固定底物技术酶底物法 技术参数

微生物固定底物技术酶底物法测定仪原理：科立得--DST酶底物法是可在24小时内快速定量和定性检测“总大肠菌群及大肠埃希氏菌及粪大肠菌群”，其原理是利用了MMO-MUG特异性培养基的呈色和荧光反应，该方法比传统的滤膜法和多管法的假阳性和假阴性发生率更低，培养时间更短。

技术特点：1、DST酶底物法试剂完全符合《生活饮用水标准检验方法》的MMO-MUG 培养基，采用固定底物技术（DST）酶底物法，Snap包装。

200个/包。

能够精确检出100ml水样中单个的活性总大肠菌群和大肠埃希氏菌，以及粪大肠菌群，假阴性率低。

每个单位试剂可抑制200万个异养细菌，假阳性率低。

能够消除传统方法中的主观判断影响，准确性高于滤膜法及多管发酵法。

2006年被列入到《生活饮用水标准检验方法》（GB/T5750.12-2006），是国标认可的MMO-MUG培养基；经美国环保署的认可作为24 小时检验出厂水与源水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群（粪大肠菌群）的方法；通过水与废水检验的标准方法分析化学工作者协会(AOAC) 、国际瓶装水协会(IBWA) 及欧洲瓶装水协会(EBWA)认证；中国、美国、加拿大、英国、德国、法国、日本、韩国、阿根廷、巴西、澳大利亚、新西兰、南非等50多国家及地区的饮用水，地表水，污水等检验标准。

年全球使用量超过数千万次，美国90%以上的实验室使用科立得试剂。

2、定量盘Quanti-tray或Quanti-tray 2000定量盘Quanti-tray（51孔定量盘），有50个标准孔格，1个大孔格。

无须稀释可检测200MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群Quanti-tray2000（97孔定量盘），有48个标准孔格，1个大孔格和48个小孔格，无须稀释可检测2419MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群3、无菌取样瓶含10%硫代硫酸钠10ml的无菌取样瓶，可定量100ml水样4、2009D程控定量封口机与符合《生活饮用水标准检验方法》固定底物技术（DST）酶底物法的MMO-MUG培养基配套使用的2009D程控定量封口机。

固定酶底物法应用于污泥粪大肠菌群的检测摘要：目前污泥中粪大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法，这两种方法均是根据总大肠菌群具有的生物特性，经过初发酵、平板分离、革兰氏染色镜检、复发酵的过程检测污泥中粪大肠菌群的数量。

传统方法检测前须准备大量培养基，检测耗时长，有诸多缺点。

现希望通过将固定酶底物法应用于污泥中粪大肠菌群的检测，缩短检测时间，节省人力成本，提高检测效率和检测的准确率。

关键词：污泥粪大肠菌群滤膜法固定酶底物法随着科学技术的发展，城镇化进程的加快，城镇生活污水总量逐年提高，从而导致产生的大量的污泥[1]。

粪大肠菌群是城镇污水处理厂污泥泥质控制的一项重要指标[2]。

粪大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示样品中有否有粪便污染。

粪大肠菌群数量的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。

在CJ/T221-2005《城市污水处理厂污泥检验方法》中城市污泥粪大肠菌群的检验采用滤膜法测得[3]。

该方法使用新滤膜前需对滤膜进行鉴定，同时对滤膜上形成的不典型或疑难的菌落须进行涂片、革兰氏染色和镜检，另一部分接种于EC培养基看是否产气。

由此可见，滤膜法检测污泥粪大肠菌群非常繁琐，需要较长的时间获得准确的检测结果。

随着酶底物技术的发展，固定底物酶底物法越来越多地应用于检测水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌、耐热（粪）大肠菌群，是GB/T5750.12-2006的国标方法[4]。

污泥粪大肠菌群的检测同样是通过无菌水逐级稀释检测。

因此，希望通过运用固定底物酶底物法检测污泥粪大肠菌群，以便更快捷的方式获得准确的检测结果。

1 材料与方法1.1材料培养基：M-TEC培养基、EC培养基、酶底物试剂（含97孔定量盘）仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、程控定量封口机、干热灭菌箱、振荡器、滤膜过滤装置其他：75mm平皿、接种环、革兰氏染色试剂盒、移液枪、试管、无菌瓶、无菌水、滤膜（孔径为0.45μm）、1L烧杯、火焰枪1.2样品采集和制备1.2.1取样方法采用多点取样混合，样品质量不小于1kg。

一、填空题1．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌(粪大肠菌群)时，需要取 ml水样，在±℃培养 h。

①②答案：100 36 1 242．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，呈现色为阳性。

①答案：黄3．采用固定底物技术酶底物法定性测定大肠埃希氏菌，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，将呈现——色的水样在暗处用波长为__ ___nm的紫外灯光照射，如果有产生则表示有大肠埃希氏菌存在。

②答案：黄 366 蓝色荧光4．采用固定底物技术酶底物法定量测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，水样加入培养基摇匀后，需倒入51孔或97孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以，然后用封口。

①②答案:赶除孔穴内气泡程控定量封口机二、判断题1．总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生乒半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。

( )①答案：正确2．采用固定底物技术酶底物法测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌可以定性测量，也可以定量测量。

( )①②答案：正确3．采用固定底物技术酶底物法可在48h判断水样中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌及含有的总大肠菌群和大肠埃希氏菌的最可能数值。

( )①②答案：错误正确答案为：应该是24h。

三、问答题采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌时，采用正确步骤培养后的样品，怎样判断大肠埃希氏菌的数值?②答案：采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌，采用正确步骤培养后的样品，观察51孔或97孔无菌定量盘，将变成黄色的水样的定量盘在暗处用波长为366nm的紫外灯光照射，如果有蓝色荧光产生则表示该定量盘孔穴中有大肠埃希氏菌存在，计算有荧光反映的孔穴数，对照MPN表即可查出大肠埃希氏菌最大可能数(MPN)，结果以MPN／100m1表示；如所有孔未产生荧光，则可报告为大肠埃希氏菌未检出。

入《 生活饮用水卫生标准》 （ Ｇ Ｂ ５ ７ ４ ９ －２ ０ ０ ６ ） 附录 Ａ 中， 作 为补 充指标 。在 附录 Ａ 中也 给 定 了肠 球 菌 的
生活饮 用水 水质 参考 指标 及 限值要 求 。
卫 生 学 家认 为 ， 肠 球 菌 对恶 劣 的外 环境 和 冷 冻
条件具 有较 强 的抵抗 力 ， 因此 将其作 为 监测水 质 、 环 境 卫生 质量 的污染 指标更 具有 卫生 学 意义 。鉴 于肠 球 菌对 人体 的危 害 程 度 ， 加 强 原 水 中肠 球 菌 的检 测 有 一定 的意义 ， 甚 至 在今后 条 件允许 的情况 下 ， 在 水 厂 出厂水 以及 管 网水 的检 测 中 增 加 对 肠 球 菌 的 监 测， 能 进一 步保 障城 市居 民用 水 的安全 性 。
第 ９卷
第 ４期
供 水 技 术
ＷＡ ＴＥ Ｒ Ｔ Ｅ ＣＨＮ０Ｌ ０ＧＹ
Ｖ ｏ １ ． ９ Ｎｏ ． ４
Ａｕ ｇ． ２０１ ５
２ ０ １ ５年 ８月
固
陆志 惠， 韩敏 奇 ， 蒋增辉 ， 曹霞霓
（ 上 海市供 水调度监 测 中心 ，上海 ２ ０ ０ ０ ０ ２ ）
生 和生产 环境 卫生 状况 的评 估指标 。
１ 材料和 方法
１ ． １ 材料
１ ． １ ． １ 仪器
封 口机 ； 恒 温培 养 箱 ： （ ４ １± ０ ． ５ ） ℃； 紫外光灯 ：
６ Ｗ， ３ ６ ５ ｎ ｍ； 无菌 取样 瓶 ： １ ０ ０ ｍＬ 。
肠球 菌可 用作 粪便 污染 的指示 。多数 菌种 不能
１ ． １ ． ２ 培养 基及 耗材 培养 基 Ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｌ ｅ ｒ ｔ Ｔ Ｍ 测试 包 ； 检测 耗 材 ９ ７孔 定

耐热⼤肠菌群粪⼤肠菌群快速检测（酶底物法）1 适⽤范围本⽅法适⽤于⽣活饮⽤⽔及其⽔源⽔、地表⽔、污⽔、废⽔等⽔中粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群）的定性检测、定量检测2 ⽅法原理固定底物酶底物法（DST）采⽤⼤肠菌群细菌能产⽣β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄⾊的原理，来判断⽔样中是否含粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群），粪⼤肠的培养温度是44.5℃。

3 仪器设备3.1 程控定量封⼝机3.2电热恒温培养箱3.3 冰箱3.4 51孔定量盘、97孔定量盘3.5 100ml⽆菌⽔样瓶3.6 ⾼压蒸汽灭菌锅3.7 ⼲热灭菌器3.8 量筒3.9 吸管3.10 试管4 培养基和试剂4.1 科⽴得（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基4.2 ⽆菌⽔5 样品的采集和保存5.1采样前准备：5.1.1 采样瓶：采⽤IDEXX公司科⽴得系统配套的灭菌100毫升消毒带刻度容器。

5.2 样品采样及注意事项5.2.1将已灭菌和封包好的采样瓶，⽆论在什么条件下采样时，均要⼩⼼开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶⼦颈部受杂菌污染，并注意在使⽤船只或附带的采样绳等附加设备采样时可能造成的污染。

5.2.2 在采集江、河、湖、库、地表⽔样时，可握住瓶⼦底部直接将采样瓶插⼊⽔中，约距⽔⾯10~15厘⽶处，瓶⼝朝来⽔⽅向，使⽔样灌⼊瓶内。

如果没有⽔流，可握住瓶⼦⽔平前推，直⾄充满⽔样为⽌。

采好样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。

采样后，采样瓶内上部应留有⼀些空隙，以便检验前充分混匀⽔样。

5.2.3 ⽤采样器采样时，将⽆菌的⽔样瓶放⼊架内。

将采样装置放⼊⽔中。

到达预定深度后，打开瓶塞，待⽔样灌好后，松开瓶塞的软绳，盖上瓶盖。

再将整个装置提出⽔⾯。

5.2.4 从⾃来⽔龙头采集样品时，不要选⽤漏⽔的龙头，采⽔前可先将⽔龙头⽤酒精灯⽕焰灼烧灭菌或⽤70%的酒精溶液消毒⽔龙头及采样瓶⼝，然后将⽔龙头完全打开，放⽔数分钟后除去⽔管中的滞留杂质。

采⽔时控制⽔流速度⼩⼼接⼊瓶内。

水中微生物检测（新国标方法）
• 总大肠菌群/大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群
固定底物技术酶底物法介绍
1
总大肠菌群 / 大肠埃希氏菌 及耐热(粪)大肠菌群
固定底物技术酶底物法
2
微生物检测的重要性
地震等自然灾害过后水体中会被大量微生物所污染，特别是粪 便污染，如水体中含有肠道病原菌株，并被人饮用则会爆发严 重疾病如泌尿系感染、菌血症和脑膜炎，少数肠道病原菌株可 引起急性腹泻。 通常人们用投放含氯消毒剂进行消毒，但消毒效果如何还需要 通过检测水体中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌来判断。
3, 优点
• 假阳性,假阴性底 • 操作简单,快速 • 定性,定量（51孔/97孔定量盘法） • 50多个国家和组织认证
世界卫生组织WHO,美国EPA,水与废水标准检验法…….
14
科立得 应用
➢ 饮用水 ➢ 源水 ➢ 瓶装水 ➢ 再生水
➢ 废水 ➢ 食品水 ➢ 畜牧用水
➢ 医疗用水
收录于“标准测试法”内 – APHA(美国公共卫生协会), US EPA,
12
β-葡萄糖醛酸酶
酶底物法大肠埃希氏菌 阳性反应原理
4-甲基-伞形葡萄糖苷酸
13
《生活饮用水标准检验方法》对酶底物法定义
1, 方法
本标准方法采用固定底物技术酶底物法 Defined Substrate Technology, DST
2，培养基：
采用Minimal Medium ONPG-MUG，简称 MMO-MUG培养基
粪(耐热)大肠菌群
➢菌落总数:1ml; ➢大肠菌100ml
➢细菌总数1ml, ➢总大肠菌群/耐 热大肠菌群 :100ml
➢1L
准
GB/T 14848-93地下水质量标准 GB 9667-2019,游泳场所卫生标 准

卫生学评价 ， 检测的指标为大肠 菌群和大肠埃希 氏菌 或粪大肠菌群 （ 耐热大肠菌群） 以这些指标作为粪便 ， 污染的指示 菌。 采用的标准检测方法为膜过滤法和多 管发酵法。但这两种方法检测时间相对较长 ， ４— 需 ８ ７ ２小时 ， 需验 证 试 验 ， 验 步骤 较 为 繁 琐 ， 以 不 能 试 所
ｔｏ ｈｎ ｌ ｒｐ ｅｙ－ｐ－ －ｇｌｃｏ ｙ ａ ｏｉｅ 使培 养液 呈 黄 Ｄ ａａｔｐ ｒｎ ｓ ） ｄ
３２ 耗材 ： ． 取样 瓶或 使 用 灭 菌的 玻 璃瓶 ；ｌ 定 ５孔
量盘 或 ９ ７孔定 量盘 。
注 ： 孔定 量盘 可在 无需 稀释 的情 况 下 检测 ｌ ５ ｌ ～
２ 放在 ３ ±１ ） ６ ℃培养箱 ， 培养 ２ 小时 ； ４ 注： 如检测耐热大肠菌群 （ 粪大肠菌群） 则需放在
４ ．℃ ， ４５ 培养 ２ ４小时 ； 果 培养 时 间超过 ２ 时 ， 如 ８小 呈 阴性 结果 则结果 有效 ，如果 呈 阳性 结果 则结 果 无效 ， 需 重做 此水样 。
可在 ２ ４小时内同时定量检测出大肠茵群和 大肠埃希 氏菌。 此方法大大的减少 了 工作量 ， 免 了 避 使用 多管法的逐 级稀释带来的操作误差 ； 也避免 了使用滤膜 法时肉眼读数的人 为误差， 所以其假 阳性率和假 阴性率都比传统方
法低 。 由于 ２ ４小时 内就得 到 结果 ， 以很 好 的用 于 突发事件应 急 。 可
关键词 ： 大肠菌群 大肠埃希氏菌 固定底物酶底物 法 Ｃ ｌｅｔ可立得 试剂 ｏｌ （ ｉｒ
１背 景
出水 样 中大肠 菌群和 大肠埃 希 氏菌 的 ＭＰ 值 。 Ｎ
目前 我 国对 生 活饮 用 水 、 源 水 、 水 地表 水 等 进 行

水质检测中大肠菌群的研究作者：陈露邓敏来源：《科技资讯》2013年第21期摘要：介绍了大肠菌群概念和水质检测中相关检测项目和检测方法，并比较了用多管发酵法和固定底物酶底物法检测水源水中的耐热大肠菌群，结果表明两种方法无差异。

固定底物酶底物法可以作为准确的检测方法推广。

关键词：大肠菌群水质检测多管发酵法酶底物法中图分类号：X832 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）07（c）-0129-01由于我国饮用水的水源水大部分都取自城市生活污水直接排放的江河湖泊，所以近年来我国的水质标准对于微生物特别是对于大肠菌群的标准要求越来越严格。

GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》中大肠菌群增加了大肠埃希氏菌﹑耐热大肠菌群，修订了总大肠菌群。

1 水质检测中大肠菌群的相关检测项目总大肠菌群，37 ℃培养24 h内能够发酵乳糖产酸产气及乙醛。

主要包括埃希氏菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

此名称并非细菌学分类，而是卫生领域用语，是指具有某些特性的一组与粪便相关的细菌[1]。

耐热大肠菌群，44.5 ℃具有与大肠菌群相同发酵及生物化学性能的菌群，包括埃希氏菌和耐热克雷伯菌属。

此名称也是卫生领域用语。

大肠埃希氏菌，好氧革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，大小约0.5～0.8×2.0～3.0 μm，能分解乳糖产酸产气，直接指示粪便污染。

2 水质检测中大肠菌群的相关检测方法大肠菌群的标准检验方法有多管发酵法，滤膜法，固定底物酶底物法。

有文献报道[2]还可以采用PCR技术、免疫学等方法，但这些方法虽灵敏度高，但检测成本较高很难广泛应用。

滤膜法是过滤水样将细菌截留在0.45 μm的过滤膜膜上然后在选择性培养基中培养24 h，计数膜上生长出的典型细菌菌落。

但此方法适用于较大体积水样，结果易受其它细菌的影响。

所以一般情况下我们主要采用多管发酵法和固定底物酶底物法。

2.1 多管发酵法和固定底物酶底物法的比较我们以耐热大肠菌群检测为例。

简述桶装水中铜绿假单胞菌的几种检测方法作者：马慧娟徐慧高宏来源：《食品安全导刊·中旬刊》2019年第03期引言铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），也称为绿脓杆菌，属于假单胞菌属。

广泛分布于自然界（土壤、空气、水源等）及正常人皮肤、肠道和呼吸道，大小为（1.5～3.0）μm×（0.5～0.8）μm，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。

该菌在普通培养基上生长良好，专性需氧，菌落形态不一，多数直径在 2～3 mm，边缘不整齐，扁平湿润。

在血琼脂平板上形成透明溶血环。

铜绿假单胞菌是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。

目前检测铜绿假单胞菌的标准中采用的主要是传统生化方法，包括分离培养、生化鉴定等，不能实现大批量水样的快速检测。

近几年，随着科技的发展，检测铜绿假单胞菌的方法多种多样，本文对近年铜绿假单胞菌检测技术进行综述，为铜绿假单胞菌的快速、准确检测研究技术提供参考。

铜绿假单胞菌检测技术国标滤膜法检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》。

铜绿假单胞菌产色素分为三种：产绿脓菌素，产青脓素，产红脓素;铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长;具有氧化酶，可以使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物：可以产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加纳氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色络合物;根据这些生化特性，通过滤膜过滤将铜绿假单胞菌富集到CN琼脂上，再用生化试剂管进行生化鉴定。

也可以用VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定系统用于微生物鉴定，准确率高，可用于微生物实验室的日常检测工作。

实时荧光定量PCR检测外毒素 A 基因在铜绿假单胞菌中高度保守，根据 GenBank 中铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列，设计特异性引物及TaqMan探针，并利用实时荧光 PCR技术，对目标靶序列进行特异性扩增，建立了一套检测食品中铜绿假单胞菌的方法，特异性试验和灵敏性试验良好，该检测方法具有特异、快速的特点，能够满足检测要求，为食品中铜绿假单胞菌的快速检测奠定了基础。

快速检测方法势在必行！！
• 国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测 方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色 培养基法在国外应用相当成功。 • 国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正 在考虑使用国外先进的快速检测技术。 • 从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测 的一大方向。
一、常规微生物快速检测技术现状
荧光酶标记原理
•直接单细胞标记 (包括孢子)
•细胞无增菌要求
•标记在90分钟内完成 •直接对活细胞和酵母进行标记
标记的细菌
标记后的酵母
标记后的霉菌
ChemScan RDI
三个简单的步骤
1. 过滤
2. 标记
3. 激光扫描
检测步骤 - TVC
1. 过滤 2. 标记 3. 激光扫描
样品过滤
预标记
LUM-T的独特优势
• • • • • • CHEF 熟肉制品成熟度检验 MicroQ 水中微生物污染程度检测 Cidelite 杀虫剂残留初筛 Paslite 牛奶巴氏消毒效果 Somalite 体细胞计数 SL/MRL test 抗生素残留检测（连接 ROSA imager)
Charm ATP 检测
表面洁净的检测方法 • 微生物学法：纸片、琼脂板、 棉签拭子、海绵拭子 • 非微生物学法（快速法）： ATP(三磷酸腺苷，蛋白质, 降 解糖、NADP(辅酶II)，其它。
（一）ATP法 ATP---三磷酸腺苷
ATP来源于
细菌 酵母 霉菌 生物膜 组织残留
废弃物污染 人的污染
1. 人接触设备或器具 2. 设备或器具被污染 3. 清洗不正常 4. 非正常的敏感物污染 5. 微生物污染
世界上最好的电化学微生物快速检测产品 Bactrac 4300系统

中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法微生物指标The document was prepared on January 2, 2021中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法微生物指标Standardexaminationmethodsfordrinkingwater一Microbioloical parameters1、菌落总数平皿计数法1.1.1范围本标准规定了用平皿计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数本法适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定。

术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

菌落总数standardplate-count加cteria水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数培养基与试剂营养琼脂成分：A蛋白陈10gB牛肉膏3gC氯化钠5gD琼脂10g——20gE蒸馏水制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为一，分装于玻璃容器中（如用含杂质较多的琼脂时，应先过滤），经kPa(121℃，15lb）灭菌20min，储存于冷暗处备用。

仪器1.1.4.1高压蒸汽灭菌器。

1.1.4.2干热灭菌箱。

1.1.4.3培养箱36℃士2℃。

1.1.4.4电炉。

1.1.4.5天平。

1.1.4.6冰箱。

放大镜或菌落计数器。

pH计或精密pH试纸。

灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等检验步骤生活饮用水门以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注人灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃士1℃培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为水样1ml中的菌落总数水源水以无菌操作方法吸取lml充分混匀的水样，注入盛有9ml、灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:10稀释液。

ｅ ｚｍ ｕ ｓｒ ｔ ｅ ｈ ｄ ｉ ｈ ｒ ｉ ｌ， ａ ｄ ｃｍ ａ ｅ ｕ ｔ— ｕ ｅ ｚ ｍ ｌ ｔ ｃｍ ｔｏ ，ｔ ｅ ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ａ ｈ ｅ ｉ ｓ ｎ ｙ ｅ ｓ ｂ ｔ ａ ｅｍ ｔ ｏ ｎ ｔ ｅ ａ ｔ ｃ ｅ ｎ ｏ ｐ ｒ ｄ ｍ ｌ ｉ ｔ ｂ ｙ ｏ ｙ ｉ ｅ ｈ ｄ ｈ ｅｈ ｏ ｏ ｙ ｈ ｓ ｔ ｅｍ ｒ ｔ ｗ ｔ ｃ ｕ ａ ｅ ｅ ｔ ｒ ｓ ｌ ｓ ｓ ｍ ｌ ｔ ｓ ， ｏ ｖ ｎ ｅ ｔ ｅ ｃ ｉ ｈ ａ ｃ ｒ ｔ ｔ ｓ ｅ ｕ ｔ ， ｉ ｐ ｅ ｅ ｔ ｃ ｎ ｅ ｉ ｎ ， ｔ ．
Ｆａ ｔ ｔ ｃｉ ｎ Ｍ ｅ ｈ ｄ Ａｎ ｌ ｓｓｏ ｌ ｅ ｔ Ｌ ｅ ｕ ｓｒ ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ｚ ｍ ｅ ｓ ｅ ｔｏ ｔ ｏ ａ ｙ ｉ ｆＣｏｉ ｒ ｘ ｄ Ｓ ｂ ｔ ａ ｅＴｅ ｈ ｏ ｏ ｙ Ｅｎ ｙ Ｄｅ ｌ ｆ Ｓ ｂ ｔ ａ ｅＭ ｅｈ ｄ ｕ ｓｒ ｔ ｔ ｏ
杨 琳
（ 东省水 文局 江门水文分局 ，广 东 江 门 ５ ９ ３ 广 ２ ０ ０）
【 摘 要 】文章验证与分析 了固定底物酶底物法检 测水 中的粪大肠 茵群 ，与 多管发酵 法相 比，该技术具有结果准确、测试
简单、方便等优点。 【 关键词 】固定底物酶底物法 ；粪 大肠茵群 ；分析 【 中图分类号 】Ｘ ３ ８２ 【 文献标识码 】Ａ 【 文章编号 】１０ － １ １２ １） ４ ０ ３ － ２ ０ ８ １ ５ （０ ２ ０ － １ １０
置。
Ｄ ｇ ｌ ｃｏ ｙａ ｏ ｉ ｅ （Ｎ Ｇ —ａａｔｐｒｎｓｄ Ｏ Ｐ ）使培养液呈黄色 ，以及 大肠 Ｂ一葡 萄 糖 醛 酸 酶 分 解 ４ｍｔｙ— － ｅ ｈ ｌ
３２ 试验方法 ． 固定底物酶底物法采用 ９ 孔定量盘 ， ７ 此方法是一种基于 Ｍ Ｎ的方法 。 Ｐ 检测所需水样 为 ｌ ＯＬ 用 ｌ Ｏ Ｌ的无菌 取样 瓶 Ｏｍ 。 Ｏｍ

粪大肠菌群检测的结果偏差及影响因素摘要：介绍了目前城镇污水处理消毒后的出水中粪大肠菌群指标的检测方法原理，对检测结果偏差产生的原因进行了分析和阐述，提出了检测过程中的质量保证措施，对基层实验室提高粪大肠菌群检测结果的精确性具有实际指导意义。

关键词：粪大肠菌群；质控；影响因素；偏差目前，粪大肠菌群的检测作为城镇污水处理厂排放标准的重要指标之一，经常被环保督查部门抽检。

而各厂在进行日常出水检测时，也存在着实验室内及实验室间实验结果差异性较大的问题。

由于微生物检测技术、方法、水样等的特殊性，导致影响其检测数值偏差大的因素较多，本文结合实际检测工作，从实验方法、培养基的质量控制、检测环境条件及现场采样等多方面进行分析，阐述这些因素的影响及质控措施。

目前，污水类的粪大肠菌群的检测，常采用多管发酵法、滤膜法和酶底物法。

三种方法的生物学培养机理是相同的，由于使用的培养基成分、培养介质和菌落形成的特征和方式的不同，最终导致了粪大肠菌群检测结果的差异，这是由于检测方法导致的偏差。

下面简单介绍一下这三种常用方法：1 常用粪大肠菌群的检测方法1.1 多管发酵法多管发酵法是以最可能数来表示试验结果的。

实际上它是根据统计学理论估计水体中大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。

如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。

不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阴性又显示阳性的稀释度。

因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。

多管发酵法是先在37度下培养，产酸产气则为阳性，也就是总大肠菌群。

然后再进行复发酵，从37℃培养出来的总大肠菌群，再接种到EC培养基中，45℃下产酸产气的则为粪大肠菌群。

1.2 滤膜法滤膜是一种微孔性薄膜。

将水样注入已被灭菌的放有滤膜（孔径0.45μm）的抽滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜片上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，在44.5℃温度下恒温培养，对微生物细胞染色后，对滤膜上生长的此特性菌落进行计数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群的个数。

环境科学导刊http: //hjkxdk. . cn 2017，36 (5)CN53 -1205/X ISSN1673 -9655固定酶底物法测定水中粪大肠菌群的优点及影响因素杨晓冉，朱超，张付海，胡雅琴，张敏(安徽省环境监测中心站，安徽合肥230061)摘要：使用酶底物法和多管发酵法检测水质中的粪大肠菌群，结果表明，两种方法在统计学上并无 显著差异。

酶底物法具有操作快速简便的优点，检测灵敏度也高于多管发酵法。

酶底物法可以采用成品的 培养基及试剂，操作方便，无需确认试验，20 h即可判断水样中粪大肠菌群的MPN值，实验环境是否无 菌对酶底物法测定水中粪大肠菌群的影响不大，但是培养温度对结果影响较大。

关键词：粪大肠菌群；环境监测；酶底物法；多管发酵法；快速检测；影响因素中图分类号：X83 文献标志码：A文章编号：16乃-9655 (2〇n)05-O O87-〇4粪大肠菌群（Fecalcoliform)主要来自粪便，它在44 ~ 44. 5°C的高温条件下仍可生长繁殖并发 酵乳糖产酸产气，其他特性均与总大肠菌群(Totalcoliform)相同。

因此，可用提高培养温度 的方法造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大 肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。

粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。

目前水中粪大肠杆菌群（耐热大肠菌群）的检测方法主要有传统的多管发酵法和滤膜法，并且 已经列入环保行业标准方法，此两种传统方法被国 内环境检测部门广泛采用。

传统方法实验操做需要 较多的试剂和器材，步骤繁琐，检测周期较长，培 养基保存时间短，阳性结果需验证试验，对实验环 境的无菌程度要求也比较高，不能对水的卫生学状 况做出快速评价，制约了其应用。

固定底物酶底物法利用大肠菌群细菌能产生P -半乳糖苷酶（P-D galactosidase)分解 ONPG (Ortho- nitrophenyl- p - D galactopyranoside)使培养液呈黄色，来判断水样中是否含有大肠菌群、粪大肠菌群（耐热大肠菌群）。

水中粪大肠菌群(耐热大肠菌群)两种检测方法的比较研究摘要：本文采用固定底物酶底物法与传统多管发酵法对水中粪大肠菌群进行比对试验，比较两者检测结果的一致性。

结果表明，两种方法在结果一致性方面相关性好，无统计学意义上的显著性差异，与多管发酵法相比，酶底物法具有简便快速、结果准确、特异、实验过程污染的可能性低、无二次污染等优点。

关键词：固定底物酶底物法多管发酵法粪大肠菌群中图分类号： tq92文献标识码： a 文章编号：comparative study on two detection methods of fecal coliform in water (thermotolerant coliforms )luo yun liuzhou environmental protection monitoring station, guangxi 545001abstract: this paper conducts a comparative test on fecal coliform in water with defined substrate technology(dst) enzyme substrate technique and traditional multiple-tube fermentation technique and compares the consistency of detection results. the result shows that both methods have a good correlation in the consistency of results and there is no significant difference in statistical sense. compared to multiple-tube fermentation technique, enzyme substrate technique has such advantages as simplicity, rapidness,accurate result, specificity, low possibility of pollution in the experimental process and secondary pollution avoided.key words: defined substrate technology(dst) enzyme substrate technique; multiple-tube fermentation technique; fecal coliform粪大肠菌群（耐热大肠菌群）是水质污染的重要指标之一。

固定酶底物法测定生活饮用水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌精密度分析摘要：总大肠菌群目前作为评价水质的一项指标，是反映水样是否受到粪便污染的指标。

固定酶底物法是从美国引进的一种大肠杆菌新型检测方法。

该方法采用酶底物法测定生活饮用水中的总大肠菌群、大肠埃希氏菌，分析了不同浓度水样的精密度，低浓度水样的精密度为，1.6%、2.0%;中浓度水样的精密度为1.3%、1.8%;高浓度水样的精密度为2.0%、4.3%;阳性标准菌株的精密度均为0.86%。

关键词：酶底物法总大肠菌群大肠埃希氏菌精密度微生物常規检测指标为总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌。

它们均可作为检验肠道致病菌的指示菌，是进行卫生学评价的重要内容。

总大肠菌群是指一群在37 ℃培养24 h，能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。

总大肠菌群目前作为评价水质的一项指标，是反映水样是否受到粪便污染的指标[2]。

生活饮用水中针对大肠菌群、大肠埃希菌等的检测技术主要包括乳糖蛋白胨多管发酵法、滤膜法、固体酶底物法[3] ，其中多管发酵法为仲裁法[4]。

固定酶底物法[5]是从美国引进我国的一种大肠杆菌检测方法，此方法简单、方便、快速、无培养基的制作与干扰等优点[6]。

目前被美国、欧洲及大部分亚洲国家广泛应用于水中总大肠菌群、粪大肠菌群（耐热大肠菌群）及大肠埃希氏菌的检测。

并通过美国EPA、《水与废水标准检测方法》以及我国《生活饮用水标准检验方法》认证[7]。

1 实验部分1.1 材料与试剂1.1.1试剂在该实验中酶底物法所用酶底物法检测试剂 MMO-MUG 培养基，无菌定量瓶（带100 mL刻度），51孔定量检测盘均购买于西安立科环保科技有限公司。

1.1.2仪器设备隔水式恒温培养箱型号：GHP-9270，高压蒸汽灭菌器型号：LDZX-50KBS，程控定量封口机型号：LK-2010，手提式暗箱紫外分析仪型号：ZK-5。

1.1.3 标准菌株阳性标准菌株：大肠埃希菌菌种号CMCC（B）44102 来源：南京便诊生物科技有限公司;阴性标准菌株：铜绿假单胞菌菌种号CICC 21636来源：中国工业菌种保藏中心。

广西 南 宁 ５ ０２ ； ３０ ２
摘
要： 采用酶底物法对地表水水样 进行 不同倍数 的稀释后进行培养检测 ， 观察地表水结果 变化 。结果表明 ： 地表水水
样稀释倍数越小 ， 结果越准确。采用酶底物法测定地表水 中的粪大肠菌群具有快速、 简便的特点 ， 准确掌握水样稀释倍 数对测定结果就越准确 。 关键词 ： 酶底物法 ； 地表水 ； 粪大肠菌群 ； 稀释倍数
在培养温度为 ４ ． １ ４５ ℃条件下 ，粪大肠菌群细 ±
速评价。因此 ， 采用快速简便 的检测方法十分必要 。
固定底物技术酶底物法 可以较好的弥补传统方法的 不足。 根据生活饮用水国家卫生标准（ Ｂ ７０１— Ｇ ／ ５５． Ｔ ２
菌 能特 异性 产生 Ｂ 半 乳 糖苷 酶 （ ， — ａ ｃ ｓ 一 １ Ｄ ｇｌ ｔ ｉ ３ ａｏ—
ｄｓ）该生物酶可 以分解 Ｏ Ｐ （ ｒ ０ｎ ｒｐｅｙ ａｅ ， Ｎ Ｇ Ｏ ｔ 一 ｉｏｈｎｌ ｈ ｔ — ｐ Ｄ ｇｌ ｔ ｙ ｎｓ ｅ ｐ 半乳糖醛苷 ） — ．ａ ｃ ｐｒ ｏ ｄ ， 一 ａｏ ａ ｉ ，使培养液
２０ ） ０ ６ 中推荐的固定底物酶底物法 ， 可购买到市售化 呈黄色。实验步骤如下 。 （） １采用 １０ Ｌ ０ ｍ 无菌取样瓶 ， １０ Ｌ 取 ０ ｍ 混匀水样 产 品 美 国爱 德 士 生 物 科 技 股 份 有 限公 司 的科 立 得
（ ３ 鞴衫
行 封装 。 ’
水样倒 ＾ 、 无菌培养定量 ５ 孔） 盘（１ 。
Hale Waihona Puke （） ４ 采用带 ５ 孔定量盘橡胶托垫在封 口机上进 １ （） ５ 把封装好的 ５ 孔定量盘放人 ４ ． １ 恒温 １ ４ ＋ｏ ５ Ｃ
培养箱 中培养 ２ｈ ４。 （） ６ 培养 ２ｈ ， ４ 后 从培养箱中取出 ， ５ 孔阳性 与 １ 标准比色盘进行比较 ， 黄色孔颜色比５ 孔阳性标准比 １ 色盘深的表明为阳性反应 ， 根据 ５ 孔定量盘上的阳性 １ 孑数， Ｌ 对照 ＩＥ Ｘ公司提供的 Ｍ Ｎ表， 出结果。 ＤＸ Ｐ 报