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第四章基因克隆的质粒载体详解

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基因工程载体

基因工程载体

二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选

基因工程第四章载体

基因工程第四章载体

（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。

基因克隆的质粒载体详解124页PPT

基因克隆的质粒载体详解124页PPT
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基因克隆的质粒载体详解
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第四章 基因工程的质粒载体

第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型

(1)高拷贝数的质粒载体 - 西北师范大学

(1)高拷贝数的质粒载体 - 西北师范大学

西北师范大学 精品课程 武国凡
基因工程
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高拷贝数：自身基因功能控制，与寄主无关
低拷贝数：自身与寄主共同控制，与寄主染色体同步复制
失控：一些低拷贝数的质粒，其复制控制是温度敏感型的。 例如 POU71质粒，在低于 37C下培养，每条染色体平均只有一个拷贝， 但当温度上升到42 C时，其拷贝数可增加到1000个以上。在这种高温环 境下，细胞的生长及蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期 间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了
基因工程
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4.2.2 质粒拷贝数控制
常用的定义是指，生长在标准的培养基条件下，每个细菌细 胞中所含有的质粒DNA分子的数目. •10~100个拷贝，称为高拷贝数质粒，松弛型 •1~4个拷贝，为低拷贝数质粒，严紧型 •质粒最多可以占到细菌总DNA的0.1％ ~ 5％。
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4.4.3 质粒载体的选择记号
素抗性等多种。
包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素EI的免疫性，以及抗菌
绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，而且主要集 中在四环素抗性、氨节青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素 抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。 一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药
西北师范大学 精品课程 武国凡
基因工程
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4.1.3 质粒的转移
4.1.3.1 按结合方式分类类型：结合型和非结合型 雌一雄细胞配对过程为细菌的接合作用。
分类 主要基因
按抗性记 号分类 Col质粒 R质粒 F质粒 Col质粒 R质粒 Col质粒

4第四章 基因克隆的载体-1质粒

4第四章 基因克隆的载体-1质粒
2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因 插入；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，

第4章 载体的选择与构建


大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。

pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元

基因工程-第四章


（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
抗菌素抗性
外源DNA 无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors）
直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化 菌细胞才能在选择培养基上生长。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
各类载体
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
3. pUC系列
•University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于1978年，在pBR322 的基础上改造而成，如 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19。 • 元件来源
• 质粒空间构型与电泳速率
分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。
OC L
SC
质粒的生物学基本特性
1.自主复制性
• 质粒复制子是质粒 DNA 中能自主复制并维持正常拷贝数的 一段最小的核酸序列单位。
• 两部分组成：复制起始区（ori）及其相关的调控元件。 • 质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制。 • 质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
必要的条件能力。
理想载体至少必备的条件
① 能在宿主细胞中自主复制 ②容易进入宿主细胞 ③ 容易插入外来核酸片段 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤ 具有合适的筛选标记 ⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性

第4章 基因工程载体


的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。一种
理想的质粒克隆载体应该具有两种选择标记基因，并且在选 择标记基因内有合适的克隆位点。常用的选择标记基因主要 是抗生素的抗性基因[如四环素抗性（Tetr或Tcr）、氨苄青霉 素抗性（Ampr或Apr）、卡那霉素抗性（Kanr或Kmr）、氯 霉素抗性（Cmlr或Cmr）、链霉素抗性（Strr或Smr）等]和β半乳糖甘酶基因。

（5）基因工程所应用的质粒通常为非传递性的松弛型质粒，
安全可控，不至于对操作者和环境带来不必要的危害。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
三、常用的质粒载体

1. pBR322质粒载体 1977年，F. Bolivar和R. L. Rodriguez 构建了一个典型的用
于基因克隆的通用质粒载体—pBR322质粒载体。目前使用
白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是
双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA以及单链 RNA等多种形式。不同种噬菌体之间，其核酸的分子量相差 可达上百倍。而且有些噬菌体的DNA碱基并不是标准的A、T、 C、G四种碱基组成。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
溶源性噬菌体的生命周期（引自吴乃虎，1998）
导致Ampr基因的失活。这种因DNA插入而导致基因失活的现
象，称之为插入失活效应。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
大肠杆菌pBR322质粒载体的结构图
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
pUC质粒载体

1987年，美国加利福尼亚大学（University of California）的 科学家J. Messing 和J. Viria在pBR322质粒框架基础上构建

第四章基因克隆的载体、噬菌体载体

噬菌体再感染。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
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5、 质粒的类型
•根据分子特性，革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种
接合型 又叫自主转移的质粒 具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套 控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
可以在不同细胞间转移。
非接合型的质粒 不能自我转移的质粒，失去控制细菌配对和质粒接合 转移的基因。 不能自主转移。
F质粒的tra区包含细菌接合所需的基因
基因克隆载体系统
•质粒载体
•噬菌体载体
•柯斯质粒载体
•单链噬菌体载体
染色体载体
•其它特殊用途载体
一、基因工程四大要素：
目的基因
工具酶
克隆载体 受体系统
二、为什么要用克隆载体？
• 单独的基因不易进入细胞 • 进入后不能维持. 三、什么是克隆载体？
vector 通过不同途径能将承载的外源DNA片段带 入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分 子称为DNA克隆载体或基因克隆载体。
•常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。 这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具 有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生 抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及 降解复杂的有机化合物等。
质粒通过合成长 效致死物和短效 解毒剂得以在细 菌中生存.
2.质粒的生物学特征
只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。 自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的 线粒体中都发现有质粒的存在。
质粒绝大多数是环形双链的DNA
但也存在有线形质粒 、RNA质粒（酵母的杀伤质粒） 质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有 一些质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随 染色体的复制而复制,称为附加体。
3.环形双链DNA质粒分子组成与构型 多数为双链环状DNA分子. 分子量从不足2kb 到100kb以上,多数为10kb左右.
质粒的转移与迁移.
转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞. 迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下,从一个细 胞移至另一种细胞.
质粒迁移的条件（自身编码） ①bom位点(col E1) nic 位点. ②mob基因.结合动员基因.编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶, 切割nic位点.
在基因工程中得到大量的应用.
重 组 质 粒
受 体 细 胞
接 合
供 体 细 胞
辅 助 质 粒 D N A 转 移
三亲杂交法
•根据质粒的性状特征，可分为五种不同的类型：
F(Fertility)质粒: Ｒ(Resistance)质粒 Col质粒 降解质粒（Degradative plasmids） 致瘤质粒（Virulence plasmids）农杆菌Ti质粒
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。
因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另 一种细胞,这种方法叫三亲杂交法.
一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌 三者共培养过夜.
具有三种不同的构型：
共价闭合环形DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持完整的 环形结构。DNA呈超螺旋的SC构型。 开环DNA(ocDNA)：有一条保持完整的环形结构，另一条链 出现有一至数个缺口。即OC构型。 线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺 旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
根据质粒的转移功能分类
按接合转移功能分 类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因 自主复制基因，抗菌素抗性基因
按抗性记号分类
Col质粒 R质粒(R因子)
接合型质粒
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区 F质粒（ F因子） 段 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基 Col质粒 因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基 R质粒(R因子) 因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基 Ent质粒 因
1. 质粒的特点： •已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围 较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。 •是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 •已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝 并将质粒分子精确地分配给子代细胞。
•其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。
4.必须是安全的。
五、克隆载体的种类
根据来源可分为：
质粒载体
病毒或噬菌体载体 质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的克隆载体 质粒DNA与染色体DNA片段组成的克隆载体等
根据用途可分为： 表达克隆载体 启动子探针型载体 cDNA克隆载体等
根据应用对象可分为： 原核生物克隆载体、植物克隆载体和动物克隆载体等。
载体具有如下功能:
1.运送外源基因高效转入受体细胞
2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
四、作为克隆载体的DNA分子必须具备主要条件：
1.有1至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。 2.能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而 同步复制。 3.必须具有用于选择克隆子的标记基因。
根据其复制或存在 方式可分为:
自主复制型载体和
附加载体
第四章 基因克隆的质粒载体
一、与构建克隆载体相关的质粒性质
质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制 的遗传成份. Plasmid一词由Joshua Lederberg于1952年提出。
质粒的命名:
例:pBR322 p代表质粒; “BR”代表两位研究者 Bolivar和Rogigerus 姓氏的字首,“322”是实验编号 .
正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反
4. 作为克隆载体质粒的条件
适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括 三种共同的组分： 复制子 选择性标记基因 克隆位点 基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数