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第四章(质粒载体)

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基因工程载体

基因工程载体

二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选

基因工程第四章载体

基因工程第四章载体

（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。

第四章 基因工程的质粒载体

第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型

(1)高拷贝数的质粒载体 - 西北师范大学

(1)高拷贝数的质粒载体 - 西北师范大学

西北师范大学 精品课程 武国凡
基因工程
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高拷贝数：自身基因功能控制，与寄主无关
低拷贝数：自身与寄主共同控制，与寄主染色体同步复制
失控：一些低拷贝数的质粒，其复制控制是温度敏感型的。 例如 POU71质粒，在低于 37C下培养，每条染色体平均只有一个拷贝， 但当温度上升到42 C时，其拷贝数可增加到1000个以上。在这种高温环 境下，细胞的生长及蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期 间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了
基因工程
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4.2.2 质粒拷贝数控制
常用的定义是指，生长在标准的培养基条件下，每个细菌细 胞中所含有的质粒DNA分子的数目. •10~100个拷贝，称为高拷贝数质粒，松弛型 •1~4个拷贝，为低拷贝数质粒，严紧型 •质粒最多可以占到细菌总DNA的0.1％ ~ 5％。
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4.4.3 质粒载体的选择记号
素抗性等多种。
包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素EI的免疫性，以及抗菌
绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，而且主要集 中在四环素抗性、氨节青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素 抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。 一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药
西北师范大学 精品课程 武国凡
基因工程
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4.1.3 质粒的转移
4.1.3.1 按结合方式分类类型：结合型和非结合型 雌一雄细胞配对过程为细菌的接合作用。
分类 主要基因
按抗性记 号分类 Col质粒 R质粒 F质粒 Col质粒 R质粒 Col质粒

4第四章 基因克隆的载体-1质粒

4第四章 基因克隆的载体-1质粒
2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因 插入；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，

第四章 人工染色体载体

第四章 人工染色体载体
14×106bp 14Mb 具真核mRNA的加工活性
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆

大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装

第4章 载体的选择与构建

第4章 载体的选择与构建

大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。

pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元

基因工程-第四章

基因工程-第四章

（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
抗菌素抗性
外源DNA 无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors）
直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化 菌细胞才能在选择培养基上生长。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
各类载体
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
3. pUC系列
•University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于1978年，在pBR322 的基础上改造而成，如 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19。 • 元件来源
• 质粒空间构型与电泳速率
分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。
OC L
SC
质粒的生物学基本特性
1.自主复制性
• 质粒复制子是质粒 DNA 中能自主复制并维持正常拷贝数的 一段最小的核酸序列单位。
• 两部分组成：复制起始区（ori）及其相关的调控元件。 • 质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制。 • 质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
必要的条件能力。
理想载体至少必备的条件
① 能在宿主细胞中自主复制 ②容易进入宿主细胞 ③ 容易插入外来核酸片段 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤ 具有合适的筛选标记 ⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性

生物制药工程：第四章-动物细胞工程制药

生物制药工程：第四章-动物细胞工程制药
② 必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质， 避免即使是极微量的有害离子的掺入；
③ 保证有适量的氧气供应； ④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物； ⑤ 有良好的适于生存的外界环境； ⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度；
一、动物细胞的培养条件
1. 器材的清洗和消毒
Sterilization, disinfection: • Spraying Alcohol • UV light • Autoclave • Irradiation • Dry heating • Bleaching?
该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME （Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制 在7.2。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50 代， 上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
（2）BHK-21：
1961年从5只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。 现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经 13次的克隆的细胞。
2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法
化学法
物理法
病毒法
细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法
原生质融合法 染色体介导法
基因枪法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
细胞融合法: cell fusion 脂质体介导法: liposome mediated gene transfer 原生质融合法: protoplast fusion 微细胞介导法: microcell mediated method 鬼影红细胞介导法: ghost mediated method
成纤维细胞,通常用的培养基 为DMEM培养基，添加7%胎 牛血清。过去多用于增殖病毒， 包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和 狂犬病疫苗，现在已被用于构 建工程细胞。

第四章(质粒载体)ppt课件

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25
6.质粒的复制类型
• 两种不同的复制型：
• “严紧型” (stringentplasmid)；
• “松驰型” (relaxedplasmid)。
• 质粒拷贝数的定义：
•
每个细菌细胞中所含有的质粒DNA
•
分子的数目
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26
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27
7．质粒的不亲和性
(1) 质粒的不亲和性现象 (2) 质粒不亲和性的分子基础
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57
第四节重要的质粒载体
• 一.大肠杆菌质粒载体
•ห้องสมุดไป่ตู้
1．pSCl01质粒载体
•
•
2．Co1E1质粒载体
•
3．pBR322质粒载体
•
4．pUC质粒载体
•
5．丧失迁移功能的质粒载体
6.能在体外转录克隆基因的质粒载体
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58
一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图
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19
大肠杆菌F因子基因图
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20
(3)质粒DNA的接合转移机制
•
①细胞交配对的形成： 大肠杆菌F质粒编
码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立
配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它 至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。
•
②质粒DNA的转移F质粒DNA的转移是从转
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pBR322质粒载体的构建过程
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67
pBR322质粒载体的形体图
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68
pBR322质粒载体的结构来源

质粒载体的概况及构建PPT课件

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典型的质粒克隆技术：
① 用限制性内切酶消化DNA样品 ② 用限制性内切酶消化质粒DNA ③ 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 ④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 ⑤ 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选
④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时转化细菌 有两个基本方法：
一是化学法，即用CaCl₂处理并加热激以促进DNA进入 菌体；
You Know, The More Powerful You Will Be
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
★ 质粒不是细菌生长所必须的 ★ 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★ 分子量在1~200kb之间
质粒（plasmid）
特点： 能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予
宿主细胞一些遗传性状。
（二）质粒的基本特性
(1) 自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
质粒载体的概况及制备
质粒载体的概况
1 质粒的定义、命名 2 质粒的基本特性 3 质粒的分类
质粒的定义、命名（：一） 质粒的定义、命名
• 定义：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能 自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。
• 命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后 面接实验编号。
二是电激法，即施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。

第四章(质粒载体)解析

第四章(质粒载体)解析
• • (1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
1．氯化铯密度梯度离心法
• 2．碱变性法
• 3．微量碱变性法
• 4．影响质粒DNA产量的因素 • • (1) 寄主菌株的遗传背景 (2) 质粒的拷贝数及分子大小
分离纯化质粒 DNA的程序
寄主菌株的遗传背景
• 使用endA基因发生突变的(endAl)大肠杆 菌寄主菌株，
pUCl8及PUCl9质粒载体的形体图
丧失迁移功能的pBR327质粒载体的形体图
5．其它重要的质粒载体
• • • • (1)丧失迁移功能的质粒载体 拥有较高水平的拷贝数 失去了bom位点，即便在共存的F质粒提 供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作 用。 • (2)能在体外转录克隆基因的质粒载体
• 定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立 于染色体外的自我复制并稳定遗传的环 状双链DNA分子。 • 命名：小写字母p代表质粒，两个大写 字母代表发明者，后接实验编号， • 分类： • 分布：
1）根据质粒的性状特征
①F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 ②R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数 种抗菌素抗性基因，
大肠杆菌F因子基因图
(3)质粒DNA的接合转移机制
• ①细胞交配对的形成： 大肠杆菌F质粒编 码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立 配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它 至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。 ②质粒DNA的转移F质粒DNA的转移是从 转移起点oriT开始的。
•
•
endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去
了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力， 增进了质粒DNA分子的稳定性。
第二节 质粒DNA的复制与 拷贝数的控制

质粒载体的概况及构建[优质ppt]

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质粒载体的概况及制备
质粒载体的概况
1
质粒的定义、命名
2
质粒的基本特性 3 质粒的分类
质粒的定义、命名（：一） 质粒的定义、命名
• 定义：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能 自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。
• 命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后பைடு நூலகம்面接实验编号。
典型的质粒克隆技术：
① 用限制性内切酶消化DNA样品 ② 用限制性内切酶消化质粒DNA ③ 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 ④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 ⑤ 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选
④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时转化细菌 有两个基本方法：
一是化学法，即用CaCl₂处理并加热激以促进DNA进入 菌体；
★ 质粒不是细菌生长所必须的 ★ 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★ 分子量在1~200kb之间
质粒（plasmid）
特点： 能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予
宿主细胞一些遗传性状。
（二）质粒的基本特性
(1) 自主复制性
质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
（4）可转移性
在天然条件下，大多数质粒可通过细菌接合作用从一 种宿主细胞内转移到另一种宿主内。（例如：通过大肠杆 菌接合）
质粒的分类
（三）质粒的分类
人工构建的质粒载体分类：
① 高拷贝数的质粒载体 ② 低拷贝数的质粒载体 ③ 失控的质粒载体 ④ 插入失活型克隆载体 ⑤ 正选择的质粒载体
质粒的制备
实验室一般使用两种方法制备质粒： （一）碱裂解法 （二）沸水浴法

质粒载体的概况及构建

质粒载体的概况及构建

特性
稳定性
质粒载体可以在宿主细胞内稳 定存在，不易丢失或发生突变
。
可复制性
质粒载体可以在宿主细胞内自 主复制，扩增DNA分子。
可选择性
质粒载体通常携带抗性基因， 可以通过抗生素筛选和富集。
可修饰性
质粒载体可以通过限制性酶切 和连接等分子生物学技术进行
修饰和改造。
质粒载体的应用领域
克隆技术
质粒载体是基因克隆和DN择
天然质粒载体
01
存在于生物体内的天然质粒，具有自我复制能力，可在宿主 细胞内稳定存在。
02
天然质粒通常具有抗生素抗性基因，可作为筛选标记基因。
03
天然质粒载体的复制能力有限，拷贝数较低，且容易丢失。
人工构建的质粒载体
通过基因工程技术人工构建的质粒载体，具有特 定的复制起始位点和筛选标记基因。
转化与筛选
转化
将连接产物导入受体细胞中，常用的受体细胞有细菌、酵母、动物细胞等。
筛选
通过抗性筛选、PCR鉴定等方法对转化子进行筛选，获得阳性克隆。
04
质粒载体的改造与
优化
启动子的优化
选择合适的启动子
启动子突变
根据基因的表达需求，选择合适的启 动子，如强启动子、弱启动子等。
通过突变启动子序列，改变其转录活 性，以实现基因表达的调控。
功能元件
选择含有合适功能元件的质粒载体，如启动 子、多克隆位点等，以满足实验需求。
稳定性
选择稳定性好、不易丢失的质粒载体，以确 保目的基因在宿主细胞内的稳定表达。
03
质粒载体的构建过
程
目的基因的获取与鉴的基因。
目的基因的鉴定
通过测序、限制性酶切、PCR扩 增等手段对目的基因进行鉴定， 确保其准确性。

第四章克隆载体的特征及类型

第四章克隆载体的特征及类型
一个强的选择标记。 4. 具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区
内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。 5. 能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 6. 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质
粒载体。
质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必 须对之进行改造构建： （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
质粒的构建
质粒
天然存在的两种质粒 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-
30/cell
pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell ，标记基因为Tcr
理想的质粒载体应具备的条件
1. 分子量较小。 2. 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。 3. 具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
l - DNA
阻遏基因
重组基因
删除与整合基因
COS
3’
5’ TCCAGCGGCGGGG
头部合成基因
尾部合成基因
CCCGCCGCTGGA 5’
3’
COS
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
l 噬菌体生物学特性： 感染周期
E.coli
裂解
优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，

质粒载体介绍(质粒基本特性和种类及标记基因)

质粒载体介绍(质粒基本特性和种类及标记基因)

质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）2010-01-25 13:25:29 来源：易生物实验浏览次数：6084 网友评论 0 条一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类关键词：质粒载体质粒载体标记基因一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。

在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。

在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。

图3-1 是其复制其始示意图。

在复制时，首先合成前 RNAⅡ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前 RNAⅡ，使之成为成熟的 RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。

形成的 RNAⅠ可控制 RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强 RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。

削弱 RNAⅠ和 RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有 pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。

图 3-1 带 pMB1（或 ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。

2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。

严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

表 5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。

表 3-1 ：质粒载体及其拷贝数质粒 复制子 拷贝数pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20pUC 系列质粒及其衍生质突变的 pMB1 500～700粒pACYC 及其衍生质粒 p15A 10～212pSC101 及其衍生质粒 pSC101 ～5ColE1 ColE1 15～20pUC 系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。

pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ，DNA 聚合酶Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和danZ 的产物。

4第四章 基因克隆的载体-3柯斯质粒

4第四章 基因克隆的载体-3柯斯质粒

因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外 包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式 将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬 菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内并自 我复制。 柯斯质粒（cosmid）
cos位点 cos site-carring plasmid 质粒
二、柯斯质ห้องสมุดไป่ตู้载体的特点
Formation of a cosmid clone
Digestion
Ligation
C) Packaging and infect
Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.
③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，不易 于检测：因此如用柯斯质粒制备基因文 库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌 落很费时间。现虽建立了高密有可能通过同宿主基因组交换而致丢失 等，所以最常使用的还是噬菌体载体。
第三节 柯斯质粒(cosmid)
一、柯斯质粒（cosmid）概述
1、定义：是由λ噬菌体与质粒（plasmid）共同构 建而成的杂合载体。 2、柯斯质粒DNA:
λ噬菌体的cos位点:使其可被包装蛋白识别包装； 质粒的复制起点：使其在宿主细胞中可自主复制。
另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列， 质粒中的抗性标记基因（如：AmpR，TetR），以 及酶切位点（EcoRⅠ、HindⅢ）。
四、柯斯质粒作载体的优、缺点
1、优点： 可携带外源基因大， 30～44.5 kb 。

第四章 基因克隆的质粒载体

第四章 基因克隆的质粒载体
2021/8/4
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2021/8/4
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2021/8/4
碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
2021/8/4
2021/8/4
8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
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氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
2021/8/4
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
2021/8/4
2021/8/4
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
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1．pSCl01质粒载体
2．CoEEl质粒载体
pSCl01质粒作载体克隆非洲爪赡的基因
3．pBR322质粒载体
• (1)pBR322质粒载体的构建 • (2)pBR322质粒载体的优点 • 具有较小的分子量 • 具有两种抗菌素抗性基因可供作转 • 化子的选择记号。 • 具较高的拷贝数 • (3)pBR322质粒载体的改良
•
endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去
了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力， 增进了质粒DNA分子的稳定性。
第二节 质粒DNA的复制与 拷贝数的控制
•
1．质粒DNA复制的多样性 2．ColEl质粒DNA复制的启动
•
•
•
3．质粒DNA拷贝数的控制
(1)天然质粒拷贝数的控制
•
• • •
(2)杂种质粒拷贝数的控制
芽孢杆菌穿梭质粒载体，大肠杆菌—酿
酒酵母穿梭质粒载体。
大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒载体
第六节质粒载体的稳定性问题
• 1．质粒载体不稳定性的类型
• • • • • • • • • • • • • • (1)结构的不稳定性 (2)分离的不稳定性
2．影响质粒载体稳定性的主要因素
(1)新陈代谢负荷 (2)拷贝数差度 (3)寄主重组体系
pUCl8及PUCl9质粒载体的形体图
丧失迁移功能的pBR327质粒载体的形体图
5．其它重要的质粒载体
• • • • (1)丧失迁移功能的质粒载体 拥有较高水平的拷贝数 失去了bom位点，即便在共存的F质粒提 供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作 用。 • (2)能在体外转录克隆基因的质粒载体
• 一.大肠杆菌质粒载体 • 1．pSCl01质粒载体
•
•
•
2．Co1E1质粒载体
3．pBR322质粒载体
•
•
4．pUC质粒载体
5．丧失迁移功能的质粒载体
6.能在体外转录克隆基因的质粒载体
一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图
二、酵母菌质粒载体（穿梭质 粒）
• • • • • • １．酵母2µ 质粒 ２．乳酸克鲁维酵母中的线性质粒 ３．大肠杆菌－酵母穿梭质粒 ４．酵母表达型质粒 ５．酵母分泌型表达质粒 ６．酵母人工染色体－YAC
EcoRI
Somastetin
BamHI
EcoRI
EcoRI
ligation
Lac-β-gal
pSomIII -3
somastetin
4．pUC质粒载体
• (1)pUC质粒载体的结构 • (2)pUC质粒载体的优点 • 第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数 • 第二，适用于组织化学方法检测重组体 • 第三，具有多克隆位点MCS区段
3．质粒载体的选择记号
• 在基因克隆中采用的质粒载体的选 择记号，有新陈代谢特性、对大肠杆菌 素E1 的免疫性，抗菌素抗性等。使用抗 菌素抗性记号有四环素抗性、氨苄青霉 素抗性、链霉素抗性，卡那霉素抗性等
正选择质粒载体PKN80的形体图
4．不同类型的质粒载体
• (1)高拷贝数的质粒载体 • (2)低拷贝数的质粒载体 • (3)失控的质粒载体 • (4)插入失活型的质粒载体 • (5)正选择的质粒载体 • (6)表达型的质粒载体
pBR322质粒载体的构建过程
pBR322质粒载体的形体图
pBR322质粒载体的结构来源
pBR322质粒载体tet基因的插入失活效应
EcoRI pBR322
HaeⅢ λ
plac
HaeⅢ EcoRI
EcoRI EcoRI
HaeIII
Klenow
ligation
HindIII
pBH20 BamHI
•
非接合型的质粒(non—conjugative plasmid)，不能 自我转移是因为没有了控制细胞配对和接合转移的基因。
(2)F质粒
•
又叫F因子(ferti1ity factor) ，单拷贝的接合型质粒， 其分子量约为94kb，共编码19个转移基因(tra)。F质粒 有三种存在方式： • (i)以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带 有染色体的基因或DNA区段。这样的细胞叫做F+细胞。 • (ii)以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时还携 带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F’ 细胞。 • (iii)以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色 体上，这样的细胞叫做Hfr细胞(高频重组细胞)。
• 定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立 于染色体外的自我复制并稳定遗传的环 状双链DNA分子。 • 命名：小写字母p代表质粒，两个大写 字母代表发明者，后接实验编号， • 分类： • 分布：
1）根据质粒的性状特征
①F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 ②R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数 种抗菌素抗性基因，
4．质粒复制控制的分子模型
(1)抑制蛋白质稀释模型 (2)自体阻遏蛋白质模型
质粒DNA的复制与拷贝数的控制
• 1．质粒DNA复制的多样性 • (i) 对寄主酶的依赖性 • (ii) DNA聚合酶的利用 • (iii) 复制的方向性 • (iv) 复制的终止 • (v) 复制型
• 2．ColE1质粒DNA复制的启动 • 3．质粒DNA拷贝数的控制 • (1)天然质粒拷贝数的控制
大肠杆菌F质粒转移区结构--该区编码着控制细胞接合作用的基因
质粒DNA的接合转移及复制
5．质粒DNA的迁移作用
• 共存的接合型质粒引发的非接合型 质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。
F因子带动Co1E1质粒转移的条件
6.质粒的复制类型
• 两种不同的复制型： • “严紧型” (stringentplasmid)； • “松驰型” (relaxedplasmid)。 • 质粒拷贝数的定义： • 每个细菌细胞中所含有的质粒DNA • 分子的数目
7．质粒的不亲和性
(1) 质粒的不亲和性现象 (2) 质粒不亲和性的分子基础
8.质粒的其他特性
• 稳定性：维持一定的拷贝数
• 同源性：不同的质粒有相同的同源区
• 重组性：质粒间、质粒同染色体间重组 • 消除和恢复性等特性
三.质粒DNA的分离与纯化
• 1．氯化铯密度梯度离心法 • 2．碱变性法 • 3．微量碱变性法 • 4．影响质粒DNA产量的因素
pSP64质粒载体的形体图
pSP64与PSP65质粒载体的多克隆位 点区的核苷酸序列结构
(3)穿梭质粒载体
• 穿梭质粒载体(shuttleplasmidvector)， 是指一类由人工构建的具有两种不同复
制起点和选择记号，在两种不同的寄主
细胞中存活和复制的质粒载体。
•
பைடு நூலகம்
穿梭质粒载体，有大肠杆菌—枯草
lac
Hha HindIII
EcoRI
EcoRI
HindII I pBH20 BamHI BamHI EcoRI ligation
lac
Hha HindIII
Samastetin BamHI
EcoRI
lac PstI
Hha HindIII
psomI
EcoRI Samastetin
BamHI
PstI Amp pBR322 EcoRI
环 形 双 链 质 粒 分 子 的 三 种 构 型
DNA
质粒DNA的分子构型 质粒DNA琼脂糖 凝胶电泳模式图
(a)
(b)
OC L
SC
3.质粒DNA编码的表型
• 质粒DNA编码的基因有产生抗菌素的基因、 芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、产生肠毒 素基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因、
• 抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子，
质粒的基本生物学特性
• 1.寄生性 • 2．质粒DNA
•
(图4—1)
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
质粒DNA分子具有三种构型
• SC构型: 共价闭合环形DNA(cccDNA)， • 超螺旋的 SC构型； • OC构型: 开环DNA(ocDNA)，OC构型； • L构型: 发生双链断裂而形成线性分子 • (LDNA)，L构型。（图4－2）
•
1．天然质粒用作克隆载体的局限性 2．质粒载体必须具备的基本条件 3．质粒载体的选择记号 4．不同类型的质粒载体
(1)高拷贝数的质粒载体 (2)低拷贝数的质粒载体
•
• • •
(3)失控的质粒载体
(4)插入失活型的质粒载体 (5)正选择的质粒载体 (6)表达型的质粒载体
1． 天然质粒用作克隆载体的局限性
诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因，以及寄主
控制的限制与修饰系统的基因等
4．质粒DNA的转移
• (1) 接合型质粒的自我传递 • (2) F质粒 • (3 )质粒DNA的接合转移 • • ①细胞交配对的形成 ②质粒DNA的转移
细菌的接合作用
• 在合适的条件下，雄性细胞和雌性 细胞混合培养，形成 雌—雄细胞配对过
程为细菌的接合作用(conjugation)。
• 在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中
的F因子按滚环复制模式(rolling circle
replication model)，
(1) 接合型质粒的自我传递
• • 格兰氏阴性细菌的质粒分成接合型和非接合型。 接合型的质粒(conjugative plasmid)，又叫自我转 移的质粒。除了具有自主复制所必须的遗传信息之外， 还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
Co1质粒 ：产生大肠杆菌素因子。编码
有控制大肠杆菌素合成的基因
质粒分类
• 2）根据质粒的传递性
• 3）根据质粒的拷贝数
• 4）根据质粒和细菌的关系 • 4.质粒分布、大小和数目