α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法

α 葡萄糖苷酶抑制实验原理
α-葡萄糖苷酶抑制实验的原理主要基于酶的抑制作用。

在适宜的温度和酸碱环境中，α-葡糖苷酶能够催化水解4-硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，生成对硝基苯酚。

这个过程可以通过酶标仪在420nm处检测到对硝基苯酚的吸光度，从而计算出产物量的变化。

当多酚与α-葡糖苷酶结合生成多酚α--葡糖苷酶络合物时，该络合物引起
α-葡糖苷酶的构象发生改变，改变构象的α-葡糖苷酶对4-硝基苯基-D-吡
喃葡萄糖苷的催化水解作用减弱或消失，从而减少了对硝基苯酚的生成。

通过酶标仪检测吸光度的变化，可以计算出多酚对α-葡糖苷酶的抑制率。

以上信息仅供参考，如需了解更多信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。

热带作物学报2021, 42(5): 1455 1461Chinese Journal of Tropical Crops槟榔多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制动力学研究宋菲1,2，陈开健3，唐敏敏1,2，陈华1,2*，李永东41. 中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌 571339；2. 海南省槟榔产业工程研究中心，海南文昌 571339；3. 海南热带海洋学院食品科学与工程学院，海南三亚 572022；4. 海南雨林椰创科技开发有限公司，海南文昌 571339摘要：为了研究槟榔多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响，以75%乙醇为提取溶剂，利用超声波辅助法提取槟榔多酚（槟榔籽和槟榔壳多酚），采用S-8大孔树脂对粗提物进行纯化，探讨纯化前后的槟榔多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，通过动力学实验判断对酶活性的抑制类型，同时对添加不同浓度槟榔多酚提取物的α-葡萄糖苷酶的荧光光谱和同步荧光光谱进行分析。

结果表明：槟榔籽多酚提取物纯化前后的IC50分别为(0.34±0.12)、(0.33±0.10) μg/mL，槟榔壳多酚提取物纯化前后的IC50分别为(1.73±0.31)、(0.14±0.09)mg/mL，纯化后的槟榔壳多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用显著增强。

动力学实验表明，槟榔多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用类型为竞争性与非竞争性的混合型抑制。

荧光光谱和同步荧光光谱分析结果显示，槟榔多酚提取物对α-葡萄糖苷酶内源性荧光具有淬灭作用，但对酶的构象没有影响。

槟榔籽和槟榔壳多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均较强，可为天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发提供参考。

关键词：槟榔多酚；纯化；α-葡萄糖苷酶；活性抑制；动力学；荧光淬灭中图分类号：S792.91 文献标识码：AInhibition Kinetics of Polyphenol Extracts from Areca Nut on α-Glucosidase ActivitySONG Fei1,2, CHEN Kaijian3, TANG Minmin1,2, CHEN Hua1,2*,LI Yongdong41. Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang, Hainan 571339, China;2. Hainan Engineering Research Center of Arecanut Industry, Wenchang, Hainan 571339, China;3. College of Food Science and Engineering, Hainan Tropical Ocean University, Sanya, Hainan 572022, China;4. Hainan Yulin Coconut Technology Develop-ment Co., Ltd., Wenchang, Hainan 571339, ChinaAbstract: Areca seed and areca shell polyphenols were extracted using the ultrasonic assisted method with 75% ethanol as extraction solvent and purified by S-8 macropore resin. The inhibitory effect of polyphenol extracts from areca nut on α-glucosidase activity before and after purification was studied. The inhibitory type on α-glucosidase activity was de-termined by kinetic experiments, and the fluorescence spectrum and synchronous fluorescence spectrum of α-glucosidase with different concentrations of areca nut polyphenol extracts were analyzed. The results showed that the IC50 of areca seed polyphenol extracts before and after purification was (0.34±0.12) and (0.33±0.10)μg/mL, respectively, and the IC50 of areca shell polyphenol extracts before and after purification was (1.73±0.31) and (0.14±0.09)mg/mL, respectively, indicating that the inhibition on α-glucosidase activity was enhanced after purification of areca shell poly-phenol extracts. Kinetic experiments showed that the inhibition of areca nut polyphenol extracts on α-glucosidase activ-ity belonged to the mixed type of competition and non-competition. The fluorescence spectrum and synchronous fluo-rescence spectrum analysis showed that areca nut polyphenol extracts had quenching effect on the endogenous fluores-cence of α-glucosidase, but had no effect on the conformation of α-glucosidase. In conclusion, areca seed and areca shell 收稿日期 2020-06-24；修回日期 2020-07-22基金项目 海南省自然科学基金面上项目（No. 219MS080）；中国热带农业科学院基本科研业务费专项（No. 1630152017017，No. 1630152020007）；农业农村部农业科技创新与推广项目“槟榔食用安全性研究及健康新产品开发与示范”。

4种海星的α-葡萄糖苷酶抑制活性研究张改云;范林;侯忠海;张玉便;杨艳柳【摘要】目的：寻找具有降糖活性作用的海星并确定其活性部位。

方法首先采用正常和糖尿病小鼠口服糖耐量试验，比较4种海星粗提物改善口服糖耐量的作用，然后利用体外α-葡萄糖苷酶抑制剂模型进一步确定具有改善口服糖耐量作用的海星中抑制α-葡萄糖苷酶的活性部位。

结果罗氏海盘车粗提物对正常小鼠和糖尿病小鼠餐后0．5、1 h血糖均有显著降低作用，其中的正丁醇部位具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

结论罗氏海盘车的正丁醇部位具有α-葡萄糖苷酶抑制作用。

%Objective To search for starfishes with hopoglycemic activity and orientate the bioactive fractions .Methods Firstly, the crude extracts of four starfishes were subjected to oral glucose tolerance test on normal and diabetic mice .And then the in vitroα-glucosidase activity assay was introduced to confirm the bioactive fractions .Results The crude extract of Asterias rollestoni could lower the blood glucose of normal and diabetic mice after 0.5 h and 1 h.Furthermore, its n-BuOH fraction exhibited potent α-glucosidase inhibitoary activity .Conclusion The n-BuOH extract of Asterias rollestoni had a potent α-glucosidase inhibitoary activity .【期刊名称】《药学实践杂志》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】4页(P284-287)【关键词】海星;罗氏海盘车;糖耐量;α-葡萄糖苷酶;四氧嘧啶【作者】张改云;范林;侯忠海;张玉便;杨艳柳【作者单位】国家海洋局第三海洋研究所生物遗传资源重点实验室，福建厦门361005;东华大学化学化工与生物工程学院，上海201620;东华大学化学化工与生物工程学院，上海201620;国家海洋局第三海洋研究所生物遗传资源重点实验室，福建厦门361005;国家海洋局第三海洋研究所生物遗传资源重点实验室，福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】R282.74糖尿病是以持续高血糖为基本生化特征的一种常见的内分泌代谢性疾病。

◆论著◆中药研究青果不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用研究张震宇1，刘雅欣2，刘国香1，邵文卓1，张德成1，林桂涛1（1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355； 2.北京学校，北京 101100）［摘要］ 目的：探究青果不同溶剂提取物的成分差异及对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

方法：使用水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇对青果进行提取，分别测定不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，明确其抑制类型，并检测不同提取液中没食子酸、鞣花酸、总黄酮含量。

结果：各溶剂提取物均对α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用，其抑制类型为可逆性非竞争性抑制作用；70%乙醇提取物抑制效果最佳，半抑制浓度（IC 50）为9.914×103 μg/mL ，没食子酸、鞣花酸、总黄酮含量分别为（5.33±0.03）mg/g 、（12.61±0.12）mg/g 、（19.05±0.02）mg/g 。

结论：青果提取液成分中没食子酸对提取溶剂不敏感，鞣花酸及总黄酮水溶性不佳；对α-葡萄糖苷酶的抑制效果总体以70%乙醇提取液最佳，酶抑制率最高，此为青果开发提供了依据。

［关键词］ 青果；α-葡萄糖苷酶；酶抑制；没食子酸；鞣花酸；总黄酮［中图分类号］ R289.1 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007-659X （2024）03-0348-07 DOI ：10.16294/ki.1007-659x.2024.03.013Inhibition of α-Glucosidase by Different Solvent Extracts of Qingguo （Canarii Fructus ）ZHANG Zhenyu 1，LIU Yaxin 2，LIU Guoxiang 1，SHAO Wenzhuo 1，ZHANG Decheng 1，LIN Guitao 1（1.School of Pharmacy ，Shandong University of Traditional Chinese Medicine ，Jinan 250355，China ；2.Beijing School ，Beijing 101100，China ）Abstract Objective ：To explore the composition differences of different solvents extracts of Qingguo （CanariiFructus ） and their inhibitory effects on α-glucosidase. Methods ：Qingguo was extracted with water ，50% ethanol ，70% ethanol and 95% ethanol. The inhibitory effects of different extracts on α-glucosidase were determined to clarify their inhibitory types. The contents of gallic acid ，ellagic acid and total flavonoids in different extracts were detected. Results ：The solvent extracts had different degrees of inhibitory effects on α-glucosidase ，andtheir inhibitory types were reversible noncompetitive inhibitory effects. The 70% ethanol extract had the bestinhibitory effect ，with IC 50 of 9.914×103 μg/mL. The contents of gallic acid ，ellagic acid and total flavonoidswere （5.33±0.03） mg/g ，（12.61±0.12） mg/g and （19.05±0.02） mg/g ，respectively. Conclusions ：Thegallic acid in Qingguo extracts is not sensitive to extraction solvents ，and the ellagic acid and totalflavonoids are poorly water soluble. The 70% ethanol extract had the best inhibition effect on α-glucosi⁃dase ，and the enzyme inhibition rate was the highest ，which provided a basis for the development of［收稿日期］ 2022-10-10［基金项目］ 山东省重点研发计划项目（编号：2016CYJS08A01-10）［作者简介］ 张震宇（1992—），男，山东济南人，2021年级硕士研究生，研究方向：中药新制剂、新技术研究。

α-糖苷酶抑制剂抑制活性测定实验原理：食物中的淀粉（多糖）经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖（或称寡糖）以及双糖与三糖，进入小肠经α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。

在生理状态下，小肠上，中、下三段均存在α- 葡萄糖苷酶，在服用α- 葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制, 而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间后延，从而对降低餐后高血糖有益, 在长期使用后亦可降低空腹血糖, 估计与提高胰岛素敏感性有关。

对硝基苯-α-D-葡萄糖苷（pNPG）经α-葡萄糖苷酶水解可产生对硝基苯酚，其在405nm呈特异性吸收，因此可以通过检测对硝基苯酚的生成量检测α-葡萄糖苷酶的活性。

仪器与试剂缓冲液：0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）--每100ml中1mol/l磷酸氢二钠4.6 ml，1mol/l磷酸二氢钠5.4 ml。

酵母α-葡萄糖苷酶：将100U/ml酶原液用0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）稀释为1U/ml的酶溶液，冷冻备用。

底物pNPG配制：2mM的pNPG溶解于0.1M的磷酸钠缓冲液中。

阿卡波糖抑制剂配制：200μg/ml溶于0.1M的磷酸钠缓冲液中。

实验内容1.分组：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、阳性对照组空白、待测样品大、中、小剂量组、待测样品组空白空白对照：170μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG阴性对照组：10μl酶溶液+160μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG阳性对照：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂+30μl 2mM的pNPG阳性对照空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂待测样品组：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl待测样品+30μl 2mM的pNPG 待测样品空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl待测样品2.实验步骤96孔酶标板上依次加入除底物外的所有反应液，37℃温浴10分钟，然后迅速加入底物,并测定反应初始吸光值（405nm）；之后，用塑料膜密封酶标板，37℃保温，每隔15分钟测定一次吸光值，以吸光值对时间做反应曲线。

2.3α-淀粉酶抑制测定
此法是根据工作进行由Apostolidis和李19稍作修改。

简单地说，添加200μL的样品用200μL的α-淀粉酶（13 U毫升-1，在0.02M的磷酸盐缓冲液，pH 6.9，0.006 M氯化钠）在1.5毫升的Eppendorf管中混合。

后在37℃下温育30分钟后，200微升的0.25％（重量/体积）淀粉（在0.02M的磷酸盐缓冲液，pH 6.9）溶液，将混合物再在37℃下温育30分钟，接着加入400μLDNS显色剂。

通过在沸水浴中加热5分钟，使反应终止。

冷却至室温后，测定吸光度，在540nm处，用分光光度计（U-1800日立公司，东京，日本）。

2.4α-葡萄糖苷酶抑制测定
此法是根据工作进行由Apostolidis和李19稍作修改。

简单地说，将50μL的样品混合，用100μL的α-葡萄糖苷酶（2学分毫升-1次，在0.1M磷酸盐缓冲液，pH 值6.9）在1.5毫升的Eppendorf管中，然后在37℃下孵育10分钟。

后，加入50μL 的5mM的PNPG（在0.1M磷酸盐缓冲液，pH值6.9），将混合物再在37℃下温育10分钟。

在100℃下通过加热使反应终止，然后用1毫升的去离子水稀释。

使用分光光度计（U-1800日立公司，东京，日本）在405nm处测定吸光度。

·基础研究·△［基金项目］　国家重点研发计划项目（２０１７ＹＦＣ１７０２４００）［通信作者］　陈志元，高级工程师，研究方向：中药现代化；Ｔｅｌ：（０７１４）３１８８７７９，Ｅ ｍａｉｌ：５７８０１３７＠ｑｑ ｃｏｍ桑不同药用部位总生物碱对α 葡萄糖苷酶活性的抑制作用△李名洁，孙代华，王泽霞，胡辉，成焕波，陈志元劲牌持正堂药业有限公司／湖北省中药配方颗粒工程技术研究中心，湖北　黄石　４３５１００［摘要］　目的：比较桑不同药用部位（桑叶、桑枝、桑白皮）总生物碱对α 葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

方法：采用采用蒸发光散射检测器（ＥＬＳＤ） 高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）测定桑不同药用部位总生物碱中１ 脱氧野尻霉素（ＤＮＪ）含量；以半数抑制浓度（ＩＣ５０）为评价指标，以阿卡波糖为阳性对照，以对 硝基苯基 α Ｄ 吡喃葡萄糖苷为底物，采用体外抑制模型评价桑不同部位总生物碱对α 葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

结果：桑不同药用部位总生物碱中ＤＮＪ质量分数为桑白皮生物碱（３０ １％）＞桑枝生物碱（２５ ８％）＞桑叶生物碱（２１ ４％）。

桑不同药用部位总生物碱对α 葡萄糖苷酶抑制作用强度为桑枝生物碱＞桑叶生物碱＞桑白皮生物碱＞阿卡波糖。

结论：在桑枝、桑叶、桑白皮总生物碱中，以桑枝总生物碱对α 葡萄糖苷酶活性抑制作用最强，为桑资源开发辅助降血糖的药品和保健食品提供依据。

［关键词］　桑；药用部位；生物碱；１ 脱氧野尻霉素；α 葡萄糖苷酶［中图分类号］　Ｒ２８５ ［文献标识码］　Ａ ［文章编号］　１６７３ ４８９０（２０２１）０２ ０２９０ ０４ｄｏｉ：１０ １３３１３／ｊ ｉｓｓｎ １６７３ ４８９０ ２０２００３１１００１ＳｔｕｄｙｏｎＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＥｆｆｅｃｔｏｆＡｌｋａｌｏｉｄｓｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔＭｅｄｉｃｉｎａｌＰａｒｔｓｆｒｏｍＭｏｒｕｓａｌｂａｏｎＡｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆαＧｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＬＩＭｉｎｇ ｊｉｅ，ＳＵＮＤａｉ ｈｕａ，ＷＡＮＧＺｅ ｘｉａ，ＨＵＨｕｉ，ＣＨＥＮＧＨｕａｎ ｂｏ，ＣＨＥＮＺｈｉ ｙｕａｎＪｉｎｇＢｒａｎｄＣｈｉｚｈｅｎｇｔａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ ，Ｌｔｄ ，ＨｕｂｅｉＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＦｏｒｍｕｌａＧｒａｎｕｌｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ４３５１００，Ｃｈｉｎａ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｍｐａｒｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｌｋａｌｏｉｄｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｃｉｎａｌｐａｒｔｓｆｒｏｍＭｏｒｕｓａｌｂａ（ｌｅａｆ，ｒｏｏｔａｎｄｔｗｉｇ）ｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆα ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆ１ ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ（ＤＮＪ）ｉｎｔｈｅｔｏｔａｌａｌｋａｌｏｉｄｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｃｉｎａｌｐａｒｔｓｆｒｏｍＭ ａｌｂａｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＥＬＳＤ） ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）；Ｕｓｉｎｇｈａｌｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｖａｌｕｅ（ＩＣ５０）ａｓｅｖａｌｕａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ，ａｃａｒｂｏｓｅａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｌｋａｌｏｉｄｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｆｒｏｍＭ ａｌｂａｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆα ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｖｉｔｒｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｍｏｄｅｌ Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｍａｓｓｆｒａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＪｉｎｔｏｔａｌａｌｋａｌｏｉｄｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｃｉｎａｌｐａｒｔｓｆｒｏｍＭ ａｌｂａｉｓＭｏｒｉＣｏｒｔｅｘａｌｋａｌｏｉｄ（３０ １％）＞ＭｏｒｉＦｏｌｉｕｍａｌｋａｌｏｉｄ（２５ ８％）＞ＭｏｒｉＲａｍｕｌｕｓａｌｋａｌｏｉｄ（２１ ４％） Ｉｎｔｈｅα ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ，ｔｈｅｏｒｄｅｒｏｆｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓＭｏｒｉＲａｍｕｌｕｓａｌｋａｌｏｉｄ＞ＭｏｒｉＦｏｌｉｕｍａｌｋａｌｏｉｄ＞ＭｏｒｉＣｏｒｔｅｘａｌｋａｌｏｉｄ＞ａｃａｒｂｏｓｅ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＡｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＭ ａｌｂａｓｕｃｈａｓＭｏｒｉＦｏｌｉｕｍ，ＭｏｒｉＣｏｒｔｅｘａｎｄＭｏｒｉＲａｍｕｌｕｓ，ＭｏｒｉＲａｍｕｌｕｓａｌｋａｌｏｉｄｓｈｏｗｓｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｓｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆα ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ｗｈｉｃｈｈａｓｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｂｅｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｅｄｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｉａｂｅｔｅｓｏｒｈｅａｌｔｈｆｏｏｄ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ＭｏｒｕｓａｌｂａＬ ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｃｉｎａｌｐａｒｔ；ａｌｋａｌｏｉｄｓ；１ ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ；α ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ糖尿病已成为严重危害人类健康的公共卫生问题，而我国是糖尿病患病率增长较快的国家之一。

中药多酚提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究8?中国现代医药杂志2011年2月第13卷第2期MMJC,Feb2011,V ol13,No.2中药多酚提取物对一葡萄糖苷酶抑制作用的研究林珠灿郭素华【摘要】目的探讨青钱柳和养心草两种中药的多酚提取物对0I一葡萄糖苷酶活性的抑制作用.方法制备两种闽产中药多酚提取物,采用Folin—Ciocalteu法测定多酚含量并研究其对仅一葡萄糖苷酶活性的抑制作用.结果两种提取物总多酚含量达10%VlJ~,并能抑制O/.一葡萄糖苷酶活性.结论这两种中药多酚提取物可作为0l一葡萄糖苷酶抑制剂.【关键词】多酚提取物多酚含量测定仅一葡萄糖苷酶抑制剂StudyoninhibitionofthepolyphenolextractsfromtowChineseherbalmedicineson-glucosi daseLinZhLtCan~GuoSuhu~PhamuweuticUniversity,TraditionalChineseMedicineUniversityof觎,Fuzhou350108【Abstract】ObjectiveTostudytheinhibitoryeffectsofpolyphenolextractsfromtowChineseherbalmedi cinesOil0【一glucosidaseactivity.MethodsQuantitativedeterminationofpolyphenolingredientinprepar ationoftowChineseherbal medicinesfromFujianprovincewasanalyzedbyFolin—Ciocaheuandinhibitoryeffectsonc~-glucosidasewasstudied.Results Thetotalpolyphenolswereabove10%andshowedhighinhibitoryactivety.ConclusionThep olyphenolextractsareconsideredasinhibitor.【Keywords】PolyphenolextractsPolyphenoldetermination一glucosidaseInhibitor 青钱~P(Cyclocaryapaliurus1为胡桃科青钱柳属植物,是我国特有的单属种植物.养心草为景天科植物费菜(SedumaizoonL.)的全草.为福建省药物志所收载.临床研究发现它们具有降血糖,降血脂,降血压等多种保健功能l1l,其主要生物活性成分为多酚类及皂苷等.但对于这两种中药多酚提取物的总多酚含量测定和一葡萄糖苷酶抑制活性未见研究报道.0【一葡萄糖苷酶抑制剂可抑制小肠内仅一葡萄糖苷酶的活性,延缓或抑制葡萄糖在肠道的吸收,从而有效降低餐后高血糖.由于其独特的优势,o【一葡萄糖苷酶抑制剂已被第3次亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降餐后血糖的一线药物[21.德国拜耳公司研制的阿卡波糖和日本武田制药公司研制的伏格列波糖已经被广泛用于糖尿病及其并发症的防治.本研究旨在利用已建立的仅一葡萄糖苷酶体外抑制模型『3_,对闽产青钱柳和养心草的提取物对仅一葡萄糖苷酶的抑制活性进行研究,并测定其总多酚的含量,为今后闽产青钱柳和养心草的开发利用提供理论参考.▲基金项目:陈可冀中西医结合发展基金(CkJ20¨08035ZYX200811);福建省医学创新课题(2007一CX一10)作者单位:350108福建福州,福建中医药大学药学院1材料与方法1.1仪器钱柳,养心草分别采于福建泉州永春县牛姆林自然保护区和龙岩连城兰花公司,经本院中药鉴定教研室鉴定;没食子酸(中国药品生物制品检定所,批号:0831—9501);4一硝基酚一仅一D一吡喃葡萄糖苷(PNPG)(singa公司);Or.一D一毗喃葡萄糖苷酶f0c—D—Glucosidase,Sigma公司);阿卡波糖片(拜耳医药保健有限公司,批号:119873);Folin—Ciocaheu试剂(北京鼎国生物技术有限公司):其余试剂均为国产分析纯.uv一2100分光光度计(北京瑞利分析仪器公司):ELX808酶标仪(美国宝特公司).1.2中药多酚提取物的制备称取青钱柳和养心草粗粉各200g,置2L圆底烧瓶中.加8倍量60%乙醇回流提取2次,每次0.5h,减压回收乙醇,制成浓度为0.5g/ml药液.将药液分别以乙酸乙酯萃取及过聚酰胺柱纯化处理,干燥得到多酚提取物.1.3总多酚的含量测定[411.3.1对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品10mg,置于100ml容量瓶中.加水适量,超声溶解,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,即得f每ml含没食子酸0.1mg1.1-3.2标准曲线的制备分别精密量取对照品溶液0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml,置10ml容量瓶中,各加中国现代医药杂志2011年2月第13卷第2期MMJC,Feb2011,V ol13,No.2?9? 水至约6m1.摇匀,各加F—C试剂1.Oral,充分摇匀5min,加10%碳酸钠溶液3.0ml,用水稀释至刻度,摇匀.在40qC水浴上加热2h,迅速冷却,以相应试剂为空白,立在760nm处测定吸收值,以吸光度为纵坐标.没食子酸含量为横坐标,绘制标准曲线,线性方程为:Y=139.5X+0.0513,r=0.9991.结果表明,没食子酸浓度在0.001～0.01mg/ml范围内线性关系良好.1.3-3总多酚的含量测定分别精密称取多酚提取物0.10g.置于25ml容量瓶中,加60%乙醇溶解并稀释至刻度线,摇匀.精密吸取1.0ml,置于lOml容量瓶中,加水稀释至刻度线.按"标准曲线的制备"项下同法测定吸光值,计算含量.结果见表1.表1两种多酚提取物总多酚的含量测定结果1.40【一葡萄糖苷酶抑制活性的测定[531.4.1酶反应体系以PNPG为底物.标准反应体系为1l2l磷酸钾缓冲液(pH6.8),加入20l0.2U/ml一葡萄糖苷酶.8txlDMSO.37℃恒温反应15min后加入2.5mmol/LPNPG20pA,37℃恒温反应15min.再加入801xl0.2mol/L的Na2CO3溶液,于405nm波长下测定OD值.酶活力单位定义:pH6.8,37℃,每lmin水解底物所产生1I~mol/L硝基酚为1个活性单位.抑制剂活力单位定义为:pH6.8,37oC时使1个酶活力单位失活为1个抑制剂活力单位.抑制百分率=(抑制剂活力/酶活力单位)xlO0%.1_4.2多酚提取物对仅一葡萄糖苷酶活性影响两种多酚提取物均用DMS0溶解,浓度为10mg/ml,用磷酸钾缓冲液稀释l0倍备用.取101~1稀释好的样品与1lOtxl磷酸钾缓冲液,20txl酶液混合37℃恒温反应15min,然后加入20pA底物,37℃反应15min.加入反应终止剂后测定405nmOD值阿卡波糖为阳性对照药物.两种多酚提取物对仪一葡萄糖苷酶活性抑制结果见表2.表2两种多酚提取物的ol一葡萄糖苷酶活性抑制率2讨论2.1青钱柳和养心草的主要活性成分为多酚类,按其结构的不同,可分为酚酸类和黄酮类.本研究采用Folin—Ciocalteau法测定这两种中药多酚提取物中总多酚含量,结果表明,青钱柳和养心草药液经过乙酸乙酯萃取和聚酰胺柱纯化处理获得的多酚提取物中总多酚含量差异明显.可能由于养心草药材中没食子酸的含量更多.而且以乙酸乙酯萃取方法优于聚酰胺柱纯化方法.2.2多酚类成分对于抗氧化活性方面起着重要的作用.目前在降血糖方面报道甚少,而在降糖机制研究中,对o【一葡萄糖苷酶抑制剂的研究较多.许多学者在一葡萄糖苷酶筛选模型方面进行了大量的研究工作.现有应用PNPG为底物的酶一抑制剂筛选模型和以淀粉,蔗糖及麦芽糖为底物的酶一抑制剂筛选模型.本研究采用体外一葡萄糖苷酶体外抑制模型,以PNPG为底物.对青钱柳和养心草多酚提取物的一葡萄糖苷酶抑制活性进行研究.发现其多酚提取物均具有一定一葡萄糖苷酶抑制活性.其中养心草多酚提取物的抑制活性高于青钱柳.由于抑制活性与浓度呈正相关性,而本研究只是进行初步研究,未能筛选出其最佳浓度.研究表明青钱柳和养心草多酚提取物具有较好的o【一葡萄糖苷酶抑制活性,可以采用活性追踪方法对其提取物进一步分离以期筛选出活性成分.参考文献杨武英,上官新晨,徐明生,等清钱柳黄酮对d一葡萄糖苷酶活性及小鼠血糖的影响叫.营养,2007,29(5):507—509康文艺,张丽,张倩.黄连提取物对一葡萄糖苷酶抑制作用研究IJ1.天然产物研究与开发,2009,21:902—904吴酬飞.许杨,李燕萍.0【一葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的研究进展『J1.国际药学研究杂志,2008,35(1):9—12刘顺航,孟宪军,牛涛,等.葡萄籽中总多酚成分的测定fJ].中华中医药杂志,2007.22(10):715—716杨付梅,孙黔云.一葡萄糖苷酶抑制剂微量筛选模型的正交法构建和筛选『J1,2009,25(8):l113一l1l6(收稿:2010—12—09) l2345。

溶液配制底物(pNPG)溶液：pH 值6.8 的0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml)反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。

阳性对照药品阿卡波糖溶液:精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml的浓度。

配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μg/mL DNJ标准母液。

将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60μg/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。

α-葡萄糖苷酶的酶溶液：用磷酸缓冲液配制成0.26 U/ml α-葡萄糖苷酶的酶溶液。

OR 0.2 U/ml?配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。

再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。

样品组（药物种类*浓度组数*3）样品空白组（药物种类*浓度组数）对照组空白组50 μl 磷酸缓冲液 +20 μl 药液 +20 μl PNPG阳性对照组 60 μl 磷酸缓冲液 +20 μl 药液 +20 μl PNPG50 μl 磷酸缓冲液 +20 μl 药液 +20 μl PNPG 70 μl 磷酸缓冲液 +20 μl PNPG80 μl 磷酸缓冲液 +20 μl PNPG振荡使充分混匀 37 ℃水浴10 min+100 μl 酶溶液 振荡使充分混匀 37 ℃水浴20 min+ 150 μl 0.2 mol/L Na 2CO 3在酶标仪405nm 处 测定吸光度+100 μl 酶溶液 +100 μl 酶溶液。