO-MUG培养基；经美国环保署的认可作为24 小时检验出厂水与源水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群（粪大肠菌群）的方法；通过水与废水检验的标准方法分析化学工作者协会(AOAC) 、国际瓶装水协会(IBWA) 及欧洲瓶装水协会(EBWA)认证；中国、美国、加拿大、英国、德国、法国、日本、韩国、阿根廷、巴西、澳大利亚、新西兰、南非等50多国家及地区的饮用水，地表水，污水等检验标准。

年全球使用量超过数千万次，美国90%以上的实验室使用科立得试剂。

2、定量盘Quanti-tray或Quanti-tray 2000定量盘Quanti-tray（51孔定量盘），有50个标准孔格，1个大孔格。

无须稀释可检测200MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群Quanti-tray2000（97孔定量盘），有48个标准孔格，1个大孔格和48个小孔格，无须稀释可检测2419MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群3、无菌取样瓶含10%硫代硫酸钠10ml的无菌取样瓶，可定量100ml水样4、2009D程控定量封口机与符合《生活饮用水标准检验方法》固定底物技术（DST）酶底物法的MMO-MUG培养基配套使用的2009D程控定量封口机。

固定酶底物法应用于污泥粪大肠菌群的检测摘要：目前污泥中粪大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法，这两种方法均是根据总大肠菌群具有的生物特性，经过初发酵、平板分离、革兰氏染色镜检、复发酵的过程检测污泥中粪大肠菌群的数量。

传统方法检测前须准备大量培养基，检测耗时长，有诸多缺点。

现希望通过将固定酶底物法应用于污泥中粪大肠菌群的检测，缩短检测时间，节省人力成本，提高检测效率和检测的准确率。

关键词：污泥粪大肠菌群滤膜法固定酶底物法随着科学技术的发展，城镇化进程的加快，城镇生活污水总量逐年提高，从而导致产生的大量的污泥[1]。

粪大肠菌群是城镇污水处理厂污泥泥质控制的一项重要指标[2]。

粪大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示样品中有否有粪便污染。

粪大肠菌群数量的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。

在CJ/T221-2005《城市污水处理厂污泥检验方法》中城市污泥粪大肠菌群的检验采用滤膜法测得[3]。

该方法使用新滤膜前需对滤膜进行鉴定，同时对滤膜上形成的不典型或疑难的菌落须进行涂片、革兰氏染色和镜检，另一部分接种于EC培养基看是否产气。

由此可见，滤膜法检测污泥粪大肠菌群非常繁琐，需要较长的时间获得准确的检测结果。

随着酶底物技术的发展，固定底物酶底物法越来越多地应用于检测水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌、耐热（粪）大肠菌群，是GB/T5750.12-2006的国标方法[4]。

污泥粪大肠菌群的检测同样是通过无菌水逐级稀释检测。

因此，希望通过运用固定底物酶底物法检测污泥粪大肠菌群，以便更快捷的方式获得准确的检测结果。

1 材料与方法1.1材料培养基：M-TEC培养基、EC培养基、酶底物试剂（含97孔定量盘）仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、程控定量封口机、干热灭菌箱、振荡器、滤膜过滤装置其他：75mm平皿、接种环、革兰氏染色试剂盒、移液枪、试管、无菌瓶、无菌水、滤膜（孔径为0.45μm）、1L烧杯、火焰枪1.2样品采集和制备1.2.1取样方法采用多点取样混合，样品质量不小于1kg。

一、填空题1．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌(粪大肠菌群)时，需要取 ml水样，在±℃培养 h。

①②答案：100 36 1 242．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，呈现色为阳性。

①答案：黄3．采用固定底物技术酶底物法定性测定大肠埃希氏菌，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，将呈现——色的水样在暗处用波长为__ ___nm的紫外灯光照射，如果有产生则表示有大肠埃希氏菌存在。

②答案：黄 366 蓝色荧光4．采用固定底物技术酶底物法定量测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，水样加入培养基摇匀后，需倒入51孔或97孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以，然后用封口。

①②答案:赶除孔穴内气泡程控定量封口机二、判断题1．总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生乒半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。

( )①答案：正确2．采用固定底物技术酶底物法测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌可以定性测量，也可以定量测量。

( )①②答案：正确3．采用固定底物技术酶底物法可在48h判断水样中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌及含有的总大肠菌群和大肠埃希氏菌的最可能数值。

( )①②答案：错误正确答案为：应该是24h。

三、问答题采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌时，采用正确步骤培养后的样品，怎样判断大肠埃希氏菌的数值?②答案：采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌，采用正确步骤培养后的样品，观察51孔或97孔无菌定量盘，将变成黄色的水样的定量盘在暗处用波长为366nm的紫外灯光照射，如果有蓝色荧光产生则表示该定量盘孔穴中有大肠埃希氏菌存在，计算有荧光反映的孔穴数，对照MPN表即可查出大肠埃希氏菌最大可能数(MPN)，结果以MPN／100m1表示；如所有孔未产生荧光，则可报告为大肠埃希氏菌未检出。

耐热⼤肠菌群粪⼤肠菌群快速检测（酶底物法）1 适⽤范围本⽅法适⽤于⽣活饮⽤⽔及其⽔源⽔、地表⽔、污⽔、废⽔等⽔中粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群）的定性检测、定量检测2 ⽅法原理固定底物酶底物法（DST）采⽤⼤肠菌群细菌能产⽣β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄⾊的原理，来判断⽔样中是否含粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群），粪⼤肠的培养温度是44.5℃。

3 仪器设备3.1 程控定量封⼝机3.2电热恒温培养箱3.3 冰箱3.4 51孔定量盘、97孔定量盘3.5 100ml⽆菌⽔样瓶3.6 ⾼压蒸汽灭菌锅3.7 ⼲热灭菌器3.8 量筒3.9 吸管3.10 试管4 培养基和试剂4.1 科⽴得（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基4.2 ⽆菌⽔5 样品的采集和保存5.1采样前准备：5.1.1 采样瓶：采⽤IDEXX公司科⽴得系统配套的灭菌100毫升消毒带刻度容器。

5.2 样品采样及注意事项5.2.1将已灭菌和封包好的采样瓶，⽆论在什么条件下采样时，均要⼩⼼开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶⼦颈部受杂菌污染，并注意在使⽤船只或附带的采样绳等附加设备采样时可能造成的污染。

5.2.2 在采集江、河、湖、库、地表⽔样时，可握住瓶⼦底部直接将采样瓶插⼊⽔中，约距⽔⾯10~15厘⽶处，瓶⼝朝来⽔⽅向，使⽔样灌⼊瓶内。

如果没有⽔流，可握住瓶⼦⽔平前推，直⾄充满⽔样为⽌。

采好样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。

采样后，采样瓶内上部应留有⼀些空隙，以便检验前充分混匀⽔样。

5.2.3 ⽤采样器采样时，将⽆菌的⽔样瓶放⼊架内。

将采样装置放⼊⽔中。

到达预定深度后，打开瓶塞，待⽔样灌好后，松开瓶塞的软绳，盖上瓶盖。

再将整个装置提出⽔⾯。

5.2.4 从⾃来⽔龙头采集样品时，不要选⽤漏⽔的龙头，采⽔前可先将⽔龙头⽤酒精灯⽕焰灼烧灭菌或⽤70%的酒精溶液消毒⽔龙头及采样瓶⼝，然后将⽔龙头完全打开，放⽔数分钟后除去⽔管中的滞留杂质。

采⽔时控制⽔流速度⼩⼼接⼊瓶内。

水质检测中大肠菌群的研究作者：陈露邓敏来源：《科技资讯》2013年第21期摘要：介绍了大肠菌群概念和水质检测中相关检测项目和检测方法，并比较了用多管发酵法和固定底物酶底物法检测水源水中的耐热大肠菌群，结果表明两种方法无差异。

固定底物酶底物法可以作为准确的检测方法推广。

关键词：大肠菌群水质检测多管发酵法酶底物法中图分类号：X832 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）07（c）-0129-01由于我国饮用水的水源水大部分都取自城市生活污水直接排放的江河湖泊，所以近年来我国的水质标准对于微生物特别是对于大肠菌群的标准要求越来越严格。

GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》中大肠菌群增加了大肠埃希氏菌﹑耐热大肠菌群，修订了总大肠菌群。

1 水质检测中大肠菌群的相关检测项目总大肠菌群，37 ℃培养24 h内能够发酵乳糖产酸产气及乙醛。

主要包括埃希氏菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

此名称并非细菌学分类，而是卫生领域用语，是指具有某些特性的一组与粪便相关的细菌[1]。

耐热大肠菌群，44.5 ℃具有与大肠菌群相同发酵及生物化学性能的菌群，包括埃希氏菌和耐热克雷伯菌属。

此名称也是卫生领域用语。

大肠埃希氏菌，好氧革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，大小约0.5～0.8×2.0～3.0 μm，能分解乳糖产酸产气，直接指示粪便污染。

2 水质检测中大肠菌群的相关检测方法大肠菌群的标准检验方法有多管发酵法，滤膜法，固定底物酶底物法。

有文献报道[2]还可以采用PCR技术、免疫学等方法，但这些方法虽灵敏度高，但检测成本较高很难广泛应用。

滤膜法是过滤水样将细菌截留在0.45 μm的过滤膜膜上然后在选择性培养基中培养24 h，计数膜上生长出的典型细菌菌落。

但此方法适用于较大体积水样，结果易受其它细菌的影响。

所以一般情况下我们主要采用多管发酵法和固定底物酶底物法。

2.1 多管发酵法和固定底物酶底物法的比较我们以耐热大肠菌群检测为例。

简述桶装水中铜绿假单胞菌的几种检测方法作者：马慧娟徐慧高宏来源：《食品安全导刊·中旬刊》2019年第03期引言铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），也称为绿脓杆菌，属于假单胞菌属。

广泛分布于自然界（土壤、空气、水源等）及正常人皮肤、肠道和呼吸道，大小为（1.5～3.0）μm×（0.5～0.8）μm，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。

该菌在普通培养基上生长良好，专性需氧，菌落形态不一，多数直径在 2～3 mm，边缘不整齐，扁平湿润。

在血琼脂平板上形成透明溶血环。

铜绿假单胞菌是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。

目前检测铜绿假单胞菌的标准中采用的主要是传统生化方法，包括分离培养、生化鉴定等，不能实现大批量水样的快速检测。

近几年，随着科技的发展，检测铜绿假单胞菌的方法多种多样，本文对近年铜绿假单胞菌检测技术进行综述，为铜绿假单胞菌的快速、准确检测研究技术提供参考。

铜绿假单胞菌检测技术国标滤膜法检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》。

铜绿假单胞菌产色素分为三种：产绿脓菌素，产青脓素，产红脓素;铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长;具有氧化酶，可以使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物：可以产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加纳氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色络合物;根据这些生化特性，通过滤膜过滤将铜绿假单胞菌富集到CN琼脂上，再用生化试剂管进行生化鉴定。

也可以用VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定系统用于微生物鉴定，准确率高，可用于微生物实验室的日常检测工作。

实时荧光定量PCR检测外毒素 A 基因在铜绿假单胞菌中高度保守，根据 GenBank 中铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列，设计特异性引物及TaqMan探针，并利用实时荧光 PCR技术，对目标靶序列进行特异性扩增，建立了一套检测食品中铜绿假单胞菌的方法，特异性试验和灵敏性试验良好，该检测方法具有特异、快速的特点，能够满足检测要求，为食品中铜绿假单胞菌的快速检测奠定了基础。