GS0202菌产人参皂苷_葡萄糖苷酶条件及其酶的反应条件

糖苷酶转化人参皂苷的研究人参皂苷是一种具有多种药理作用的天然产物，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化等。

由于人参皂苷的结构复杂，传统的方法合成难度较大，因此寻求新的合成方法一直是研究的热点。

糖苷酶是一种能够催化糖苷类化合物水解和合成的酶，近年来越来越多的研究利用糖苷酶转化人参皂苷。

本文将探讨糖苷酶转化人参皂苷的研究现状、方法、结果及未来研究方向。

糖苷酶转化人参皂苷的研究起步较晚，但进展迅速。

已有的研究主要集中在寻找高效、特异的糖苷酶，以及优化反应条件等方面。

目前，研究者已经成功地利用糖苷酶将人参皂苷元转化为多种人参皂苷，但仍存在转化效率低、产物结构不明确等问题。

本研究采用微生物发酵的方法，从土壤中分离得到一株产糖苷酶的菌株，通过平板筛选和液体发酵试验，确定其产糖苷酶的能力。

随后，我们将人参皂苷元作为底物，在最优反应条件下进行转化实验，并对产物进行分离、纯化和结构鉴定。

在优化反应条件下，该菌株所产糖苷酶可将人参皂苷元成功转化为一种或多种人参皂苷，转化率达到60%～80%，产物结构通过核磁共振等手段得以明确。

我们还对该菌株产糖苷酶的动力学特性进行了研究，发现其具有较高的催化效率和良好的热稳定性。

本研究成功地利用糖苷酶将人参皂苷元转化为多种人参皂苷，转化率较高且产物结构明确。

然而，与已有研究相比，本研究的转化效率仍有待提高。

我们推测，这可能是由于底物浓度、酶浓度、反应时间等反应条件不够优化导致的。

因此，进一步优化反应条件，提高转化效率和产物纯度将是未来研究的重要方向。

本研究仅对菌株产糖苷酶的能力进行了初步鉴定，未对其作用机制和分子特性进行深入探讨。

未来研究可以围绕糖苷酶的分子特性、作用机制等方面展开，以期为提高转化效率和产物纯度提供更多理论依据。

本研究成功利用糖苷酶将人参皂苷元转化为多种人参皂苷，转化率较高且产物结构明确。

然而，本研究仍存在转化效率有待进一步提高等问题。

未来研究应进一步优化反应条件，提高转化效率和产物纯度，并深入探讨糖苷酶的分子特性和作用机制，为解决目前研究的不足之处提供更多理论依据和实践指导。

酶法转化二醇型人参皂甙Rd及制备稀有人参皂甙C-K张阳;林毅【摘要】利用蜗牛酶酶法对二醇型人参皂甙Rd进行转化,并制备稀有人参皂甙C-K.采用薄层色谱和高效液相色谱法,对转化产物及酶反应相关影响因素进行检测.结果发现:在酶量为166.7μkat·g-1,pH值为5.0,温度为40℃的恒温水浴9h的条件下,酶解人参皂甙Rd可得稀有人参皂甙C-K.在此基础上,研究得到酶反应的最适条件范围:酶量为500.1～833.5μkat·g-1,pH值为3～5,温度为40～50℃,反应时间为6～24h.%Rare ginsenoside C-K was prepared using enzymatic transformation with snailase from protopanaxadiol ginsen-oside Rd. Products and influencing factors of enzymatic transformation were examined by TLC and HPLC. The results showed that rare ginsenoside C-K could be obtained at the following conditions: enzyme amount 166. 7μkat ? G-1, Ph 5. 0, thermostatic water bath at 40 'C for 9 h. Based on that, the optimum ranges of enzyme amount, Ph value, temperature and reaction time were further determined as 500.1~833. 5 μkat ? G-1, Ph 3~5, 40~50 ℃, 6~24 h, respectively.【期刊名称】《华侨大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(032)006【总页数】4页(P668-671)【关键词】酶法转化;二醇型人参皂甙Rd;稀有人参皂甙C-K;蜗牛酶【作者】张阳;林毅【作者单位】华侨大学化工学院,福建泉州362021;华侨大学化工学院,福建泉州362021【正文语种】中文【中图分类】Q541人参皂甙作为人参的主要有效成分，具有广泛的药理作用［1］.稀有人参皂甙C－K是二醇型人参皂甙在人体肠道内经肠道菌的去糖基化后的主要代谢产物和最终吸收形式.它在许多方面都体现了良好的生物活性，尤其在抗肿瘤方面，在体内外均具有良好的抑制癌细胞生长、转移、诱导细胞凋亡等作用［2-3］，现己成为人参皂甙研究的新热点.1996年，Hasegawa等［4-5］运用体外厌氧培养人肠道菌群技术，对人参皂甙的肠道菌代谢过程进行了系统研究，提出了Rb1，Rb2和Rc降解到C－K的具体代谢途径，尤其是深入研究Rb1的代谢途径.目前，利用二醇型人参皂甙Rb1通过酶转化法制取C－K已有很多相关报道，但对于二醇型人参皂甙Rd的研究大多集中在人参皂甙Rd提取、含量测定及药理药效等方面的研究［6］，并未见以人参皂甙Rd为直接底物酶法转化制备稀有人参皂C－K的报道 .鉴于此，本文将利用蜗牛酶对人参皂甙Rd进行转化，并制备人参皂甙C－K.人参皂甙C－K标品（纯度大于98.8%，吉林长春三和参业科技有限公司）；蜗牛酶粗酶（福建漳州金田生物科技公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；高效硅胶板（山东青岛裕民源硅胶试剂厂）；其他试剂均为分析纯.1.2.1 酶活的测定取500μL酶溶液于离心管中，40℃恒温水浴中预热3min；然后，加入1mL，1 mg·mL－1的人参皂甙Rd，及4.0mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，于40℃反应10min，再加入4.5 mL色谱级甲醇终止反应，经高效液相色谱（HPLC）测定稀有人参皂甙C－K的含量.酶活力单位（kat）：在40℃，pH＝5.0的条件下，每分钟生成1μmoL稀有人参皂甙C－K所需酶量定义为1个酶活力单位.经测定，蜗牛酶的β－葡萄糖苷酶酶活为309.56μkat·L－1.1.2.2 蜗牛酶酶解人参皂甙Rd的酶转化反应取5mg人参皂甙Rd，加入1mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液溶解，按166.7μkat·g－1的量加入蜗牛酶，混匀；于40℃下恒温水浴9h.终止反应后，进行薄层层析色谱（TLC）检测.1.2.3 薄层层析色谱检测用微量点样器吸取标品及酶解产物溶液，分别点样于薄层板的起始线上，点样次数依据样品浓度确定，每次点样后需用电吹风迅速吹干.将薄层板浸入展开剂（CHCl3－AcOEt－MeOH－H2O＝15∶40∶30∶20），液下层的深度为距薄层板底边1.0cm左右.展开后，取出，吹干，均匀喷以10%的硫酸－乙醇显色剂，于110℃下显色10min，经凝胶成像系统检测结果.1.2.4 高效液相色谱检测在酶解产物中加入反应物1／2体积的正丁醇萃取3次，合并萃取液，挥干；然后，置于10mL容量瓶中，加色谱纯甲醇至刻度，过膜，做高效液相色谱（HPLC）检测.色谱条件：色谱柱选用C18柱Dimension（150mm×4.6mm）；UV检测器；检测波长为203nm；柱温为35℃；流动相为乙腈－水（48∶52）；流速为1.0mL·min－1，进样量为20μL.人参皂甙Rd酶解产物的TLC检测，结果如图1所示 .图1中：编号1～4样品分别为人参皂甙C－K标品，人参皂甙Rd，酶解产物，酶解产物和人参皂甙C－K标品的混合物.从图1可看出，酶解产物与人参皂甙C－K标品有相同Rf值点，与人参皂甙Rd无相同Rf值点.比较酶解产物、酶解产物与人参皂甙C－K标品混合物的图谱可知，混合物中无新Rf值点出现，且混合物与人参皂甙C－K标品同Rf值点的深浅与大小增加.这表明，在酶量为166.7 μkat·g－1，pH＝5.0，40℃恒温水浴9h的酶解条件下，酶解产物中不存在人参皂甙Rd，即已为蜗牛酶水解 .该酶水解人参皂甙Rd的糖基，主要转化为目标产物人参皂甙C－K，还有少量中间产物，转化率较高.人参皂甙Rd酶解产物的HPLC检测，结果如图2所示.样品的保留时间为21.005min，与文献上的人参皂甙C－K数据一致［7］.由于所用流动相为乙腈和水，而溶剂为甲醇所以存在前端杂峰，除溶剂峰之外另有其他杂质峰，说明人参皂甙Rd在本文所述条件下的产物并不单一，与TLC分析结果相符合.2.3.1 不同酶加入量的酶转化反应取5份2mg的人参皂甙Rd，加入1mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，分别加入不同酶量的蜗牛酶，混匀，于40℃恒温水浴9h，终止反应后进行TLC检测，结果如图3（a）所示.图3（a）中：编号1为人参皂甙C－K标品；2～6样品的蜗牛酶酶量分别为166.7，333.4，500.1，666.8，833.5μkat·g－1 .从图3（a）可以看出，当酶量为166.7，333.4 μkat·g－1时，由于酶量不足，故斑点大小与深浅较之酶量为500.1，663.8，833.5μkat·g－1的斑点略小且浅 .酶量增加，产物浓度随之增加，但当酶量为500.1，663.8，833.5μkat·g－1时，这三者的斑点并无较大变化，即此基础上酶量的增加对酶转化反应影响不大.说明酶降解的速度和数量与底物及酶的量有直接关系，结果与酶促反应动力学结论一致.在pH＝5.0，40℃的恒温水浴9h酶解条件下，500.1～833.5μkat·g－1的酶量应为该反应最适酶量范围.2.3.2 不同pH值的酶转化反应取7份2mg的人参皂甙Rd，分别加入1mL不同pH值的磷酸柠檬酸缓冲液，按166.7μkat·g－1加入蜗牛酶，混匀，于40℃恒温水浴9h，终止反应后进行TLC检测，结果如图3（b）所示.图3（b）中：编号1为人参皂甙C－K标品；2～8样品的pH 值分别为2.6，3.2，3.8，4.4，5.0，5.6，6.2.从图3（b）可以看出，当反应pH 值大于5.6或pH 值小于3.2时，对酶转化反应影响较大.究其原因可能是过高或过低的pH值影响了酶蛋白的结构和功能，导致了酶催化活性的下降.检测结果说明：蜗牛酶在pH＝3～5稳定，高于或低于此范围，酶活力明显降低，对酶解反应影响较大.这表明，酶量为166.7μkat·g－1，于40℃恒温水浴9h的酶解条件下，该反应最适pH范围为3～5.2.3.3 不同反应温度的酶转化反应取5份2mg的人参皂甙Rd，分别加入1mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，按166.7μkat·g－1加入蜗牛酶，混匀，于不同温度条件下恒温水浴9h，终止反应后进行TLC检测，结果如图3（c）所示.图3（c）中：编号1为人参皂甙C－K标品；2～6样品的反应温度分别为30，35，40，45，50℃.从图3（b）可以看出，当反应温度为30，35℃时，温度较低，导致酶活力降低，使得酶反应速度较慢，目标产物较少，对酶解反应影响较大；随着温度的升高酶活力增大，但在40～50℃温度范围内，温度对酶解反应无较大影响.这表明，在酶量为166.7μkat·g－1，pH＝5.0，恒温水浴9h酶解条件下，该酶解反应最适温度范围为40～50℃.2.3.4 不同反应时间的酶转化反应取7份2mg的人参皂甙Rd，分别加入1mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，按166.7μkat·g－1加入蜗牛酶，混匀，于40℃恒温下水浴反应不同时间，终止反应后进行TLC检测，结果如图3（d）所示.图3（d）中：编号1为人参皂甙C－K标品；2～8样品的反应时间分别为6，9，12，15，18，21，24h.从图3（d）可以看出，当反应时间在6～24h范围内，不同的反应时间对酶转化反应影响不大，且酶解反应在此时间范围内均有较高转化率，说明蜗牛酶酶解时间短，转化效率高.在酶量166.7μkat·g－1，pH＝5.0，40℃酶解条件下，该酶解反应最适时间范围为6～24h.利用生物转化法对天然产物进行生物转化或结构修饰，是当今研究的热点.文中研究表明：利用蜗牛酶粗酶可将含量较高的天然皂甙人参皂甙Rd转化为经济价值更大、更具生物活性的稀有人参皂甙C－K.所用蜗牛酶粗酶转化效果良好，价格低廉，约为精制蜗牛酶制剂价格的1／5，蜗牛酶粗酶的选用大大降低了酶在生产成本中的比例.工业酶制剂转化法既可以减少制备工艺的繁琐，又可避免过多副产物的生成，便于产物的分离纯化.明艳林［7］曾选用果胶酶、纤维素酶、β－葡萄糖苷酶、蜗牛酶、柚皮苷酶和木聚糖酶等6种酶酶解转化二醇组皂甙Rb1获取稀有人参皂甙C－K.研究结果发现：在同等条件下，蜗牛酶是6种酶中转化效率最高的酶，且中间产物少，酶解转化完全.这6种酶为酶解转化皂甙类物质常用酶，基于蜗牛酶酶解特点，文中选用蜗牛酶来进行酶解转化.人参皂甙Rd分子中糖基的连接键是β－糖苷键，酶解过程中，蜗牛酶中所含β－葡萄糖苷酶水解人参皂甙Rd分子上的C－20位和C－3位糖苷键，主要产物为稀有人参皂甙C－K.迄今，二醇型人参皂甙代谢成C－K的途径已基本明了，尤其对于Rb1代谢到C－K的具体途径研究的较为清楚.依据文献［7－8］，推测人参皂甙Rd代谢至C－K途径如下：人参皂甙Rd C－3位末端糖苷键断裂，失去一份子葡萄糖，形成F2；然后，F2进一步代谢，C－3位末端糖苷键断裂，失去一分子葡萄糖，形成稀有人参皂甙C－K.人参皂甙Rd代谢成C－K的具体过程，有待进一步验证.1976年，日本学者Nagai等从绞股蓝中分离出84种皂甙类物质.其中Ⅲ，Ⅳ，Ⅷ，，Ⅻ分别与人参皂甙Rb1，Rb3，Rd，F2化学结构完全相同［9-10］.绞股蓝中的总皂甙含量是人参皂甙的3倍，其人参皂甙Rd含量是人参的8倍［11］，理论上可利用绞股蓝制取C－K.我国绞股蓝资源丰富，且绞股蓝相对人参价格要廉价很多，以绞股蓝作为原料可以大大降低成本，更适于工业化生产.目前，仅有少量文献报道有利用酸法水解绞股蓝皂甙［12］获得抗癌药物，但酸法水解副产物多，难于分离纯化并且污染环境.除此之外，绞股蓝的研究更多的仅仅体现在对绞股蓝总皂甙基础研究和简单的开发利用层面，并没有太多深层次的开发产品问世.本实验利用蜗牛酶粗酶转化二醇型人参皂甙Rd并制取稀有人参皂甙C－K，为绞股蓝的深度利用奠定了基础.【相关文献】［1］王本祥.人参的研究［M］.天津：天津科学技术出版社，1985：107.［2］弓晓杰.人参皂苷酶代谢产物化学修饰及其抗癌活性研究［D］.吉林：吉林农业大学，2004. ［3］周伟，周珮.稀有人参皂苷Compound K研究进展［J］.药学学报，2007，42（9）：917－923.［4］HASEGAWA H，SUNG J H，MATSUMIYA S，et al.Main ginseng saponin metabolites formed by intestinal bacteria［J］.Planta Med，1996，62（5）：453－457.［5］HASEGAWA H，SUNG J H，BENNO Y.Role of human intestinal prevotella oris in hydrolyzing ginseng saponins［J］.Planta Med，1997，63（5）：436－440.［6］周超群.人参皂甙 Rd的研究进展［J］.中草药，2009，40（5）：832－836.［7］明艳林.人参皂甙肠道代谢物IH－901抗肝癌分子靶点研究［D］.厦门：厦门大学，2007. ［8］周伟.稀有人参皂甙Compound－K的制备和活性研究［D］.上海：复旦大学，2008. ［9］朴香兰，吴倩.绞股蓝研究进展［J］.时珍国医国药，2010，21（7）：1758－1760. ［10］刘欣，叶文才，萧文鸾，等.绞股蓝的化学成分研究［J］.中国药科大学学报，2003，34（1）：21－23.［11］岳琳娜，高学玲，岳鹏翔.绞股蓝有效成分的研究进展［J］.饮料工业，2008，11（6）：9－12.［12］许志超，韩凌，赵余庆.绞股蓝总皂苷水解产物中稀有抗肿瘤活性成分的化学［J］.亚太传统医药，2008，4（11）：41－43.。

超分子化学在生物化学及医药学中的应用陈琦【摘要】简要介绍了超分子化学的概念、产生、发展及应用.详细介绍了:(1)生物超分子配体稀有人参皂素苷的制取及应用;(2)大三环冠醚配体与π-延展的双吡啶盐超分子配合物的合成性质及应用;(3)超分子配体有机多孔材料对气体分子的选择性吸附及分离.并对超分子化学的发展进行了展望.【期刊名称】《合成材料老化与应用》【年(卷),期】2016(045)003【总页数】5页(P136-140)【关键词】超分子化学;配体;应用【作者】陈琦【作者单位】宝鸡文理学院化学化工学院,陕西宝鸡721013【正文语种】中文【中图分类】TQ61超分子化学是化学与生物学、物理学、配位化学、生命科学、生物化学、生物物理、材料科学、信息科学、环境科学和能源科学等多门学科相互渗透、交叉融合而形成的一门新兴热门边缘学科，又称主-客体化学。

超分子化学的产生和发展促进了上述相关学科的形成和发展，彼此相互促进，相得益彰。

为了表彰C.J.Pedersen(佩德森)、J.M.Lehn(莱恩)、D.J.Cram(克拉姆)三化学家对超分子化学概念的提出、形成、发展所完成的开创性工作，这三位科学家共享1987年诺贝尔化学奖。

超分子化学起源于1967年佩德森首次合成和发现冠醚，超分子化学的概念源于被称为“超分子化学之父”的莱恩1987年在获诺贝尔化学奖的演讲中提出了的。

莱恩说：“超分子化学是研究由二种或二种以上化学物质通过非共价键的分子间作用力缔合而成的具有特定结构和特殊功能的超越分子体系的科学”。

因而超分子化学是共价键分子化学发展过程的一次升华，即被称之为“超越分子概念的化学”。

后来克拉姆又称之为“主-客体化学”。

超分子化学的形成淡化了四大基础化学、生物化学、材料化学之间的界线，着重强调了具有特定结构和功能的超分子体系，将四大基础化学有机的融为一体，从而为21世纪的热点学科如分子器件、分子自组装、新兴材料科学、生命科学、信息科学、环境科学、能源科学、生物化学、医药学、纳米科学、大环化学等的形成和发展开辟了一条崭新的通道，被誉为21世纪新思想、新概念、新技术的重要源头之一，是朝阳科学，并为21世纪化学学科的发展提供了一个重要而崭新的研究方向。

人参皂苷Rh 2葡萄糖基转移酶活性测定体系的建立何彦平,岳才军3　(黑龙江八一农垦大学,黑龙江大庆163319)摘要　[目的]建立人参细胞中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG ):人参皂苷Rh 2葡萄糖基转移酶(UGRh 2GT )活性测定体系。

[方法]以人参皂苷Rh 2为底物,以UDPG 为葡萄糖供体,选取合适的温度和pH 值,用提取的人参细胞酶液催化Rh 2生成Rg 3,采用高效液相色谱法(HP LC )测定Rg 3的生成量,色谱柱为C18柱(150mm ×4.6mm ),流动相为乙腈和水,梯度洗脱。

[结果]人参细胞中UGRh 2GT 活性测定体系的最优pH 值是9.3,最优温度是34.1℃。

[结论]建立的酶活测定体系能够较好较方便地测定UGRh 2GT 的比活。

关键词　人参细胞;葡萄糖基转移酶;高效液相色谱;二次饱和D 2最优设计中图分类号　S567.5+1 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2010)11-05525-03Establish ment of M easurement System of Acti v ity of G i nsenosi de Rh 2Glycosyltransferase HE Yan 2pi n g et al (Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing,Heil ongjiang 163319)Abstract [Objective ]The ai m was to establish activity assay system of uridine 5′2diphos phoglucose (UDPG ):ginsenoside Rh 2Glycosyltrans 2ferase (UGRh 2GT )of ginseng cells .[Method ]W ith UDPG as the glucose donor,Ginsenoside Rh 2has been catalyzed to Rg 3by enzy mes which have been extracted from ginseng sus pensi on cells at appropriate temperature and pH.The amount of generated ginsenoside Rg 3has been deter 2m ined by high perf or mance liquid chr omatography (HP LC ).The analytical colu mn was C18(150×4.6mmol/L ).Mobile phases were acetoni 2trile and water with gradient elution .[Result]I n the activity assay system of UGRh 2GT of ginseng cells,the opti mum pH value is 9.3,the op ti 2mal temperature is 34.1℃.[Conclusi on ]The method of activity assay can deter m ine the activity of UG Rh 2GT more easily .Key words Ginseng cell;Glycosyltransferase;High 2perf or mance liquid chr omat ography;Quadratic saturation D 2op ti mu m regression design基金项目　黑龙江省2009年研究生创新科研基金项目(YJSCX20092118HLJ );黑龙江八一农垦大学科研启动基金项目(校启B2005210)。

江苏农业学报(Jiangsu J.of Agr.Sci.),2013,29(1):33~38h ttp://www.js n y x 李东霄,邓小莉,王改霞,等.酵母菌对高含量人参皂苷的转化及其分子鉴定[J].江苏农业学报,2013,29(1):33⁃38.doi:10.3969/j.issn.1000⁃4440.2013.01.006酵母菌对高含量人参皂苷的转化及其分子鉴定李东霄1,　邓小莉2,　王改霞1,　扈国达1,　常景玲1(1.河南科技学院生命科技学院,河南新乡453003;2.新乡学院生命科学与技术系,河南新乡453003)收稿日期:2012⁃07⁃23基金项目:河南省教育厅自然科学研究项目(2009B180006);河南省科技厅重点科技攻关项目(082102220001)作者简介:李东霄(1968⁃),男,河南新乡人,博士,副教授,研究方向为生物工程㊂(Tel)0373⁃3040337;(E⁃mail)dongxiao93@通讯作者:常景玲,(Tel)0373⁃3040037;(E⁃mail)changjingling@hist. 摘要:　人参皂苷尤其是稀有人参皂苷具有重要的药理活性,但在人参中含量极其稀少㊂本研究运用高效液相色谱技术,对两株酵母发酵液的粗酶提取物转化高含量人参皂苷Rb 1和Rc 生成稀有皂苷Rd 和Rg 3进行了分析,并通过对酵母菌株18S rDNA 的克隆和序列分析对以上菌种进行了初步分类鉴定㊂结果显示,两株酵母菌均可产生水解Rb 1生成Rd 及其他产物的人参皂苷糖苷酶,也均可产生水解Rc 形成Rg 3及其他产物的人参皂苷糖苷酶;Rc转化形成Rg 3并非Rc 转化的主要途径;两株酵母菌株在分类地位上均属于酵母菌属㊂关键词:　生物转化;人参皂苷;高效液相色谱;18S rDNA中图分类号:　Q933 文献标识码:　A 文章编号:　1000⁃4440(2013)01⁃0033⁃06Bioconversion of major ginsenosides by two yeast strains and their molecular identificationLI Dong⁃xiao 1,　DENG Xiao⁃li 2,　WANG Gai⁃xia 1,　HU Guo⁃da 1,　CHANG Jing⁃ling(1.College of Life Science and Technology ,Henan Institute of Science and Technology ,Xinxiang 453003,China ;2.Department of Life Science and Tech⁃nology ,Xinxiang University ,Xinxiang 453003,China ) Abstract :　The pharmaceutical activities of minor ginsenosides are found to be superior to those of the major ones,butthey are present in ginseng only in small percentages.In this study,the crude enzymes extracted from two yeast strains were used to hydrolyze the major ginsenosides Rb 1and Rc,and the contents of Rb 1and Rc and their metabolites were analyzed by high performance liquid chromatogrphy.18S rDNA sequences of the yeast strains were cloned and analyzed.Two yeast strains both produced ginsenoside glycosidases which could convert ginsenosides Rb 1to Rd and Rc to Rg 3.The conversion of Rc toRg 3was not the major way to hydrolyze Rc.The phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequences of the two yeast strains and other ten yeast species which belong to different genera retrieved from GenBank revealed that the 18S rDNA sequences of the two yeast strains were highly homologous to that of Saccharomyces cerevisiae .They belong to Saccharomyces genus.Key words :　bioconversion;ginsenoside;high performance liquid chromatography (HPLC);18S rDNA 人参(Panax ginseng Meyer)是珍贵的传统中药,应用于中医临床已有两千多年的历史㊂人参的主要活性成分是人参皂苷(Ginsenoside),其中,原人参二醇类皂苷属于达玛烷型四环三萜皂苷,主要包括Rb 1㊁Rc㊁Rd㊁Rg 3以及Rh 2等单体[1]㊂这些单体的结构差异仅表现为在C3和C20位上的糖基侧链不同,但显示出的药理活性却大相径庭[2⁃11]㊂在人参根中Rb 1㊁Rc 和其他3种皂苷单体Rb 2㊁Re 和Rg 1的含量占人参皂苷总量的80%以上,而Rd㊁Rg 3和Rh 2虽含量极低(被称为稀有皂苷),但药理活性更强[12]㊂因此,稀有皂苷成为国内外主要研究开发对象㊂3. All Rights Reserved.人参皂苷在人参代谢过程中的机理还不明确,无法在生长过程中予以控制以定向积累稀有人参皂苷㊂研究者常通过将含量较高的多糖基人参皂苷Rb1和Rc水解以获得低糖基的Rd㊁Rg3或Rh2等稀有皂苷㊂目前,已有利用微生物或动植物代谢过程中产生的能水解人参皂苷糖苷键的糖基水解酶为催化剂,定向转化生成稀有皂苷的技术方法㊂研究中涉及的微生物类型主要是细菌和霉菌[12⁃15]㊂也有从人参中分离出人参皂苷水解酶以及使用动物消化酶进行研究的报道[16⁃18]㊂此外,还有使用真菌进行微生物转化的研究报道[19⁃20]㊂研究中发现的人参皂苷糖苷酶多为人参皂苷Rb1水解酶,其水解产物主要为Rd[12,14,18],此外还有可将Rg3水解生成Rh2的人参皂苷糖苷酶[13,16]以及从人参根中分离纯化出的能将Rc水解生成Rd的人参皂苷⁃α⁃阿拉伯糖苷酶[17]㊂目前尽管已从微生物或动植物中发现或分离出人参皂苷糖苷酶,但仍然存在产酶菌株少㊁产酶率低以及转化结果不稳定等问题㊂尽管有研究报道扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和异常毕赤酵母(Pichia anomala)具有转化人参皂苷Rb1和人参二醇系的活性,但报道中并未详细说明两者代谢转化的具体反应情况[19]㊂本研究以实验室筛选保存的两株酵母菌为试验菌株,通过高效液相色谱(HPLC)研究其生物转化非稀有人参皂苷形成稀有皂苷的效果,并通过对两株酵母的18S rDNA序列进行克隆与分析,对其进行分子鉴定㊂1　材料与方法1.1　材料与试剂酵母菌YS1和YS2由河南科技学院发酵工程实验室保存;人参皂苷标准品Rb1㊁Rc㊁Rd及Rg3由成都曼斯特生物科技有限公司生产,纯度98%以上;乙腈㊁磷酸㊁甲醇均为色谱纯,其余试剂均为分析纯;酵母基因组DNA提取试剂盒由Solarbio公司生产;通用引物EF3㊁EF4由英俊生物技术有限公司合成;PCR buffer㊁Taq酶㊁dNTP由宝生物(大连)生物工程有限公司生产㊂1.2　仪器与设备LC⁃2010C型高效液相色谱仪由日本岛津生产; PCR仪为T⁃Gradient,由德国Biometra公司生产㊂1.3　实验方法1.3.1　培养基配制　PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15~20g,加水定容至1000ml㊂YPD 培养基:1%酵母浸膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖㊂两种培养基均在115℃㊁0.1MPa高压灭菌20min㊂1.3.2　菌种活化及菌体发酵培养　将保存的菌种接到PDA斜面培养基上,放入恒温培养箱中于30℃培养40h左右,至斜面培养基上长出大量菌体为止㊂将活化后的菌种接种到250ml YPD培养基中,酵母菌YS1和YS2分别在30℃和36℃条件下, 160r/min摇床振荡培养48h,获得发酵液㊂1.3.3　酶液制备　发酵液过滤后,15℃㊁10000 r/min离心20min,去除菌体沉淀,收集上清液㊂于25℃边搅拌上清液边缓慢加入硫酸铵粉末至70%饱和度,4℃下静置过夜,然后于4℃㊁13000r/min 离心20min,弃上清,收集蛋白质沉淀㊂沉淀用8ml 0.02mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.0)溶解后装入透析袋,用相同的缓冲液透析24h㊂透析后,15℃㊁13000r/min离心10min,上清液即为粗酶液㊂1.3.4　酶液与底物的反应　精确称取Rb1和Rc标准品,用0.02mol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)配成浓度分别为1.70mg/ml和2.04mg/ml的底物反应液,各取140μl与1ml酶液混合,于40℃条件下反应24 h,然后于100℃水浴中放置15min,终止反应㊂1.3.5　高效液相色谱(HPLC)检测1.3.5.1　样品液的制备　将终止反应后的试验组和对照组(未与酶液反应的底物反应液)于60℃下烘干,溶于700μl95%甲醇后,8000r/min离心10 min㊂用注射器吸取上清液,经0.45μm针式滤器过滤后存储于样品瓶中待测㊂1.3.5.2　高效液相色谱分析条件　色谱柱C18 4.6mm×150.0mm,检测波长为203nm,进样量4μl,柱温35℃,流速1ml/min,流动相梯度如下: 0~23min乙腈∶磷酸水(体积比)=32∶68;23~80 min乙腈∶磷酸水(体积比)=47∶53㊂1.3.5.3　人参皂苷标准曲线的制作及转化率计算　分别精密量取标准品人参皂苷Rb12.070mg/ml㊁Rc 2.010mg/ml㊁Rd2.450mg/ml及Rg32.370mg/ml,置于离心管中,吸取适量95%的甲醇,振荡使人参皂苷标准品完全溶解,8000r/min离心10min,再经0.45μm有机系滤头过滤后装入样品瓶中;精确取适量上述标准品溶液,Rb1浓度分别稀释为1.035000 mg/ml㊁0.207000mg/ml㊁0.103500mg/ml㊁0.05125043江苏农业学报　2013年第29卷第1期. All Rights Reserved.mg/ml和0.005125mg/ml;Rc浓度分别稀释为1.00050mg/ml㊁0.20100mg/ml㊁0.13400mg/ml㊁0.10050mg/ml和0.05025mg/ml;Rd终浓度分别为0.81700mg/ml㊁0.36750mg/ml㊁0.24500 mg/ml㊁0.12250mg/ml和0.06125mg/ml;Rg3终浓度分别为1.185000mg/ml㊁0.355500mg/ml㊁0.118500mg/ml㊁0.059250mg/ml和0.005925 mg/ml㊂按照上述色谱分析条件经高效液相仪分析㊂利用LC⁃Solution软件以测得的人参皂苷峰面积为横坐标x,浓度为纵坐标Y,进行回归处理,得到下列回归方程㊂Rb1标准曲线回归方程为:Y=3.374×10-7x-1.432×10-2,r=0.9994;Rc标准曲线回归方程为:Y=3.684×10-7x-1.058×10-2,r=0.9992;Rd标准曲线回归方程为:Y=2.583×10-7x+ 8.075×10-3,r=0.9998;Rg3标准曲线回归方程为:Y=2.280×10-7x+ 1.648×10-4,r=0.9992㊂回归方程显示,上述皂苷在相关范围内具有良好的线性关系㊂样品液经HPLC检测后,根据标准曲线计算得到反应前后各种成分的含量,由底物的含量变化计算各种底物的转化率;由产物的生成量得到该产物的摩尔数(生成量/摩尔质量),再根据产物与底物的摩尔数之比(1∶1)得到转化底物的摩尔数和含量(摩尔数×摩尔质量),此结果与总底物量的比率即为形成该产物的转化率㊂1.3.6　酵母核基因组提取　将酵母菌接种到YPD 培养基中,YS1和YS2分别在30℃和36℃条件下培养16~18h,至对数生长期,使用酵母基因组提取试剂盒,按照说明书操作㊂1.3.7　酵母菌18S rDNA基因片段的克隆及测序　扩增引物为通用引物EF3㊁EF4,EF3:5′⁃TCCTCTA⁃AATGACCAAGTTTG⁃3′,EF4:5′⁃GGAAGGGRTG⁃TATTTATTAG⁃3′㊂PCR反应体系(20.0μl):超纯水13.4μl,10×PCR缓冲液2.0μl,dNTP0.3μl,引物各1.0μl,Taq酶0.3μl,模板DNA2.0μl㊂反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性45s,51℃退火1min,72℃延伸2min,共30个循环,最后72℃延伸10min㊂PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,由英俊生物技术有限公司测序㊂2　结果与分析2.1　酵母菌对人参皂苷Rb1的转化两株酵母菌发酵液粗酶提取物转化分解Rb1的反应结果见图1㊂图1显示,酵母菌YS1酶解产物中有Rd和Rg3生成,少量Rb1未发生反应㊂酵母菌YS2的酶解产物只有Rd,而没有Rg3生成,但Rb1基本完全发生转化㊂根据标准曲线测得反应前后各种成分的含量,如表1所示㊂图1　人参皂苷Rb1酶解色谱图Fig.1　High performance liquid chromatogram of ginsenoside Rb1metabolites by enzymolysis 从表1可知,酵母菌YS1和YS2均可产生能水解人参皂苷Rb1的人参皂苷糖苷酶,在YS2的作用下,Rb1完全被转化,YS1和YS2菌株实际的转化率分别达到了97.5%和100.0%㊂YS1和YS2的酶解产物中均有Rd(表1),转化率分别约为62.0%和24.0%㊂此外,只有酵母菌YS1的酶解产物中有Rg3形成(表1),转化率约为2.0%㊂2.2　酵母菌对人参皂苷Rc的转化YS1和YS2两株酵母菌粗酶提取物对Rc的转化分解见图2,两株酵母的酶解产物中均有稀有皂苷Rg3生成,部分Rc未发生反应㊂根据标准曲线测得反应前后各种成分的含量如表2所示,两53李东霄等:酵母菌对高含量人参皂苷的转化及其分子鉴定. All Rights Reserved.株酵母菌代谢产物中均含有能水解人参皂苷Rc 的人参皂苷糖苷酶,转化率分别达65.2%和76.1%;在两株酵母菌的酶解产物中均未检测到Rd,但都有Rg3形成,表明存在可将Rc转化形成Rg3的人参皂苷糖苷酶,且两者的转化率相近,分别约为2.0%和2.4%㊂从转化率可知,Rc转化形成Rg3并非Rc转化的主要途径,Rc还存在其他的代谢途径㊂表1　人参皂苷Rb1酶解反应前后各种成分含量Table1　The contents of ginsenoside Rb1and its metabolites before and after enzymolysis酵母菌株反应前Rb1反应后Rb1Rd Rg3(mg/ml)YS10.3400.0010.1800.006 YS20.34000.0700图2　人参皂苷Rc酶解色谱图Fig.2　High performance liquid chromatogram of ginsenoside Rc by enzymolysis表2　人参皂苷Rc酶解反应前后各种成分含量Table2　The contents of ginsenoside Rc and its metabolites beforeand after enzymolysis酵母菌株反应前Rc反应后Rc Rd Rg3(mg/ml)YS10.4080.14200.006 YS20.4080.09800.0072.3　两株酵母菌18S rDNA的克隆与序列分析2.3.1　酵母菌基因组的PCR结果　YS1和YS2酵母菌基因组的PCR产物经电泳检测,均显示有长度大约为1500bp左右的特异性扩增片段(图3),与预期结果相符㊂2.3.2　酵母菌18S rDNA的序列分析　PCR产物测序结果显示,YS1和YS2两株酵母菌的目的片段长分别为1478bp和1477bp,且两者重叠序列完全相同㊂同时,从GenBank中收集整理了不同种属酵母菌菌株的18S rDNA序列,包括酵母菌属(Sac⁃charomyces)㊁毕赤酵母属(Pichia)㊁裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)㊁假丝酵母属(Candida)和红酵母属(Rhodotorula),利用Neighbor⁃joining法构建M:DL2000DNA marker㊂图3　PCR扩增产物电泳图Fig.3　Agrose gel electrophoresis of PCR products of YS1and YS2genome系统进化树(图4),结果显示,酵母菌YS1和YS2在分类地位上均位于酵母菌属(Saccharomyces)㊂3　讨论目前,利用酶法或微生物转化法对人参皂苷进行生物转化或结构修饰,获得药用价值和生理活性较高的稀有皂苷已成为研究热点㊂本研究结果显示,在两株酵母菌的代谢产物中均存在具有较高水解Rb1活性的人参皂苷水解酶,从反应物的转化率63江苏农业学报　2013年第29卷第1期. All Rights Reserved.图4　基于酵母菌18S rDNA序列构建的系统发育树Fig.4　Phylogenetic tree based on18s rDNA gene sequences of yeasts constructed by Neighbor⁃joining method上推测,两株酵母菌除了上述代谢途径外,还存在有其他代谢途径㊂对酵母菌YS1而言,较高的Rd转化率表明转化Rb1形成Rd是其主要代谢途径,而少量Rg3的形成,可由Rb1直接水解获得,或者通过水解形成的Rd获得㊂因而,对欲通过转化Rb1来获得Rd为目的的生产实践而言,酵母菌YS1是个理想的备选菌株㊂从Rc的反应情况看,与已有研究中分离出能将Rc水解生成Rd的人参皂苷⁃α⁃阿拉伯糖苷酶[17]不同,两株酵母的酶解产物中均没有检测到Rd的生成,而只检测出Rg3,推测存在能将Rc中C20位上两个糖基直接水解掉的人参皂苷糖苷酶㊂从转化率的变化看,上述代谢途径均非Rc的主要代谢途径,Rc很可能主要按照下面的代谢途径进行转化,即Rc→Mc1→Mc→CK→PPD[21]㊂ 因为提取酶为粗酶,成分较复杂,对人参皂苷Rb1和Rc的转化是由一种或几种酶催化完成,还需进一步研究㊂在Rb1和Rc的代谢途径中,均有可能生成代谢产物CK㊂CK也是人参皂苷Rb1在肠内的主要代谢产物,易被肠道下部吸收[22],在抗肿瘤的浸润转移以及逆转肿瘤耐药方面具有明显的药理作用[23⁃24]㊂因而后续试验可加强对CK的转化研究㊂18S rDNA的克隆和序列分析结果显示,两酵母菌株均属于酵母菌属㊂YS1和YS2作为一种模式生物,对下一步研究酶蛋白的分离纯化㊁基因组成以及功能鉴定无疑具有极大的帮助㊂参考文献:[1]　徐小林,郑兴峰,卢金萍.土人参营养器官解剖结构[J].江苏农业科学,2012,40(6):138⁃140.[2]　贾继明,王宗权,吴立军,等.人参皂苷Rb1的药理活性研究进展[J].中国中药杂志,2008,33(12):1371⁃1377.[3]　JUNG S Y,CHOI S,KO Y S,et al.Effects of ginsenosides onvanilloid receptor(VR1)channels expressed in Xenopus oocytes [J].Mol Cells,2001,12:342⁃346.[4]　CHOI S S,HAN E J,HAN K J,et al.Antinociceptive effects ofginsenosides injected intracerebroventricularly or intrathecally in substance P⁃induced pain model[J].Planta Med,2003,69: 1001⁃1004.[5]　LIU Z Q,LUO X Y,SUN Y X,et al.Can ginsenosides protecthuman erythrocytes against free⁃radical⁃induced hemolysis[J].Biochim Biophys Acta,2002,1572(1):58⁃66.[6]　SHI Q,HAO Q,BOUISSAC J,et al.Ginsenoside⁃Rd from Panaxnotoginseng enhances astrocyte differentiation from neural stem cells[J].Life Sci,2005,76(9):983⁃995.[7]　LEE J K,CHOI S S,LEE H K,et al.Effects of ginsenoside Rdand decursinol on the neurotoxic responses induced by kainic acid in mice[J].Planta Med,2003,69(3):230⁃234. 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All Rights Reserved.[16]ZHANG C Z,YU H S,BAO Y M,et al.Purification and charac⁃terization of ginsenoside⁃β⁃glucosidase from ginseng[J].Chem Pharm Bull,2001,49(7):795⁃798.[17]ZHANG C Z,YU H S,BAO Y M,et al.Purification and charac⁃terization of ginsenoside⁃α⁃arabinofuranase hydrolyzing ginsenoside Rc into Rd from the fresh root of Panax ginseng[J].Process Bio⁃chemistry,2002,37:793⁃798.[18]刘　欣,杨　凌,杨胜利,等.蜗牛酶中一种人参皂苷Rb1酶的分离纯化[J].生物工程学报,2005(11):929⁃933. [19]马吉胜,周秋丽,费晓方,等.真菌对人参皂苷Rb1及人参二醇系皂苷的代谢作用[J].药学学报,2001,3(18):603⁃605. [20]付建国.人参皂苷微生物转化的研究[D].吉林:吉林农业大学,2004.[21]李绪文.人参皂苷降解及其产物化学成分的研究[D].吉林:吉林大学,2006.[22]AKAO T,KIDA H,KANAOKA M,et al.Intestinal bacterial hy⁃drolysis is required for the appearance of compound K in rat plasma after oral administration of ginsenoside Rb1from Panax ginseng [J].Pharm Pharmacol,1998,50(10):1155⁃1160. 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分类号密级U D C4(专用字体)硕士学位论文(宋体2号)β-葡萄糖苷酶的制备以及对人参皂苷的酶法转化细(楷体1号)学位申请人：牛涛宋体3号)学科专业：药理学指导教师：龚大春教授二○一一年五月A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements forthe Degree of Master of MedicinePreparation β-glucosidase and EnzymaticTransformation of GinsenosidesMaster Candidate:Niu TAOMajor:PharmacologySupervisor:Prof.Gong DachunChina Three Gorges UniversityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2011三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。

学位论文作者签名：日期：内容摘要目的:本实验通过Aspergillus固态发酵，分离纯化制备β-葡萄糖苷酶，并利用β-葡萄糖苷酶催化人参皂苷和N-乙酰葡萄糖胺，形成新的氨基糖皂苷，从而期望获得高效低毒的新型人参皂苷，为皂苷生物转化研究提供新的方向和思路。

方法:首先，将Aspergillus发酵所得的粗酶分别经过Sephadex-G150和DEAE-Sephadex-A50分离纯化，获得较纯的β-葡萄糖苷酶。

其次，将新鲜人参切片，洗净，在50℃烘干，粉碎。

分别用70%的乙醇回流提取，乙酸乙酯和正丁醇萃取。

正丁醇萃取部分经D101大孔树脂的纯化，真空冷冻干燥后得到人参总皂苷。

β-葡萄糖苷酶固体发酵培养条件的优化作者：王振丽李书华王婷婷来源：《食品安全导刊·中旬刊》2021年第10期摘要：目的研究大豆异黄酮糖苷水解酶菌株米曲霉3042的固体培养条件;方法固态发酵，结果确立了产酶的最适培养条件为发酵培养温度为32 ℃，发酵初始pH6.0，发酵培养84 h时酶活力最高。

关键词：大豆异黄酮糖苷;水解酶;培养条件;优化大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是一类重要的生理活性物质，如防治心脑血管疾病、预防骨质疏松症、改善妇女更年期综合症等。

大豆异黄酮主要有两种存在形式—游离型的苷元（Aglycon）和结合型的糖苷（Glycosides）两类，从大豆中提取的大豆异黄酮中游离的苷元占总量的2%～3%，糖苷占总量的97%～98%，而糖苷形式的大豆异黄酮不具有最佳的生理活性状态，很难被人体直接吸收，必须要经过β-葡萄糖苷酶作用，生成苷元形式才易被人体吸收[1-2]。

充分发挥菌株的产酶性能还需提供最佳产酶条件[3-5]，因此，β-葡萄糖苷酶的固体发酵培养条件的优化研究十分重要。

1 材料与方法1.1 菌种与固体培养基米曲霉3042，由辽宁省微生物科学研究院菌种保藏中心提供。

黑豆：麸皮为2︰3、培养基中加水量与固体物料比为1.5︰1，KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.1%、（NH4）2SO4 0.5%、水杨苷0.01%，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器高压灭菌锅、电热恒温培养箱、7230型分光光度计、恒温水浴锅（北京）、低温高速离心机（Sigma）、超声波细胞粉碎机。

1.3 实验方法1.3.1 产酶固体发酵将培养42 h后的液体种子接入产酶固体发酵培养基中，接入量为10%，28 ℃恒温培养，当菌体孢子大量长出时取出，在研钵中研磨至小碎片后称取5 g加入50 mL蒸馏水，室温浸泡提取4 h，用纱布过滤，滤液于4 ℃离心后取上清液，测其β-葡萄糖苷酶的酶活力，测定时取相应的0.05 mol·L-1 pH为4.5的柠檬酸缓冲液稀释。

人参皂苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学特性张丹;刘耀平;鱼红闪;金凤燮;陈冠雄【期刊名称】《应用与环境生物学报》【年(卷),期】2003(9)3【摘要】通过硫酸铵分级沉淀、透析和高效液相色谱等技术分别从两株黑曲霉Aspergillusniger 4 8g和A .niger 84 8g中分离纯化出了具有水解人参皂苷葡萄糖苷键的β 葡萄糖苷酶 ,并对其酶学特性进行了研究 .结果表明 :两株黑曲霉A .niger 4 8g和A .niger 84 8g所产的β 葡萄糖苷酶的表观分子量不同 ,分别为34× 10 3 和31× 10 3 kD ;两株菌所产的β 葡萄糖苷酶的反应特性基本相同 .图 4表 4参【总页数】4页(P259-262)【关键词】人参皂苷;β-葡萄糖苷酶;分离;纯化;酶学特性;黑曲霉【作者】张丹;刘耀平;鱼红闪;金凤燮;陈冠雄【作者单位】中国科学院沈阳应用生态研究所;大连轻工业学院食品科学与生物技术系大连116001;大连轻工业学院食品科学与生物技术系【正文语种】中文【中图分类】Q556.2【相关文献】1.双齿围沙蚕β-1,3-葡萄糖苷酶分离纯化及其酶学性质 [J], 于海慧;宋淑梅;佟长青;李伟2.芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质 [J], 李蕊伽;廖海君;白亚娟;陶敏;唐菁;唐云明3.内生真菌Eupenicillium javanicum R57水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质 [J], 梁金凤;汪涯;肖依文;常军;季波;朱笃4.尼罗罗非鱼肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质分析 [J], 陈晓佳;孙林浩;袁阳;黄小红;张伟妮5.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 郭金玲;陈程鹏;周一郎;陈红吉;吕育财;任立伟;龚大春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

山东农业科学　２０２１，５３（１１）：６３～６９ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　ＤＯＩ：１０．１４０８３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－４９４２．２０２１．１１．０１０产β－葡萄糖苷酶微生物的筛选鉴定及其在人参皂苷ＣｏｍｐｏｕｎｄＫ转化中的应用张庆锋，吕世鑫，江雨欣，王丹丹，王洪涛（烟台大学生命科学学院，山东烟台　２６４００５） 摘要：本试验用七叶苷培养基从西洋参（Ｐａｎａｘｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ）的根际土壤中筛选产β－葡萄糖苷酶的菌种，并通过转化试验发现一株可以高效转化人参皂苷Ｒｂ１为人参皂苷ＣｏｍｐｏｕｎｄＫ（Ｃ－Ｋ）的菌株。

基于１６ＳｒＤＮＡ基因序列的系统进化树分析确定该菌株为耐热科恩氏菌（Ｃｏｈｎｅｌｌａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）。

根据单因素试验结果，选取菌液浓度、反应ｐＨ值、反应时间３个因素，以Ｃ－Ｋ的含量为响应值，采用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合试验设计３因素３水平的响应面试验，建立回归模型。

确定优化的皂苷转化条件为反应ｐＨ６．４、菌液浓度９．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、反应时间７．５ｄ，在该条件下人参皂苷转化率为７８．３６％。

通过高效液相色谱分析该菌株转化人参皂苷Ｒｂ１的途径为Ｒｂ１→Ｒｄ→Ｆ２→Ｃ－Ｋ。

本研究为稀有皂苷Ｃ－Ｋ的微生物转化提供了新的菌种来源，也为Ｃ－Ｋ的工业化生产提供了理论依据。

关键词：菌株筛选；生物转化；β－葡萄糖苷酶；人参皂苷Ｒｂ１；人参皂苷ＣｏｍｐｏｕｎｄＫ中图分类号：Ｓ５６７．５＋３：Ｒ２８４．１ 文献标识号：Ａ 文章编号：１００１－４９４２（２０２１）１１－００６３－０７ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓＰｒｏｄｕｃｉｎｇβ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＧｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＣｏｍｐｏｕｎｄ ＫＺｈａｎｇＱｉｎｇｆｅｎｇ，ＬüＳｈｉｘｉｎ，ＪｉａｎｇＹｕｘｉｎ，ＷａｎｇＤａｎｄａｎ，ＷａｎｇＨｏｎｇｔａｏ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｔａｉ２６４００５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｃａｐａｂｌｅｏｆｐｒｏｄｕｃｉｎｇβ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｒｈｉｚｏ ｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｏｆＰａｎａｘｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ，ａｎｄｏｎｅｓｔｒａｉｎｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｂ１ｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＣｏｍ ｐｏｕｎｄＫ（Ｃ Ｋ）ｗａｓｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈｅｓｃｕｌｉｎａｇａｒ．ＴｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＣｏｈｎｅｌｌａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｒｏｍ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓ，ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｒｅａｃｔｉｏｎｐＨｖａｌｕｅａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｍａｉｎｆａｃｔｏｒｓ．ＵｓｉｎｇｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＣ Ｋａｓｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｖａｌｕｅ，ｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗｉｔｈ３ｆａｃｔｏｒｓａｎｄ３ｌｅｖｅｌｓｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄａｃ ｃｏｒｄｉｎｇｔｏＢｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎｃｅｎｔｒａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｅｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ９×１０８ｃｆｕ／ｍＬ，ｐＨｏｆ６．４，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆ７．５ｄ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｔｒａｎｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｗａｓ７８．３６％．ＴｈｅＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐａｔｈｗａｙｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＲｂ１ｂｙｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓＲｂ１→Ｒｄ→Ｆ２→Ｃ Ｋ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗｓｔｒａｉｎｆｏｒｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＣ Ｋ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｅｓｆｏｒｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣ Ｋ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｓｔｒａｉｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；β Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ；ＧｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｂ１；ＧｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＣｏｍ ｐｏｕｎｄＫ收稿日期：２０２１－０７－１２基金项目：山东省自然科学基金面上项目（ＺＲ２０２０ＭＨ３６７）；烟台大学研究生科技创新基金项目（ＹＤＹＢ２０３４）作者简介：张庆锋（１９９８—），男，硕士研究生，研究方向为食品加工与安全。