附录A 表达载体的构建
1、大肠杆菌质粒DNA的提取（SDS碱裂解法）
该方法参照分子克隆指南的方法修订而成。
细胞的制备
(1) 将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜。
(2) 将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以最大转速离心30s，将剩余的培养物贮存于4℃。
(3) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
细胞的裂解
(4) 将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的碱裂解液I中，剧烈振荡。
(5) 加200μl新配制的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与碱裂解液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。
(6) 加150μl用冰预冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5min。
(7) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。
(8) 加等量体积的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混合有机相和水相，然后用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。
质粒DNA的回收
(9) 用2倍体积的乙醇于室温沉淀核酸。振荡混合，于室温放置2min。
(10) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，收集沉淀的核酸。
(11) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。
(12) 加1ml 70%乙醇于沉淀中并将盖紧的离心管颠倒数次，用微量离心机于4℃以最大转速离心2min，回收DNA。
(13) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。
(14) 将开口的离心管置于室温使酒精挥发，直至离心管内没有可见的液体存在（5-10min）。
(15) 用50μl含有去DNA酶的RNA酶A（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，温和几秒钟振荡，贮存于－20℃。
2、质粒DNA的酶切、回收与连接
质粒DNA的酶切
(1) 提取的质粒DNA用相应的酶进行酶切。
酶切体系为：
单酶切双酶切
ddH2O 8μl ddH2O 8μl
质粒DNA 10μl 质粒DNA 10μl
10×buffer 2μl 10×buffer 2μl
限制性内切酶Ⅰ0.4μl 限制性内切酶Ⅱ0.4μl
限制性内切酶Ⅲ0.4μl 混匀，简单离心后，37℃水浴反应2-4h。
酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
(2) 单酶切需要用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）去除质粒DNA两端的磷酸基，以防止自身环化。
①酶切产物纯化。取酶切产物加1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积预冷无水乙醇，冰上放置5min，12000rpm离心5min，回收沉淀，用预冷的70%酒精洗涤沉淀2次，倒置风干，用25μl TE Buffer溶解。
②CIAP的去磷酸反应。
DNA 25μl
ddH2O 19μl
10×AP buffer 5μl
CIAP 1μl
混匀，简单离心后，37℃反应1h。
③去磷酸产物纯化。取去磷酸产物加1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积预冷无水乙醇，冰上放置5min，12000rpm离心5min，弃上清，倒置风干，用20μl 以下的TE Buffer溶解。
质粒DNA的回收
采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0进行凝胶回收。
(1) 对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下切出含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的
DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。
(2) 切碎胶块。称量胶块重量，以重量:体积1:3(1mg=3μl)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。
(3) 均匀混合后，75℃加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6-10分钟）。胶块一定要充分融化，否则严重影响DNA回收率。
(4) 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。
(5) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
(6) 将上述操作(4)的溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1 min，将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
(7) 将500μl的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。
(8) 将700μl的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。
(9) 重复操作步骤(8)。
(10) 将Spin Column安置于Collection Tube上，12000 rpm离心1 min。
(11) 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25μl的预热至60 ℃灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 min。
(12) 12000 rpm离心1 min洗脱DNA，4 ℃保存备用。
质粒DNA的连接
将酶切回收的目的片段DNA和载体DNA用T4 DNA ligase进行连接，连接产物可直接转化大肠杆菌。
连接体系：
PEG4000 1μl
Vector 0.5μl
DNA 5.5μl
10×ligase buffer 2μl
T4 DNA ligase 1μl
先将Vector和DNA混合好，置于45℃水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入其他成分，混匀，简单离心后，置16℃过夜。
3、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12法）
全过程都要在冰上进行，且动作尽量要轻
(1) 从37℃培养16-20h的平板中挑取单菌落，转到5ml LB液体培养基中，
37℃，250rpm，培养过夜（约16h）。
(2) 按1%接种量接种到含有50ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，250rpm，培养2-2.5h（定时检测OD600值，使OD600≈0.4）。
(3) 将菌液转移到一个无菌的、一次性使用的、用冰预冷的50ml离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。
(4) 于4℃，4000rpm离心10min，以回收细胞。
(5) 倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
(6) 每50ml初始培养液用30ml冰预冷的0.1mol/L CaC12溶液重悬细胞沉淀。
(7) 于4℃，4000rpm离心10min，以回收细胞。
(8) 倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
(9) 每50ml初始培养液用2ml冰预冷的0.1mol/L CaC12溶液重悬细胞沉淀，置于冰上4-10min，分装成200μl /1.5mL离心管中，于-70℃保存备用。
4、大肠杆菌的转化
(1) 取DNA连接物10μl，冰浴下加入到200μl大肠杆菌感受态细胞中，混匀，冰上放置30min；其间可轻摇管2-3次，防止菌体沉于管底。
(2) 将管放入预加温至42℃的循环水浴中，热激90s，不要摇动管。
(3) 快速将管转移到冰浴中，室细胞冷却1-2min。
(4) 每管加入到800μlSOC液体培养基中，37℃，200rpm温育40min-1h，以使大肠杆菌复苏，并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
(5) 将适当体积（每个90mm平板达200μl）已转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的SOB平板上，室温放置直至液体被吸收。
(6) 倒置平皿，于37℃培养12-16h。
5、重组子的鉴定
(1) 重组子的PCR鉴定：
①从平板上挑取白色单菌落，于装有1ml LB(含有相应抗生素)的1.5ml离心管内37℃培养过夜；
②取1μl菌液作为模板，对单菌落进行PCR鉴定，初步筛选出含目的片段的阳性菌落。
(2) 重组质粒的酶切鉴定：
将待测阳性菌落进行扩培，用SDS碱裂解法进行质粒DNA的提取，通过酶切分析对阳性重组子进行最终确认。
如何阅读分析质粒图谱 日期：2012-04-18来源：未知作者：xilu点击：次 如何阅读分析质粒图谱 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素 1. 复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 2. 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 3. 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 4. P/E 启动子/增强子 5. Terms 终止信号 6. 加poly(A)信号可以起到稳定mRNA作用 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) 所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 1. Ampr水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 2. tetr可以阻止四环素进入细胞。 3. camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
4. neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活 5. hygr使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号
如何阅读质粒图谱 最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于 大家分享。 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素 #复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 ＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+ ＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l ＃P/E 启动子/增强子l ＃Termsl 终止信号 ＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 ＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 ＃增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。 ＃核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。l ＃转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 · 是原核蛋白表达引用最多的系统 · 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 · 真正的调节表达水平的“变阻器”控制 · 提供各种不同融合标签和表达系统配置 · 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 · 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物 · 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λ DE3 溶原菌。 有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT
第三章质粒的分子生物学与质粒载体 一、填空题 1．基因工程中有3种主要类型的载体：——-------、------------一、-----------. 2.由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA的泳动速度—----------—，OC DNA泳动速度—---------—，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。 3.质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点区开始的。然而，质粒的复制可以是—---—向的、或是—----—向的。在杂种质粒中，每个复制子的起点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下—------—的复制起点可能被苯闭。 4.就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：—-----—、—---------—、—----------------—。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5.如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于—---------—群，这是因为它们的——————————所致。 6.质粒拷贝数是指细胞中—------------------------—。 7.复制子由三部分组成：(1)—-----------------—---(2)——-----------————(3)—--------------—。 8.酵母的2μm质粒有------------，可以配对形成哑铃结构。 9.一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫----------------。 10.pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于----——，它的四环素抗性基因来自于—-----------—，它的氨苄青霉素抗性基因来自于—---------—。 11.质粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过—------—恢复该基因的性状。 12.ColEl质粒复制的起始需要三种酶，即—-----------—、一------------和一------。 13．YAC的最大容载能力是—-----------—，BAC载体的最大容载能力是—---------—。 14．pSCl01是一种---------——复制的质粒。 15．把那些没有可检测表型的质粒称为—--------------—。 16．转座子主要由下列部分组成：(1)—-----————————(2)---------------—— (3)—----------------—。
酿酒酵母表达载体 pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF， pY15TEF，pY16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1， 酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZα A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc， 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115， 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列，pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列 pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系 列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET
一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 P/E 启动子/增强子 Terms 终止信号 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AA TAAA 的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AA TAAA的保守序列，此位点down－stream 有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。 回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上. 三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写） 1. 什么是载体
第一节质粒载体 一、质粒的基本特性 1．质粒的复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1 质粒或ColE1 质粒的复制起始位点。图3-1 是其复制其始示意图。 在复制时，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并与DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。 图3-1 带pMB1（或ColE1）复制起点的质粒在复 制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。 2．质粒的拷贝数 质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。表5-1 就是不同类的质粒与复
制子及拷贝数的大致关系。 表3-1 ：质粒载体及其拷贝数 pUC 系列质粒的复制单位来自质粒pMB1 ，但其拷贝数较高。pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ，DNA 聚合酶Ⅲ），依赖于DNA 的RNA 聚合酶，以及宿主基因dnaB 、dnaC 、dnaD 和danZ 的产物。因此，存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMB1（或ColE1）复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚2～3 千个质粒。3．质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔 5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（ector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle ector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制
质粒载体分类及阅读 一.九种表达载体 Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA 二.克隆载体 pTZ19R DNA pUC57 DNA PMD18T PQE30 pUC18 pUC19 pTrcHisA pTrxFus pRSET-A pRSET-B pVAX1 PBR322 pbv220 pBluescript II KS (+) L4440 pCAMBIA-1301 pMAL-p2X pGD926 三.PET系列表达载体 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression System 33b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? p ET Expression Systems Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems plus Competent Cells Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET GST Fusion Systems 41 and 42 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Vector DNA Protein Purification ? Purification Systems ? Strep?Tactin Resins and Purification Kits 四.PGEX系列表达载体 T EcoR pGEX-1 I/BAP pGEX-2T pGEX-2TK pGEX-3X
质 质粒 粒与 与载 载体 体 中央研究院 植物研究所 杜 镇 研究员 一、质粒 绝大多数的生物都是以 DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代 的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication ，或译为复制起点)，使整 个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为 replicon ，我们姑且把它译为为复制体吧！。 原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中 质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼 DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。它们的 基因体约由 2,000 至 150,000 个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如 Borrelia burgdorfferi)。事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。在自然环境中它们相 当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌 (Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌 (Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。以下我们谈的以细菌性质粒为主，尤其是革兰氏阴 性菌的质粒。 二、质粒的类型 当我们谈到质粒的类型时，就要看你从哪个角度来看它们，譬如说抗药性、结合生殖能力、 宿主范围及 DNA 复制方式等等。这些分型标准之间并无横向关联。你无法说能结合生殖的 质粒一定抗药或不抗药，也无法确定宿主范围和质粒套数的调控有何关联。我们用到这些名 词时，只是对特定质粒的性状做一些描述而已。质粒的真正系统分类标准并非靠些性状，而 是依据它们的不共容性(incompatibility)。 有的质粒带有显著特征可供我们侦测它们的存在，无已知特征的质粒称为隐性质粒(cryptic plasmids)；有特征者称为显性质粒(acryptic plasmids)；带有抗药基因的天然质粒称为 R-质 粒(R-plasmids)。有些质粒能在多种不同菌属细胞中生存，我们称它们为泛宿主性质粒 (broad-host-range plasmids)；有一些质粒只能在少数相关宿主中生存，我们称它们为狭宿主 性质粒(narrow-host-range plasmids)。具有结合生殖(conjugation)能力的质粒为结合质粒 (conjugative plasmids)；没有这种能力的质粒便是非结合质粒(non-conjugative plasmids)。其 它如侵袭性质粒(virulence plasmid)、 共生质粒(symbiotic plasmids)及巨型质粒(megaplasmids) 等等有关质粒性状叙述的名词不一而足。 三、质粒的复制 环状质粒的复制形式主要分 theta (θ)及 rolling circle 两种。基因体的复制都是由复制原开始。 原核性复制原约由 250 个碱基对组成，一般质粒的复制原常称为 oriV (origin of vegetative replication)；有时 R-质粒的复制原称为 oriR ；大肠杆菌的复制原称为 oriC 。Theta 形式的质 粒复制与细菌基因体复制一样，以 RNA 聚合脢(RNA polymerase)在复制原制造 RNA 引子 (RNA primer)，然后由 DNA 聚合脢(DNA polymerase)接手由此向两个方向分别复制 DNA ， 直到整个基因体复制完成。在复制过程中当然还有许多其它酵素的参与，这些酵素多由宿主 提供。有的质粒自己携带一些与复制有关的基因，这些基因多被命名为 rep ，如 repA 、repB
酿酒酵母表达载体 pYES2,ｐYES２／NT,ｐYＥS２/CT,pYES3,pYES6,pYCｐlａｃ2２-GＦP, 酵母载体pAUR12３,pRS３03TEF,pRS30４, pRS305,pRS306,ｐY13ＴEF,ｐ Y14TEＦ,pY１５TEF,pＹ16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6,pＳH４７, 酵母单杂载体pHISｉ,pLacZi,pHIＳ2, pGＡD4２4, 酵母双杂交系统:酿酒酵母 Y187, 酿酒酵母AＨ109;质粒pGADＴ7,pGBＫT７;对照质粒pGBKT7－5３,pGBKT７-lam,pGＡDＴ７-T,PCＬ1, 酿酒酵母菌株ＩＮＶＳc1,YM42７1, AH109,Y1８７,Y１９0, 毕赤酵母表达载体pPＩＣ9K,pPIC9Ｋ-His,pPＩＣ3.5K,ｐＰICZalｐhaＡ,B,C,ｐP ＩCZA,B,C,ｐGAPZαA,ｐAＯ8１5,pPIC9k-Hｉs,pＨIL-S1,pＰink ｈc, 配套毕赤酵母Pｉcｈiaｐiｎk, 毕赤酵母宿主Ｘ33,KＭ７１,KM71H,GS115, 原核表达载体pQＥ30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括ｐET系列,ｐＥ T-GST,pGEX系列(含GＳT标签),pMAL系列pMＡL-c2x,－c4x,－ c4e,-c5x,-p5x,pＢＡD,pBAＤHis,ｐＢADmycHis系列,ｐQE系列,pＴｒｃ9９ a,pTrcＨis系列,pＢV２2０,22１,222,pTＸＢ系列,ｐLＬP-oｍ pA,pIN-III-ompA(分泌型表达系列),pQBI6３(原核表达带荧光)pEＴ3a, pET 3d, pET 11a,ｐEＴ12a, ｐEＴ14b, ｐＥT 15b, pＥT 16b, pＥT 17b,pET 19b, pET 2０b, pET 21a,b,d, pET ２2b,ｐET ２3a,ｐET 23b, pET24a,b,pET ２5ｂ, pET 2６b, ｐEＴ27b, pET ２8a,b, pET 29a,pET 30a, pET 31b, pET32a, pEＴ35b, pET 38b, pEＴ３９b,pET 40b, pEＴ４１ａ,b pET 42a,pＥT 43、1ａ,b pET 44ａ, ｐEＴ49ｂpEＴ３０2,303 pET His,pET Dsｂ,ｐET GST,ｐＥT Trx pＱE2, ｐQE9 pQE30,31,32, pQE 4０ｐQＥ７０pQE80L pＱＥTirs sｙstem pR ＳET-A pRSEＴ-B pRSET－C pGEX4T-1,-2,－3,５ｘ-１,6p-1,６p-2,2ｔk,3c ｐＢV22０,221,222 ｐTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAＤＨｉsＡ,B,C pPinPoiｎｔ-Ｘa1,Xa2,Xａ3 pMALc2x, p2x pＢV220 pGEM Ex1, pGEＭ7ZF(+), pＴrｃ99Ａ,ｐTwin1, pEZZ18ｐkk232－８,pｋk ２33-３,pAＣYＣ１８4,pBR３２2,ｐ UC119 pＴYB1,pTYB2,pTYB4,pTＹB11 pＢlueＳcript SK(+),pＢlueSｃript SK(－) ｐLＬP ompA, ｐＩNIIIomｐA,ｐMＢP-P,pＭBP-Ｃ, 大肠杆菌冷激质粒: p ＣｏｌdＩpColｄII ｐColdIIＩpCｏldTF 原核共表达质粒:pＡCYCｄuet－1,ｐ
一、如何阅读质粒图谱 载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。 而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ 多l克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记： （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。 如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 二、相关概念： 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子－为真核l基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子－负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。 l转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA 的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。 三、载体及其分类 载体：即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载
质粒载体的概述及提取 生物技术112班第2学习小组姓名：鲍臻学号：2011013410 本次研讨方向：质粒载体的概述及提取方法介绍 质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒 所携带的特征的改变。大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰 式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。 质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。质 粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于 细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。一些质粒在菌种间可自由地转移它 们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。质粒带 有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、 对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有 机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。 目前提取质粒DNA的方法有两种：煮沸法和碱变性抽提法，而决定用哪种方法是根据 质粒载体的特征来决定的。包括:质粒载体的大小，宿主大肠杆菌的菌株特性及纯化质粒DNA方法。 目前各实验室最常用的质粒DNA提取方法。提取原理主要是根据细菌染色体DNA分子 比质粒DNA分子大得多，也复杂得多，所以染色体DNA和质粒DNA的变性和复性过程有较 大差异，从而达到分离目的。 在pH12的碱性条件下，线性染色体DNA和蛋白质变性充分。质粒DNA大部分氢链也断裂变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当用pH4.8 的KAc的高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA容易恢复到原来的构型，溶解在溶液中，而染色体DNA不能完全恢复原构型，而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA，大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等会一起沉淀。这样将质粒DNA分离出。 实验的步骤： 1.取1~1.5mL过夜培养的细菌加入eppendorf管中，置冰水中。 2.10000~12000 rpm，室温离心5分钟。 3.去上清（如沉淀太少，可再加1~1.5mL菌液，再离心沉淀一次），加入预冷的溶液 I 100 μL（50mmol/L 蔗糖，25mmol/L Tris-HC1pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）， 振荡器上振混匀。
质粒载体的构建 摘要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。 关键词：质粒DNA PCR 电泳感受态转化 1.引言 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： ①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而 传给后代。 ③质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的 特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。 所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体
都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。 质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。 质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。 质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 2. 材料方法 2.1目的DNA的获得 2.1.1 引物设计 第一次引物设计： 正向引物：sinn3F 冰盒标注：P2a 引物序列：5’—AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’ 引物长度：25bp 反向引物：sinn3R 冰盒标注：P2b
（转载） 一.九种表达载体 Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA 二.克隆载体 pTZ19RDNA pUC57DNA PMD18T PQE30 pUC18 pUC19 pTrcHisA pTrxFus pRSET-A pRSET-B pVAX1 PBR322 pbv220 pBluescriptIIKS( ) L4440 pCAMBIA-1301 pMAL-p2X pGD926 三.PET系列表达载体 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNA ProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits 四.PGEX系列表达载体 TEcoR?pGEX-1I/BAP
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 b 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 d P/E 启动子/增强子 e Terms 终止信号 f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发
酿酒酵母表达载体 p YES2 ,p YES2/NT ,p YES2/CT ,p YES3 ,p YES6, pYCp Iac22-GF P, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF PY15TEF, pY16TEF, 酵母基因重组表达载体p UG6, p SH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424,酵母双杂交系统：酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109 ;质粒PGADT7,pGBKT7 ；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T , PCL1, 酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109，丫187，丫190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZ a A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc， 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115, 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62等原核表达载体，包括pET系列， pET-GST, PGEX 系列(含GST标签)，pMAL 系列 pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis 系列，pQE 系 列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB 系列，pLLP-ompA,pIN-HI-ompA (分泌型表达系列),pQBI63 (原核表达带荧光)pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His, pET Dsb, pET GST, pET Trx p QE2, pQE9 p QE30,31,32, pQE 40 p QE70 pQE80L p QETirs system pRSET-A pRSET-B p RSET-C p GEX4T-1,-2,-3,5x-1,6 p-1,6 p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinP oi nt-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF (+) , pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk 233-3, PACYC184, pBR322 ,p UC119 p TYB1, pTYB2, pTYB4, pTYB11 p BIueScri pt SK (+) ,pBlueScript SK (-) pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C,大肠杆菌冷激质粒：pColdI pColdII pColdIII pColdTF原核共表达质粒： pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1, pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣：PG-KJE8 PGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞：DH5a JM101 JM103 JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21( DE3) HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL- 10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21 ( AI) BL21