葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法

α2葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展厦门市第一医院(361003)　张文婷　综述　方青枝　审校【中图分类号】R97711+5　【文献标识码】A　【文章编号】100222600(2009)022******* 糖尿病是一种多病因引起、以高血糖为特征的内分泌代谢紊乱性疾病。

高血糖是由胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗,或二者共同存在而引起。

世界上,糖尿病患者已超过117亿,已成为继心血管疾病和肿瘤之后第三大严重威胁人类健康的非传染性疾病[1]。

临床上,根据糖尿病发病机制不同,主要分为1型糖尿病(胰岛素依赖型)和2型糖尿病(非胰岛素依赖型),我国以2型居多。

治疗2型糖尿病的药物主要分为:(1)胰岛素及类似物:如赖脯胰岛素等;(2)促胰岛素分泌剂:如磺酰脲类;(3)胰岛素增敏剂:如噻唑烷类衍生物;(4)α2葡萄糖苷酶抑制剂:如阿卡波糖等。

本文就α2葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展作一综述。

1　α2葡萄糖苷酶抑制剂的作用机制α2葡萄糖苷酶主要由唾液和胰液中α2淀粉酶及小肠刷状缘上皮细胞上的麦芽糖酶、异麦芽糖酶、α2临界糊精酶、蔗糖酶和乳糖酶等组成。

食物中的碳水化合物,如淀粉先经α2淀粉酶水解成麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖和α2临界糊精等,食物在口腔中停留时间短,所以该过程主要在小肠内进行。

而后,寡糖经小肠刷状缘上皮细胞上各种酶的作用生成葡萄糖及其他单糖,经小肠黏膜细胞吸收而被机体利用。

2型糖尿病患者因胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或二者的共同作用,血液中的葡萄糖进入肝、肌肉和脂肪等组织细胞及在细胞内的氧化利用发生障碍,同时,肝糖输出增多导致高血糖。

由于血糖水平超过肾小管吸收葡萄糖的能力,部分血糖随尿排出而形成糖尿病。

因此,可以通过降低α2葡萄糖苷酶活性,限制或延缓碳水化合物在消化道内分解,达到预防和治疗这类疾病[2]。

α2葡萄糖苷酶抑制剂的结构类似寡糖,能够在寡糖与α2葡萄糖苷酶的结合位点和α2葡萄糖苷酶竞争性结合,抑制酶的活性,减少寡糖分解,从而延缓肠道对单糖特别是葡萄糖吸收,避免了餐后可能发生的血糖过高。

中药中a-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选及其抑制动力学研究的开题报告一、选题背景和意义a-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）是在消化系统中参与糖类分解与吸收的一种重要酶类，在人体内发挥着重要的作用。

过量的α-葡萄糖苷酶活性会导致血糖升高，出现糖尿病等代谢性疾病。

因此，寻找植物中的a-葡萄糖苷酶抑制剂，能有效抑制糖类的吸收，降低人体血糖含量，对预防和治疗糖尿病等相关疾病具有潜在的治疗价值。

中药中的化学成分种类多样，其中一部分化合物被发现有能够抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。

为了寻找中草药中的a-葡萄糖苷酶抑制剂，本研究将从中草药中筛选可能具有抑制α-葡萄糖苷酶活性化合物，探讨其抑制动力学，为中草药的开发利用提供理论依据。

二、研究内容和方法本研究将从中草药中筛选可能具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的化合物，利用体外酶活测定方法对其抑制活性进行评价。

抑制活性强的化合物将进行进一步的抑制动力学研究，包括计算抑制常数（Ki）、测定酶活性对抑制剂浓度的响应曲线和半最大抑制浓度（IC50）等实验。

研究方法如下：1. 筛选活性化合物：选用常见的中草药材，按照常规提取方法制备中药提取物，利用体外酶活测定方法对其抑制α-葡萄糖苷酶的活性进行筛选。

2. 抑制动力学研究：确定活性化合物的IC50值，测定其对酶活性的影响曲线，计算Ki值，探讨其抑制动力学特性。

三、预期结果本研究预计通过对中药提取物进行筛选，得到数种具有较强抑制α-葡萄糖苷酶活性的化合物。

通过实验确定这些化合物的抑制动力学特性，包括IC50、Ki等参数，为进一步开发和利用这些化合物提供理论依据。

同时，本研究将从中草药提取物中筛选出具有降低血糖作用的化合物，为糖尿病等代谢性疾病的治疗提供科学依据。

四、研究进度安排第一年：1. 确定实验方案，搜集相关文献，制定实验计划；2. 提取中药提取物，进行a-葡萄糖苷酶体外酶活测定，并初步筛选出具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的化合物；3. 将抑制活性较强的化合物选择出来，并进行抑制动力学研究。

糖苷酶及其抑制剂的研究摘要：糖苷酶是生命体正常运转的关键性酶，糖苷酶抑制剂可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，因此对一些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值。

本文研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶以及蔗糖酶的抑制剂。

重点研究了β－半乳糖苷酶的分子结构和活性基团，并从结构出发筛选其抑制剂，发现此酶的抑制剂种类较少且抑制活性较低。

本实验采用混合交叉筛选法筛选了多种金属离子和氨基酸对β－半乳糖苷酶的抑制作用，同时也筛选了天然产物和合成化合物。

关键词：糖苷酶β－半乳糖苷酶β－葡萄糖苷酶蔗糖酶抑制剂的筛选混合交叉法1、前言糖苷酶和糖基转移酶不仅参与了体内碳水化合物的消化，而且是糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪酶，它对糖蛋白中寡糖链的形成极为重要；糖链的组成与结构是糖蛋白特异生物功能的识别部位，因此糖苷酶活性对糖蛋白生物合成有关键作用，而后者又涉及到免疫反应、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染. 因此, 糖苷酶不仅是生命体正常运转的关键性酶,同时又是许多疾病的相关酶. 与病毒感染、癌症及一系列新陈代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病有关。

由于糖苷酶重要的生物学意义，糖苷酶抑制剂的研究也引起了人们的极大兴趣。

糖苷酶抑制剂即是可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，抑制淀粉、麦芽糖、蔗糖转变成单糖；影响糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪；所以糖苷酶抑制剂不但对一些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值[1] ，而且可作为抗AIDS病毒[2]、抗鼠白血病毒[3]的潜在治疗试剂。

本论文重点研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）又称β－D－半乳糖苷水解酶，（β－D－galactosid- -e galacto-hydrolase ,EC.3.2.1.23）,商品名为乳糖酶（Lactase），它广泛存在于豆类及其他各种动植物体内和微生物中。

第 44 卷第 2 期2021 年 2 月名袷中河么Drug Evaluation Research Vol. 44 No. 2 February 2021新型a-葡萄糖苷酶抑制剂筛选及药理作用研究进展阎成炬h2,郭崇真“2,林建阳1.中国医科大学附属第一医院药学部，辽宁沈阳1100012.中国医科大学药学院，辽宁沈阳110122摘要：a-葡萄糖苷酶抑制剂能有效降低餐后血糖，为临床一线降糖用药之一。

近年来报道了大量新化合物作为a-葡萄糖 苷酶抑制剂，不仅可以起到降糖的作用，而且还具有抗溶酶体堆积病、抗病毒、_抗菌和抗癌的药效。

a-葡萄糖苷酶抑制剂 新型化合物按照产出途径主要有微生物代谢产物、天然产物与化学合成产物。

就近年来开发的多种类型的a-葡萄糖苷酶抑 制剂及其抗癌、抗病毒和抗溶酶体堆积病作用进行了综述’旨在为&葡萄糖苷酶抑制剂或临床前候选药物提供更好的研究方向-关键词：a-葡萄糖苷酶抑制剂；2型糖尿病；作用机制：药理作用；抗病毒；抗溶酶体堆积病中图分类号：R977.1 文献标志码：A 文章编号：1674-6376 (2021) 02-0440-06DOI ：10.7501/j.issn. 1674-6376.2021.02.029Research progress of screen and pharmacological effect for novel a-glucosidaseYAN Chengda1'2,GUO Chongzhen1,2,LIN Jianyang1,21. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China2. College of Pharmaceutical Science, China Medical University, Shenyang 110122, ChinaAbstract: Alpha-glucosidase inhibitor is one of the first-line antidiabetic medication which could reduce postprandial blood glucose effectively. In recent years, a substantial number of new compounds have been reported as alpha-glucosidase inhibitors, have multiple physiological effects including hypoglycemic effects, anticancer, antiviral, and anti-lysosomal storage disorders effect. The main types of new alpha-glucosidase inhibitor are microbial metabolites, natural products and chemically synthesized products. This review presents the various types of alpha-glucosidase inhibitors developed in recent years and its pharmacological effects, aimed to provide guidance to alpha-glucosidase inhibitors or clinical candidates.Key words: Alpha-glucosidase; type 2 diabetes mellitus; mechanism of action; pharmacological effect; research progress; antiviral; anti-lysosomal storage disorders糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，其临床主要 诊断特点是高血糖。

葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。

其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。

α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。

经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。

吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。

设不加样品时，测得的吸光度为c0, 加样品后测的吸光度为c1. 那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。

一实验试剂：α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖) 均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等, 均为分析纯。

水为超纯水。

苦瓜提取物。

二实验器材：Bio Tek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器三实验方法：（一） 试剂配制（1）pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液分别配制0.1 mol/L Na2HPO4和KH2PO4(13.6 g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH 值至6.8即得0.1 mol/L磷酸缓冲液（2）用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制0.26 U/mlα-Glucosidase（3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml) （4）反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3。

（5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml 的浓度。

2.3α-淀粉酶抑制测定
此法是根据工作进行由Apostolidis和李19稍作修改。

简单地说，添加200μL的样品用200μL的α-淀粉酶（13 U毫升-1，在0.02M的磷酸盐缓冲液，pH 6.9，0.006 M氯化钠）在1.5毫升的Eppendorf管中混合。

后在37℃下温育30分钟后，200微升的0.25％（重量/体积）淀粉（在0.02M的磷酸盐缓冲液，pH 6.9）溶液，将混合物再在37℃下温育30分钟，接着加入400μLDNS显色剂。

通过在沸水浴中加热5分钟，使反应终止。

冷却至室温后，测定吸光度，在540nm处，用分光光度计（U-1800日立公司，东京，日本）。

2.4α-葡萄糖苷酶抑制测定
此法是根据工作进行由Apostolidis和李19稍作修改。

简单地说，将50μL的样品混合，用100μL的α-葡萄糖苷酶（2学分毫升-1次，在0.1M磷酸盐缓冲液，pH 值6.9）在1.5毫升的Eppendorf管中，然后在37℃下孵育10分钟。

后，加入50μL 的5mM的PNPG（在0.1M磷酸盐缓冲液，pH值6.9），将混合物再在37℃下温育10分钟。

在100℃下通过加热使反应终止，然后用1毫升的去离子水稀释。

使用分光光度计（U-1800日立公司，东京，日本）在405nm处测定吸光度。

溶液配制底物(pNPG)溶液：pH 值6.8 的0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml)反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。

阳性对照药品阿卡波糖溶液:精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml的浓度。

配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μg/mL DNJ标准母液。

将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60μg/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。

α-葡萄糖苷酶的酶溶液：用磷酸缓冲液配制成0.26 U/ml α-葡萄糖苷酶的酶溶液。

OR 0.2 U/ml?配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。

再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。

样品组（药物种类*浓度组数*3）样品空白组（药物种类*浓度组数）对照组空白组50 μl 磷酸缓冲液 +20 μl 药液 +20 μl PNPG阳性对照组 60 μl 磷酸缓冲液 +20 μl 药液 +20 μl PNPG50 μl 磷酸缓冲液 +20 μl 药液 +20 μl PNPG 70 μl 磷酸缓冲液 +20 μl PNPG80 μl 磷酸缓冲液 +20 μl PNPG振荡使充分混匀 37 ℃水浴10 min+100 μl 酶溶液 振荡使充分混匀 37 ℃水浴20 min+ 150 μl 0.2 mol/L Na 2CO 3在酶标仪405nm 处 测定吸光度+100 μl 酶溶液 +100 μl 酶溶液。