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— 435 —CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.42 No.5 2019 解剖学杂志 2019年第42卷第5期* 2018年甘肃省高校科研基金项目（2018A-144，2018A-146） 第1作者E-mail ：wmxie2014@△通信作者，E-mail ： 2531295072@收稿日期：2019-03- 27；修回日期：2019-06-26doi ： 10.3969/j.issn.1001-1633.2019.05.001·论 著·小鼠精巢生殖细胞减数分裂各时相识别*谢文美 周凤娟△ 王 强 赵小荣 朱春燕（甘肃医学院，1 遗传病研究室，2 基础医学院生物教研室，平凉 744000）摘要 目的：识别鉴定哺乳动物小鼠精巢生殖细胞减数分裂各时相细胞。
方法：结合减数分裂过程染色体变化及秋水仙素抑制纺锤体形成原理，分析观察改良制作小鼠精巢生殖细胞减数分裂染色体标本，比较各时期细胞及染色体形态变化。
结果：鉴定出小鼠减数分裂第1次分裂、第2次分裂及精子形成过程各细胞形态特征图谱，并详细解析了识别各时期细胞染色体构型变化要点，同时也简要阐述了秋水仙素的应用对识别细胞各时相染色体的影响。
结论：小鼠精巢生殖细胞减数分裂染色体变化复杂，建立完整的清晰图谱可为减数分裂课程教学及染色体异常研究提供参考。
关键词 减数分裂；秋水仙素；染色体；性泡；小鼠Identification of the meiotic events in mouse spermatogenesis *Xie Wenmei ，Zhou Fengjuan △，Wang Qiang ，Zhao Xiaorong ，Zhu Chunyan（1. Laboratory of Genetic Disease ，2. Department of Basic Medical Science ，Gansu Medical College ，Pingliang 744000，China ）Abstract Objective ：To identify the chromosomal behavior characteristics of meiotic events in mouse spermatogenesis. Methods ：The chromosome changes of the mouse germ cells in meiosis were systematically observed by modified methods of germ cells in mice based on the changes of chromosome in meiosis process and the inhibition of spindle formation by colchicine. Results ：All the morphological characteristics of cells in the first division ，second division and sperm formation of mice were established ，and the main changes of cell chromosome configuration were analyzed. The effects of colchicine on cells to identify the chromosome changes were briefly described. Conclusion ：The establishment of complete and clear cell map in meiosis in mouse spermatogenesis provides reference for the teaching of meiosis course and the study of chromosome abnormalities.Key words meiosis ；colchicine ；chromosome ；sex body ；mouse减数分裂过程中不同时相染色体变化复杂，染色体减数分裂异常也是许多人类遗传病发生的主要原因之一。
小鼠精巢生殖细胞减数分裂各时相识别谢文美; 周凤娟; 王强; 赵小荣; 朱春燕【期刊名称】《《解剖学杂志》》【年(卷),期】2019(042)005【总页数】5页(P435-438,封2)【关键词】减数分裂; 秋水仙素; 染色体; 性泡; 小鼠【作者】谢文美; 周凤娟; 王强; 赵小荣; 朱春燕【作者单位】甘肃医学院遗传病研究室平凉 744000; 甘肃医学院基础医学院生物教研室平凉 744000【正文语种】中文减数分裂过程中不同时相染色体变化复杂，染色体减数分裂异常也是许多人类遗传病发生的主要原因之一。
准确观察和识别减数分裂各时相特点是医学细胞生物学课程学生熟悉细胞生命活动的重要组成部分，也是医务工作者及有关研究者必须具备的技能。
然而目前多数教材及参考文献[1-3] 多以蝗虫为主，且各时期辨识描述及图谱简单且不清楚。
苏爱等[4] 采用十一酸睾酮与秋水仙素联合应用的方法制备，提高了对小鼠减数分裂前期I染色体标本分裂相细胞的检出率；Cai等[5] 通过免疫荧光染色方法制备并清晰分辨小鼠精母细胞联会复合体，对减数分裂第1次分裂前期观察具有很好的参考价值，但都未对小鼠减数分裂各时相识别及染色体的影响做介绍。
本研究应用常规小鼠睾丸生殖细胞减数分裂制片并加以改进，同时运用不同染色方法获取良好的观察标本，进行了大量对比形态学观察，以期为减数分裂课程教学及染色体异常研究提供参考。
1 材料和方法1.1 实验动物与试剂6～8周龄的ICR/JCL品系雄性小鼠4只（购买于兰州大学实验动物中心），体质量25 g 左右，用鼠颗粒饲料喂养，常规饮水。
秋水仙素、Giemsa染液购自广州市达晖生物技术有限公司；苏木精-伊红染液购自上海舜百生物科技有限公司；枸橼酸钠、甲醇、冰醋酸等常规分析纯购置。
1.2 小鼠生殖细胞减数分裂染色体标本制备雄性小鼠经腹腔注入秋水仙素（1 μg/kg）处理。
3～4 h后颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，迅速分离双侧睾丸，于盛有2%枸橼酸钠溶液的培养皿中，用眼科剪和尖头镊子剥离睾丸外膜，暴露精细小管，移入10 ml 离心管管口，用眼科剪将精细小管剪碎呈糊状，以尽可能多释放生殖细胞。
小白鼠染色体标本的制作染色与观察染色体是生物体内的遗传物质DNA和蛋白质的组合体，通过对染色体的观察可以了解生物种群的遗传信息和进化变化。
染色体观察在遗传学、病理学等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍小白鼠染色体标本的制作方法以及染色和观察的步骤。
1.小白鼠染色体标本的制作方法制作小白鼠染色体标本的过程主要包括取材、处理和固定等步骤。
（1）取材选择健康的小白鼠，尤其是发育期的小白鼠，取得其骨髓或肝脏等组织。
取材时要注意卫生和无菌操作，以保证样品的质量。
（2）处理将取得的骨髓或肝脏等组织放入离心管中，加入等体积的生理盐水悬浮液，并在其中加入适量的KCl溶液进行渗透，使细胞膜变得脆弱，易于裂解释放染色体。
（3）固定将处理后的细胞悬浮液滴到已经消毒的玻璃片上，然后迅速将玻璃片倾斜，让细胞悬浮液自然扩散开来。
待其固定后，用甲醛进行固定处理，固定时间一般为5-10分钟。
2.小白鼠染色体染色的步骤（1）裂解将固定的标本玻璃片在室温下迅速加热至约60℃的热板上，使染色体细胞裂解释放出染色体。
裂解时间一般为5-10分钟。
（2）染色将裂解后的细胞标本浸泡在浓度适当的染色液中，常用的染色液有乔治染色液、甲酸-吡啶染色液和乙酸酒精染色液等。
对于小白鼠染色体标本的染色，乔治染色液是较为常用的选择。
（3）洗涤染色后的标本需要进行洗涤步骤以去除多余的染色液和固定剂。
使用生理盐水或磷酸缓冲液进行反复洗涤，直到洗涤液清澈。
3.小白鼠染色体观察的步骤在染色体标本制作和染色之后，我们可以通过显微镜进行小白鼠染色体的观察，并对染色体进行测量和特征描述。
（1）显微镜观察将染色后的标本玻璃片固定在显微镜载玻片上，使用显微镜进行观察。
观察过程中可以选择不同倍数的镜头以获得更详细的图像。
（2）测量和特征描述通过观察染色体在显微镜下的形态和结构，我们可以测量染色体的长度、形状等参数，并对染色体的特征进行描述，如染色体数量、着丝点的位置等。
总结：小白鼠染色体标本的制作染色与观察是一项重要的生物实验技术，可以帮助我们了解生物的遗传特征和疾病的发生机制。
良好小鼠染色体标本的关键步骤染色体标本制备是进行细胞遗传学与基因组学研究的重要步骤之一，尤其在小鼠模型中。
良好的染色体标本可以为后续的染色体分析提供准确可靠的数据基础，因此染色体标本的制备过程至关重要。
本文将介绍良好小鼠染色体标本制备的关键步骤。
1. 细胞培养与预处理在开始染色体标本制备之前，首先需要对小鼠细胞进行培养和预处理。
细胞应该在无菌条件下培养，以确保细胞的健康状态和纯度。
同时，在细胞培养的过程中，应加入适量的细胞分裂抑制剂，如科林霉素或染色体解旋酶抑制剂，以防止染色体的损伤和断裂。
2. 细胞采集与固定经过适当的培养和预处理后，可以开始进行细胞采集与固定的步骤。
通常采用离心沉淀法或原位固定法进行细胞的采集。
离心沉淀法适用于大规模采集细胞，而原位固定法适用于对特定细胞进行选择性标本制备。
无论采用哪种方法，细胞在采集后应立即进行固定以避免细胞结构的变形和损伤。
3. 细胞裂解与染色体释放细胞固定后，接下来需要进行细胞的裂解与染色体释放。
常用的裂解方法有加入低渗透压缓冲液或高渗透压缓冲液，使细胞膜破裂释放染色体。
此外，还可以通过超声波处理或机械剪切等方法促进细胞的裂解和染色体的释放。
裂解后的细胞溶液应进行离心，以分离出染色体。
4. 染色体的固定与染色离心后的染色体需要进行固定与染色，以保持其形态结构和增强对染色体的观察。
常用的固定方法包括加入甲醛或醋酸乙酯等，固定时间需根据实验需求进行调整。
染色体的染色可以通过Giemsa染色、DAPI染色等方法进行。
染色后的染色体应进行洗涤以去除多余染料。
5. 染色体的显微观察与分析经过固定和染色的染色体标本可以进行显微观察与分析。
通常使用光学显微镜或荧光显微镜进行观察，并可以利用图像分析系统对染色体进行计数、测量和分析。
在观察和分析过程中，应注意保持显微镜和标本的清洁，以避免杂质的干扰和误判。
良好小鼠染色体标本的制备是一个复杂的过程，需要经过细胞培养与预处理、细胞采集与固定、细胞裂解与染色体释放、染色体的固定与染色以及染色体的显微观察与分析等关键步骤。
科目细胞生物学实验题目小鼠染色体标本的制作、染色与观察姓名***系年级2011级生物基地学号*** 同组者***日期2013/05/23、302013/05/30小鼠染色体标本的制作、染色与观察【实验目的】1.初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法，了解各操作步骤的原理。
2.了解常用实验动物染色体的数目及特点。
3.认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组形图。
【实验原理】凡处于活跃增殖状态的细胞，或者经过各种处理后，任何动物组织的细胞就可进入分裂，均可用于染色体分析。
在正常动物体内，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。
给动物注射一定剂量的秋水仙素，即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。
本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。
骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。
但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。
对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1.用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2.用低渗法使细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3.空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa 染色后便可观察到染色体的显微图象。
Giemsa染色是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。
主要用Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。
【实验材料】1.试剂：秋水仙素、生理盐水（0.9%的NaCl溶液）、0.3%KCl低渗溶液、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液。
2.器具：解剖盘、镊子、眼科剪、小烧杯（×2）、吸管、玻璃刻度离心管、恒温水浴锅、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等。
题目：小鼠细胞染色体染色观察一．O bjectives:1.Learn the method of preparation of mouse chromosome frommarrow.学习制备从骨髓中制备小鼠染色体的方法。
2.Understand the morphology and amount of mouse mitotic.了解小鼠有丝分裂期细胞染色体的形态和数量。
二．实验原理1.秋水仙碱，一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙中提取出来，故名，也称秋水仙素。
纯秋水仙碱呈黄色针状结晶，熔点157℃。
易溶于水、乙醇和氯仿。
味苦，有毒。
秋水仙碱能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。
这种由秋水仙碱引起的不正常分裂，称为秋水仙碱有丝分裂。
在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。
2.现今微丝标记方法分为在细胞中标记微丝和活体细胞中标记微丝。
固定细胞中的微丝主要是用带荧光探针的抗体或鬼笔环肽标记，需要对样品进行化学固定和膜的通透。
活体标记常采用荧光类似物标记的方法和GFP标记方法。
三．实验材料及设备1.实验材料：a)秋水仙素稀释液b)小鼠一只c)75mM KCl低渗溶液d)固定液e)Giemas染液2.实验设备：a)普通光学显微镜b)载玻片若干，注射器。
c)酒精灯d)离心管若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四．实验方法及步骤1.提前3-4h向小鼠腹腔中注射秋水仙素，然后用引颈法处死小鼠。
2.完整取出小鼠股骨（胫骨），取出骨骼表面肌肉和其他结缔组织。
3.将胫骨两端剪开，用注射器吸取适量75mM KCI将骨髓冲洗到离心管中。
4.低渗处理：用约6ml的75mM KCI在37℃下低渗骨髓细胞20min。
5.预固定：加入1-2ml新配制的固定液，用吸管混合均匀，1000r/min离心8分钟6.固定：吸去上清液，沿离心管壁缓缓加入6ml固定液，立即用吸管吹打成细胞悬液，在室温下静置固定15min。
PAS和Hematoxylin染色显示小鼠睾丸不同的生精阶段
第一期：圆形精子出现原初染色呈现红色顶体泡；SSCs和少量的pachytene,圆形精子和小的长形精子细胞（小的精子头）。
第二期：圆形精子出现2-3个染色呈现红色的顶体泡；pachytene与SSCs距离较近。
第三期：圆形精子膜上红色顶体泡合并，仍然在精子膜上，不与核膜相连；中期的pachytene 核，带有sex body;SSCs核呈现异染色质状。
第四期：红色顶体接触核膜，呈现线条状或扁平；SSCs处于有丝分裂状态，小型的B型SSCs 出现。
第五期：红色的顶体沿着圆形精子膜呈现月牙状或括弧状；B型SSCs核呈现异染色质状态。
第六期：顶体呈现帽状，覆盖圆形精子的三分之一的表面，成熟的精子几近管腔；成熟的精子靠近管腔。
第七期：顶体继续扩散，顶体并不全部朝向基膜（红色顶体不全部向基膜分布），成熟精子完全到达管腔边缘。
第八期：圆形精子顶体大多朝向基膜，管腔内无精子，新一轮精子形成开始。
第九期：spermatids精子核开始延长；圆形精子细胞，Leptotene, pachytene, round spermatocytes。
第十期：精子扁平，并继续延伸，大部分精子头染色较浅；无圆形精子细胞，Leptotene, Zygotene, pachytene。
第十一期：精子头变薄，精子头Hematoxylin深染色。
第十二期：减数分裂明显，出现中期分裂象的次级精母细胞, Diplotene spermatocytes（显示细胞核呈现长条状，分裂相）。
姓名：XX 系年级：20XX级齐鲁医学班学号：20130023XXXX科目: 细胞生物学实验实验题目:动物染色体标本的制备与观察染色体标本的制备及组型观察【实验目的】1.掌握染色体标本制作的基本方法；2.认识不同生物的染色体的状态，学会做染色体组型图。
【制作染色体标本的意义】了解染色体的特征（形态、大小、数目）——绘制染色体组型图【染色体组型图的应用】①生物学方面：根据染色体特征鉴别生物及种类：兔44条；小鼠40条；大鼠42条；鸡78条；猫38条；狗78条；人46条；马64条②临床医学方面：主要用于遗传性疾病的诊断和研究：21三体综合症：是21对常染色体多一条，此种人“先天愚型”，或称“伸舌样白痴”卵巢退化症：45 XO，外貌表现为女性，卵巢发育不全或无，1.5米以下，不能生育。
睾丸退化症：47 XXY ，外貌为男性，比一般男性高，睾丸发育不全，有女性样乳房，智力低下或超常，不能生育，发声尖高。
因此，染色组型实验广泛应用于胎儿遗传性疾病早期诊断中（抽羊水做组型）【染色体标本制作的原理】选择活跃的组织：胸腺，骨髓，睾丸，小肠施加药物使细胞分裂：PHA设法得到大量的分裂中期细胞：秋水仙素1.PHA：促进细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变成淋巴母细胞。
2.秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停在分裂中期。
3.空气干燥：使细胞与染色体展开。
4.低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体间的距离变大，易于染色体分散开。
5.固定：用Camoy’s solution,作用使蛋白变性，对染色体内的组蛋白讲，变形后硬度增加，保持了染色体的“即时形态”对细胞膜蛋白讲，变性使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。
姓名：XX 系年级：20XX级齐鲁医学班学号：20130023XXXX科目: 细胞生物学实验实验题目:动物染色体标本的制备与观察【实验用品】1.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离心管、离心机、小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯2.实验药品：蒸馏水、0.9% NaCl溶液、0.3% KCl溶液，固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、秋水仙素3.实验材料：小鼠【实验步骤】1.取雄性小鼠，以每克体重4微克注射秋水仙素（约1mL），14-16h后，用断头法处死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9% NaCl溶液）洗去血污，置于解剖盘中。
Isolation and staining of mouse meiotic metaphase chromosomes 小鼠睾丸生殖细胞标本制作及减数分裂期染色体观察xx 2011级生科四班201100140120 同组者：xx【实验目的】1、learn to isolate mouse testes cells and stain with Giemsa.学会分离小鼠睾丸细胞并用Giemsa染液染色2、Observe the number and morphology of mouse chromosomes观察小鼠染色体的数目及形态特征【实验材料】【Reagents】秋水仙素colchicine solution吉姆萨染液Giemsa stains solution生理盐水physiological saline氯化钾溶液KCl solution固定液fixation solution【Tools and equipments】Dissecting tray，beaker，centrifuge tube，microscope，glass slide，pipette，scissors，forceps，copper mesh.解剖盘，烧杯，离心管，显微镜，载玻片，吸管，剪刀，镊子，铜网【实验原理】meiosis is a process of reductional division in which the number of chromosomes per cell is cut in half. In animals, meiosis always results in theformation of gametes, while in other organisms it can give rise to spores. 减数分裂是细胞分裂染色体数减半的过程，在动物中,减数分裂的结果总是在形成配子,而在其他生物可以产生孢子。
Testosterone is the place where the male germ cell develop and mature,it is the organ that produce sperm. After sexual maturation, sex cells of mammals in the testis is always mature partially. Therefore,have an appropriate treatment to testis enables us to get a variety of chromosomes of different process.睾丸是雄性动物生殖细胞发育和成熟的部位，是产生精子的器官。
哺乳动物在性成熟以后，精巢内的性细胞总是在分批分期不断的成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可以获得减数分裂过程中各个时期染色体的标本。
Inject an amount of colchicine solution into the abdomen cavity can prevent the formation of the spindle fiber, so that a large amount of cells in the process of meiotic metaphase can be accumulated. By the normal way of making specimen,we can observe the chromosomes of mouse testosterone用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分裂中期的细胞。
利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠睾丸细胞的染色体。
Chromosomes are not visible in the cell’s nucleus—not even under a microscope—when the cell is not dividing. However, the DNA that makes up chromosomes becomes more tightly packed during cell division and is then visible under a microscope. Most of what researchers know about chromosomes was learned by observing chromosomes during cell division.一般情况下，细胞核中的染色体是看不见的，然而，在细胞分裂时，DNA使得染色体变粗变短，在显微镜下就可以观察到。
对于染色体的认知大部分都是通过观察分裂时期的染色体而获得的。
Each chromosome has a constriction point called the centromere, which divides the chromosome into two sections, or “arms.” The short arm of the chromosome is labeled the “p arm.” The long arm of the chromosome is labeled the “q arm.” The location of the centromere on each chromosome gives the chromosome its characteristic shape, and can be used to help describe the location of specific genes.每条染色体都有一个溢痕点称作着丝点，着丝点将染色体分为两部分，短臂称作p臂，长臂称作q臂。
着丝点在染色体上的位置使得染色体呈现各异的形态，可以用于描述特定基因的位置。
【实验方法】1、inject colchicine solution 14~16 hours before experiment.实验前14~16小时注射秋水仙素2、Sacrifice a mouse by cervical dislocation method脱臼法牺牲小鼠3、Open the lower abdomen cavity，find its two testes situated in its scrotum. The testes appear as two round，pink balls lying lowest in the body cavity，close to the edge of each side，as depicted in the red circles.打开腹腔下部，找到两个位于阴囊的睾丸。
睾丸是粉红色的小肉球，在腹腔最下方。
4、Put the testes into a small beaker containing 1ml 0.3% KCl solution. Cut up completely with scissors until solution turn into turbid ivory white.将睾丸放入一个盛有1ml 0.3% KCl溶液的小烧杯中，用剪刀将其完全剪碎直至成为象牙白色的悬液。
5、Filter through copper mesh. Transfer the filtrate into a centrifuge tube. Add KCl solution to a total volume of 4 ml.用铜网过滤。
将滤液转移到离心管中，加入KCl 溶液直到总体积为4ml。
6、Incubate at room temperature for 30min to perform hypotonic treatment.在室温下放置30min进行低渗处理。
7、Spin down at 1000r/min for 8 min，remove the supernatant. Resuspend cell pellet with 1 ml fixation solution.1000r/min 离心8min，弃上清，用1ml 固定液重新悬浮。
8、Incubate at room temperature for 5 min.室温下静置5min。
9、Drop the cell suspension onto a clean precooled slide from the height of10 to 15 cm，tap and blow the suspension to spread cells.从10~15cm的空中将细胞悬液滴到一块干净的冷的载玻片上，轻轻敲打、轻吹使细胞分开。
10、Build two slide supports on the glass plate and place the sample slides on top of them，with the sample side down.将两排载玻片排在玻璃板上，将标本面朝下架在上面。
11、Pipette the Giemsa buffer to the space between slides and the glass plate. The liquid should be spread down to the bottom due to capillary absorption.吸取Giemsa 染液加在玻璃板和载玻片之间，由于毛细作用，液体会扩散到玻片底部。
12、When the space is full of staining solution without bubbles,stain for 30 min.当空间中充满了染色液并没有气泡时，染色30min。
13、Get the sample slide off the bridge and erect them to drain the buffer. Wash the back of slide with slow running water. Dry them in the air and store in the container.将样品从桥上取下，直立以使染液流下。
用细小的水流冲洗载玻片的背面。
自然风干，在容器中保存。
14、Observe under the microscope.镜检观察。
