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C57BL／6小鼠繁殖性能的观察与研究C57BL/6小鼠是一种常用的实验动物模型，广泛应用于多个领域的研究。
研究C57BL/6小鼠的繁殖性能对于了解其繁殖特性、优化实验设计以及提高实验数据的可靠性都具有重要意义。
本文将从配种、妊娠和产仔等方面对C57BL/6小鼠的繁殖性能进行观察与研究。
首先，对C57BL/6小鼠的配种性能进行观察和研究。
正常情况下，C57BL/6小鼠雄鼠的性成熟期在6-8周龄，雌鼠的性成熟期在8-10周龄。
在实验过程中，可以通过观察雄鼠的精液排出情况以及雌鼠的阴道闭锁情况来判断其性成熟情况。
通常情况下，C57BL/6小鼠的配种率较高，可以达到90%以上。
但是，也需要注意一些可能影响配种的因素，如异常的生理状态、缺乏足够的性行为活跃性等。
此外，需要避免连续配种造成的疲劳导致的交配率下降。
其次，对C57BL/6小鼠妊娠过程进行观察和研究。
一般来说，C57BL/6小鼠的妊娠期为19-21天，平均妊娠期为20天。
妊娠的早期可以通过观察雌鼠的体重增加和腹围增大来判断。
在妊娠晚期，雌鼠体内的血液中孕激素的水平会升高，可以通过血液或尿液的检测来确定妊娠情况。
同时，需要控制适当的环境温度和湿度，提供足够的饮水和营养物质，以保证雌鼠的健康和胎儿的正常发育。
最后，对C57BL/6小鼠的产仔情况进行观察和研究。
正常情况下，C57BL/6小鼠的雌鼠一胎产仔数一般为6-8只，最多可达12只。
产仔时需要保持较为安静的环境，以免引起雌鼠的紧张和恐惧情绪。
产仔后，需要及时清理产仔箱，为母鼠提供适当的食物和饮水，以提供良好的哺乳条件。
同时，需要对幼仔的存活率进行观察和记录，对于异常或畸形的幼仔及时处理，以保证健康的后代。
综上所述，对C57BL/6小鼠繁殖性能进行观察和研究对于优化实验设计、提高实验数据的可靠性以及了解其繁殖特性具有重要意义。
通过对配种、妊娠和产仔等方面进行观察和研究，可以为进一步深入开展相关研究提供可靠的数据基础。
小鼠genotyping步骤小鼠基因分型是一种用于确定小鼠特定基因型的实验方法。
这种方法通过检测小鼠体内的特定基因的突变来确定基因型。
基因分型对于研究小鼠的遗传特性、基因功能以及治疗疾病的效果都非常重要。
在本文中，我们将详细介绍小鼠基因分型的步骤。
步骤一：DNA提取首先，需要从小鼠体内提取DNA。
可以使用不同的方法来提取DNA，比如裂解细胞膜并分离DNA。
常用的DNA提取试剂盒也可以用于此目的。
提取出的DNA可以通过测量吸光度来确定浓度和纯度。
步骤二：PCR反应接下来，使用聚合酶链反应（PCR）扩增特定基因的DNA片段。
PCR反应需要以下成分：模板DNA，引物对（包括特异性引物和控制引物），聚合酶和dNTPs。
反应条件（温度、时间）需要根据使用的引物和PCR仪的要求进行优化。
步骤三：凝胶电泳PCR反应后，将反应产物进行凝胶电泳以检测DNA片段的大小和纯度。
通常使用琼脂糖凝胶进行电泳分析。
在电泳前，需要将PCR产物与DNA标记物（如DNA分子量标记物）混合，并注入琼脂糖槽中。
然后，通过通电来分离DNA片段。
通过与标准DNA片段比较，可以确定PCR产物的大小。
步骤四：基因型分析通过对凝胶电泳结果进行显微镜观察并与标准DNA标记物比较，可以确定小鼠的基因型。
凝胶电泳可以显示不同基因型的特征带。
例如，如果小鼠是纯合子型（两个等位基因完全相同），则只会显示一个特定大小的带。
如果小鼠是杂合子型（两个等位基因不同），则会显示两个大小不同的带。
步骤五：验证和文献回顾在确定基因型后，应该验证结果的准确性。
可以选择一部分样本进行重复测试，以确认结果的一致性。
此外，还可以参考相关文献以确保基因型的准确性和合理性。
注意事项：1.PCR反应条件需要根据实验需要进行优化。
特异性引物和控制引物的设计非常重要，以确保PCR反应的特异性和敏感性。
2.在进行凝胶电泳之前，确保琼脂糖凝胶被充分固化，并根据需求进行样品槽的制作。
3.在进行凝胶电泳时，要小心不要损坏琼脂糖凝胶或让凝胶与电极接触。
第1篇一、实验背景基因是生物体内控制遗传信息传递的基本单位，基因突变是生物进化的重要驱动力。
为了研究特定基因的功能，我们采用小鼠作为模型生物，通过基因筛选实验，旨在鉴定和验证与特定表型相关的基因。
二、实验目的1. 构建小鼠基因文库。
2. 通过分子生物学技术筛选与特定表型相关的基因。
3. 验证筛选得到的基因的功能。
三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠。
2. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶等。
3. 试剂：PCR引物、DNA标记物、DNA探针、克隆载体等。
4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
四、实验方法1. 构建小鼠基因文库（1）提取小鼠基因组DNA。
（2）使用限制性内切酶切割基因组DNA，获得特定长度的DNA片段。
（3）将切割后的DNA片段连接到克隆载体上，构建小鼠基因文库。
2. 基因筛选（1）根据已知表型，设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）对小鼠基因文库进行PCR扩增，筛选出与特定表型相关的基因片段。
（3）将筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。
3. 基因功能验证（1）将筛选得到的基因片段克隆到表达载体中，构建重组表达载体。
（2）将重组表达载体转化大肠杆菌，获得表达目的蛋白的菌株。
（3）通过免疫印迹、免疫荧光等技术检测目的蛋白的表达和活性。
五、实验结果1. 成功构建了小鼠基因文库，文库容量达到预期目标。
2. 通过PCR扩增，成功筛选出与特定表型相关的基因片段。
3. 对筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。
4. 通过基因功能验证，成功表达了目的蛋白，并验证了其功能。
六、实验讨论1. 基因筛选实验中，PCR扩增和DNA测序是关键步骤，需要严格控制实验条件，确保结果的准确性。
2. 在基因功能验证过程中，需要选择合适的表达系统和检测方法，以确保目的蛋白的正确表达和活性。
3. 本研究筛选得到的基因可能与特定表型相关，但其具体功能还需进一步研究。
实验名称：基因检测小鼠模型建立及功能研究实验目的：1. 建立基因敲除小鼠模型，验证目标基因的功能；2. 探究目标基因在特定生理或病理过程中的作用；3. 为后续相关疾病的研究和治疗提供实验动物模型。
实验时间：2023年3月1日-2023年6月30日实验地点：XX大学动物实验中心实验材料：1. 实验小鼠：C57BL/6小鼠；2. 基因敲除质粒：含有目标基因的敲除质粒；3. 酶切试剂：DNA酶、T4连接酶等；4. 载体细胞：小鼠胚胎干细胞；5. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清等；6. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、显微镜等。
实验方法：1. 基因敲除质粒构建（1）根据目标基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增；（2）将扩增得到的DNA片段与载体连接，构建基因敲除质粒；（3）将构建好的质粒进行测序，确保序列正确。
2. 基因敲除小鼠模型建立（1）将基因敲除质粒转染小鼠胚胎干细胞；（2）将转染成功的细胞进行分裂培养，筛选出基因敲除细胞；（3）将基因敲除细胞进行核移植，获得基因敲除小鼠。
3. 功能验证（1）对基因敲除小鼠进行表型分析，观察其生长发育、生理功能等；（2）对基因敲除小鼠进行病理模型建立，观察其病理特征；（3）对基因敲除小鼠进行分子生物学检测，分析目标基因表达水平及蛋白功能。
实验结果：1. 基因敲除质粒构建成功，测序结果显示序列正确。
2. 基因敲除小鼠模型建立成功，经过表型分析，基因敲除小鼠在生长发育、生理功能等方面与野生型小鼠无显著差异。
3. 在病理模型建立过程中，基因敲除小鼠表现出与野生型小鼠相似的病理特征。
4. 分子生物学检测结果显示，基因敲除小鼠目标基因表达水平降低，蛋白功能受到影响。
实验结论：1. 成功构建了基因敲除小鼠模型，为后续相关疾病的研究和治疗提供了实验动物模型；2. 验证了目标基因在特定生理或病理过程中的作用，为进一步研究该基因的功能奠定了基础；3. 本实验结果为相关疾病的发病机制研究提供了参考，有助于寻找新的治疗靶点。
自噬基因Beclin1的研究现状自噬基因Beclin1的研究现状Beclin1基因也称BECN1基因，是酵母ATG6的同系物,也是哺乳动物参与自噬的特异性基因。
大量研究表明beclin1不仅参与自噬体的形成, 还可通过调节自噬活性对肿瘤发生、发展起着重要作用。
1 自噬及自噬基因Beclin1基因的概述自噬现象是一种高度保守的细胞行为,几乎存在于所有的物种,与细胞的生长、增殖，以至肿瘤的发生过程关系密切。
主要参与细胞内大分子物质的循环及再利用、受损细胞器的清除，在维护细胞内环境稳态方面起重要作用，并且是完整细胞器和大分子蛋白降解的主要途径[2]。
自噬体的形成与ATG(Au T opha Gy-related gene)系列基因有关。
自噬是一种选择性的非caspase依赖的程序性细胞死亡[3]。
细胞自噬是体内多余的蛋白质和亚细胞成分在溶酶体降解的复杂的催化过程．是正常细胞的功能[2]。
自噬性细胞死亡有别于凋亡(I型程序性死亡)，因而被称为Ⅱ型程序性死亡。
自噬调控机制的失调与多种疾病的发生发展有关，如神经变性性疾病、自身免疫病、恶性肿瘤、衰老、病原微生物感染、肌细胞功能失调等[4]。
近年来自噬与肿瘤的关系引起了广泛的关注，对于自噬在肿瘤中的表达情况和在肿瘤发生中的作用，以及在不同器官肿瘤，或者同一器官不同类别肿瘤，甚至同一肿瘤的不同发展阶段的表达情况，各研究结果报道不一致。
在肿瘤发展的早期，自噬抑制肿瘤的形成，此时阻碍自噬导致癌前病变的发展，自噬相关基因在多种恶性肿瘤中存在着单染色体缺失，相对表达量相应减少。
自噬在肿瘤的发生过程中的主要作用体现在：自噬通过调节细胞内过氧化物浓度，改变体内蛋白代谢紊乱状态、保持内环境稳定、抑制肿瘤的形成；自噬功能降低则会增加氧化应激，增加致瘤性突变的积累[5]。
自噬现象贯穿于真核细胞正常生长增殖和病理生理过程，对细胞的作用具有双重性，在疾病进展的不同阶段，或者细胞周围环境发生变化和治疗干预措施的不同时，对细胞会产生不同的影响[6-8]。
雄鼠的生殖器官包括睾丸、附睾、输精管、储精囊、凝固腺、前列腺、尿道球腺、包皮腺及阴茎。
睾丸：睾丸又称精巢，是产生精子的地方。
睾丸共有两个，幼年时睾丸藏存腹腔内，性成熟以后则下降到阴囊内，其表面为纤维性结缔组织，内部有无数的曲细精管，雄性间质组织产生精子，存在与睾丸的曲细精管内。
附睾：附睾又称精巢上体，由许多弯曲旋廻的细管组成，是接受并暂时贮存精子的地方。
附睾分头、体、尾三部分。
附睾头部与睾丸上部的精细管连接，体部在睾丸的一侧下行，尾部与输精管相连。
精子在通过附睾期间成熟。
成熟的有受精能力的精子通过与附睾相接的输精管，交配时射入雌鼠阴道。
输精管：输精管是精子通过的管道，它是由附睾尾部引出的毛细管在储精囊下面、膀胱的背侧汇合进入尿道。
成年小鼠的输精管存在无数的有受精能力的精子。
储精囊(精液腺)：储精囊呈半月状，形成多数锯齿分叶，内部储存营养精子的白色浓稠分泌物。
凝固腺：为精液腺内侧附着的半月弧形的半透明的器官，起着凝固精液腺所分泌的分泌液的作用，交配后，形成阴栓。
前列腺：前列腺分背叶和腹叶，背叶位于尿道的背侧，腹叶位于膀胱基部附近处尿道腹侧，它与尿道球腺及精液腺等分泌的液体稀释精液，而使精子更为活跃。
尿道球腺：为球状分泌腺，位于骨盆腔内尿道球的背上方。
包皮腺：小鼠的包皮腺较大，是存于阴茎近腹壁上皮间的瓜籽形的脂质分泌腺，开口于包皮内侧。
阴茎：公鼠交配器官，由阴茎体、龟头组成，不交配时保持于包皮内Hypothalamus 下丘脑 Optic chiasma 视交叉 pituitary stalk 垂体Optic chiasm 视神经交叉Adenohypophysis 腺（性）垂体（前叶） intermediate lobe （脑下）垂体中叶 neurohypophysis 垂体神经部。
英文回答：The genetic identification of mice is an important experiment that requires rigorous operating procedures. End tissue samples from mice need to be prepared or a small number of tail tissues or blood samples collected for subsequent PCR enhancements. During the PCR build—up, suitable quotations must be designed to selectively zoom in the specific fragments of the feox and cre genes. The length and purity of DNA fragments are tested through gel electron swimming to confirm the success of the PCR build—up. Once the expansion has been successful, the next steps in genetic identification can be undertaken. This work needs to be carried out in strictpliance with the required technical standards and processes to ensure the accuracy and reliability of the results of the experiments.小鼠基因型鉴定是一项重要的实验工作，需要进行严格的操作流程。
《小鼠GV期卵母细胞发育潜能评价和GDNF对牛卵母细胞体外成熟、受精和胚胎发育的影响》篇一小鼠GV期卵母细胞发育潜能评价及GDNF对牛卵母细胞体外成熟、受精和胚胎发育的影响一、引言随着现代生物医学的不断发展，关于卵母细胞的研究成为了生殖生物学与辅助生殖技术的重要领域。
在实验室研究与临床实践中，对于不同物种卵母细胞的发育潜能评价，及其体外成熟、受精和胚胎发育的调控机制研究显得尤为重要。
本文将重点探讨小鼠GV期卵母细胞的发育潜能评价以及GDNF（胶质神经生长因子）对牛卵母细胞体外成熟、受精和胚胎发育的影响。
二、小鼠GV期卵母细胞发育潜能评价1. GV期卵母细胞的获取与处理小鼠GV期卵母细胞通常通过卵巢中卵泡的采集获得。
在实验室条件下，对卵母细胞进行形态学观察，以确定其处于GV期（生发泡期）。
此时，卵母细胞的结构和形态特征对于后续的发育潜能评价具有重要意义。
2. 发育潜能评价指标对于GV期卵母细胞的发育潜能评价，主要包括形态学观察、生发泡破裂（GVBD）情况和后续胚胎发育率等指标。
形态学观察可评估卵母细胞的完整性和透明度；GVBD是卵母细胞进入减数分裂的关键步骤，其发生情况可反映卵母细胞的成熟程度；而后续胚胎发育率则直接反映了卵母细胞的受精和胚胎形成能力。
三、GDNF对牛卵母细胞体外成熟、受精和胚胎发育的影响1. GDNF的作用机制GDNF是一种具有重要生物学功能的生长因子，能够促进多种细胞的增殖和分化。
在牛卵母细胞的体外成熟过程中，GDNF 能够通过调控相关基因的表达，促进卵母细胞的成熟和胚胎发育。
2. 体外成熟实验在体外成熟实验中，加入不同浓度的GDNF，观察其对牛卵母细胞成熟的影响。
通过形态学观察和生理指标的测定，评估GDNF对卵母细胞成熟过程中相关酶活性和激素水平的影响。
3. 受精和胚胎发育实验在受精和胚胎发育实验中，将经过GDNF处理的牛卵母细胞与精子共同培养，观察其受精率和胚胎发育情况。
通过比较不同浓度GDNF处理组与对照组的受精率和胚胎发育率，评估GDNF 对牛卵母细胞受精和胚胎发育的促进作用。
小鼠的基本实验操作小鼠是最常用的实验动物之一，其体型较小、繁殖能力强、生命周期短、易于饲养和管理，因此被广泛用于生物医学研究中。
以下是小鼠实验的基本操作。
一、小鼠的选育与管理1.小鼠的品系选择：选择适合研究目的的小鼠品系，例如常用的C57BL/6、BALB/c等。
2.饲养环境控制：为小鼠提供适宜的饲养环境，包括控制温度、湿度、光照和气流等。
3.饲料和水的供给：提供适宜的饲料和清洁的饮用水，确保小鼠的正常营养摄入。
二、小鼠的配对与繁殖1.配对：选取性成熟健康的雄性和雌性小鼠，进行自然配对或人工配对。
2.孕期管理：雌性小鼠受孕后，需要监测妊娠情况，并做好相应的饮食和环境管理。
3.胚胎获取：根据需要，可以选择在特定生理时期采集小鼠胚胎，用于后续的胚胎移植或体外培育等实验。
三、小鼠手术操作1.解剖手术：通过解剖手术，可以获取特定组织或器官的标本，从而进行病理学和生理学研究。
2.移植手术：如肾移植、心脏移植等，用于研究器官功能和移植排斥反应等问题。
3.慢性操作：如植入插管或取样等，用于定期获取生理参数的连续监测。
四、小鼠的药物处理1.静脉注射：通过静脉注射给小鼠药物，用于研究药物的药理学和药效学等。
2.腹腔注射：通过腹腔注射给小鼠药物，多用于给予抗肿瘤药物、化疗和免疫细胞的移植等。
3.给药途径选择：根据研究目的和药物性质，选择合适的给药途径，如口服、皮下注射等。
五、小鼠的行为测试1. 空间记忆测试：如Morris水迷宫，用于评估小鼠的空间记忆能力。
2.暗箱测试：用于评估小鼠的焦虑状态和厌恶反应。
3.Y型迷宫测试：用于评估小鼠的学习和记忆能力。
六、小鼠的标本采集和检测1.组织标本采集：根据研究需要，取出小鼠的特定组织，如血液、脑组织等。
2. 分子生物学检测：如PCR、Western blot等，用于检测基因表达和蛋白质水平的变化。
3.组织病理学检测：用于观察和评估小鼠组织病变情况，如光镜下观察和组织染色等。
双色荧光小鼠介绍
GFP小鼠作为一种工具小鼠，已经成为再生、发育、免疫(肿瘤免疫、移植免疫和免疫系统相互作用机制等)、细胞生物学等研究必不可少的实验材料，广泛地应用于生物学的各个领域。
C57BL/6小鼠为生物医学研究中最常用的小鼠品系之一。
GFP融合蛋白前为beta-Actin启动子，表达方式为全身表达，除红细胞和毛发外，其余细胞可以直接在激发光下看到荧光。
小鼠表皮发绿，自然光下也可看到。
双色荧光小鼠(Cre报告小鼠,mTmG转基因小鼠,cas9小鼠)
ROSAmT/mG 是靶向细胞膜的双色荧光Cre 报告小鼠。
在进行Cre 重组前，定位于细胞膜的tdTomato (mT) 荧光表达遍布细胞/组织。
表达Cre 重组酶的细胞（以及来自这些细胞的细胞谱系）具有定位于细胞膜的 EGFP (mG) 荧光表达，代替红色荧光。
该小鼠被广泛应用于cre工具鼠的特异性验证。
GFP的简介和应用【摘要】源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（GFP），是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。
本文就GFP的理化性质、荧光特性、改进以及它在科学研究中发挥的作用进行了综述。
【关键词】绿色荧光蛋白（GFP）、标记物、荧光特性、进展、改进、应用、干细胞移植【正文】一、GFP的简介1. GFP的理化性质，荧光特性及其改进1.1 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
Aequoria GFP分子量约27×103，一级结构为一个由238 个氨基酸残基组成的单链多肽；而Renilla GFP是分子量为54kD的同型二聚体。
两种GFP有不同的激发光谱，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；Renilla GFP在498 nm具有强烈的光吸收，肩峰为470 nm。
两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（λmax= 508~ 509 nm）。
GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
更重要的是，它们在很大的pH范围内的吸收、发射光谱也是相同的。
Renilla GFP的稳定性就更为显著。
它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。
根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT 蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。
1.2 GFP的荧光原理GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。
GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。
雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠的繁殖及其表型鉴定王志茹1,2，李军2，刘晓梅1，吴红联2，朱德生2（1.吉林大学公共卫生学院，长春130021；2. 北京大学实验动物中心，北京100871）【摘要】目的繁殖雄性生殖细胞特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）小鼠，为进行小鼠生殖系统毒性研究提供有效的工具。
方法将Ddx4-cre转基因雄鼠与Rosa26mT/mG转基因雌鼠交配，产生子代动物，利用分子生物学、组织病理学及活体成像等技术，分别从分子、细胞和组织水平对子代及其亲代小鼠进行表型鉴定。
结果PCR结果表明在子代小鼠的睾丸组织中发生了Cre酶介导的特异性基因重组；活体成像可以看到在F1代小鼠的睾丸组织中具有GFP的表达；睾丸冰冻切片及精子荧光观察显示GFP主要表达于次级精母细胞、精子细胞和精子中。
结论雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠繁殖成功。
【关键词】睾丸；特异性；基因重组；GFPProduction and phenotype identification of specific expressed green fluorescent protein in male mice germ cellsWANG Zhi-ru1,2，LI Jun2，LIU Xiao-mei1，WU Hong-lian2，ZHU De-sheng2(1.School of public health，Jilin University，Changchun 130021，China；2. PekingUniversity Laboratory animal centre，Beijing 100871，China)【Abstract】Objective The aim of this study is production of organ specific animal model for studying reproductive toxicity in mice. Methods F1 generation was gotten by mating the Ddx4-cre transgenic male mice with the Rosa26mT/mG transgenic female mice. F1 offspring and its parents phenotype was screened by molecular biological, histopathological and in vivo imaging technology. Results At molecular level, specific DNA fragment was only found in testis of F1 offspring ; At the organ level, the expression of green fluorescent protein could only be observed in testis of F1 offspring; Testicular frozen sections and sperm fluorescence observation showed that green fluorescent protein were mainly expressed in the germ cell lineage such as secondary spermatocyte and spermatocyte and spermatozoon. Conclusions The production of the mice with specific germ cell expressed green fluorescent protein by Cre/loxP recombination system were built successfully.【Key words】Testis;Specificity; Gene recombination;Green fluorescent protein 生殖系统的改变是造成不孕不育的重要原因，如何简易快速的检[作者简介]王志茹（1988-）女，在读硕士研究生，研究方向：纳米毒理学，Email：843872569@ [通讯作者]朱德生( 1960-) 男，高级工程师，研究方向：转基因动物，Email：deshengz@测生殖系统的损伤是目前研究的一个热点。
在绝大多数物种中，Ddx4基因特异性表达于生殖细胞中[1]，常被用作分子标记研究配子发生和原始生殖细胞的起源、迁移、分化等方面。
雄性生殖细胞的DDX4 蛋白表达，从12.5dpc生殖嵴一直持续到减数分裂后的精子细胞[2]。
本研究利用生殖系统特异性启动子Ddx4启动的Cre酶，通过Cre/loxP 位点特异性重组系统[3]产生雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠模型，为后续进行雄性小鼠生殖系统发育和毒性研究提供理想的动物模型。
1材料与方法1.1实验动物SPF级B6.FVB-Tg(Ddx4-cre)1Dcas/JnjuDdx4-cre小鼠（以下简称为Ddx4-cre小鼠）4只，雌雄各半，雄性为杂合子（T/W），雌性为纯合子（T/T）；SPF级B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor tm4(ACTB-tdTomato,-GFP)Luo 小鼠（以下简称Rosa26mT/mG小鼠）4只，雌雄各半，均为纯合子（mut/mut）。
小鼠周龄4-8周，均购自南京大学南京生物医药研究院【SCXK（苏）2010-0001】。
饲养于北京大学实验动物中心【使用许可证：SYXK（京）2011-0003】，饲养条件符合SPF级实验动物的饲养标准。
Ddx4-cre小鼠在Ddx4启动子调控下在生殖系统中特异性表达Cre酶的转基因小鼠[4]。
Rosa26mT/mG小鼠是全身组织器官表达红色荧光蛋白的转基因小鼠，当其与Cre转基因小鼠交配产生的后代将发生Cre酶介导的特异性基因重组，将敲除mT基因，从而激活mG基因的表达，产生绿色荧光蛋白（图1）[5]。
1.2动物交配Ddx4-cre小鼠4只，雌雄各半，雄性为杂合子，雌性为纯合子，1：1交配，扩大种群。
Rosa26小鼠4只，雌雄各半，均为纯合子，1：1交配，扩大种群。
Ddx4-cre小鼠6只，雄性，杂合子（T/W）；与Rosa26小鼠6只，雌性，纯合子（mut/mut）；1：1交配，获得F1代雄性小鼠，其基因型可分为两种Ddx4-cre（T/W）；Rosa26mT/mG（mut /wt）与Ddx4-cre （W/W）；Rosa26mT/mG（mut/wt）。
而在表达Cre酶的组织，会产生Cre酶诱导的基因重组，切除mT基因。
通过交配产生子代可能的基因型和表型见图2。
图2 Ddx4-cre♂小鼠与Rosa26mT/mG♀小鼠交配可能产生的子代的基因型和表型FIG.2 Genotype and phenotype of offspring by mating the Ddx4-cre male mice with theRosa26mT/mG female mice1.3双阳性F1代雄性小鼠的筛查利用PCR的方法，对母代和子代雄性小鼠进行基因型鉴定。
提取鼠尾DNA，PCR扩增检测Ddx4-cre基因和Rosa26mT/mG基因，确定小鼠基因型，筛选基因型为Ddx4-cre（T/W）；Rosa26mT/mG（mut/wt）的子代小鼠，为双阳性F1代雄性小鼠。
Ddx4-cre基因扩增条件为94℃30sec，62℃35sec，72℃45sec，35个循环；Rosa26mT/mG基因扩增条件为94℃30sec，61℃1min，72℃1min，35个循环。
所使用的引物及其意义见表1。
表1 PCR引物、扩增片段及目的Table 1 PCR primer ,fragment size and purpose基因Genes F（5’-3’）R（5’-3’）扩增片段fragment size 目的purposeDdx4-cre CACGTGCAGCCGTTTAAGCCGCGT TTCCCA TTCTAAACAACACCCTGAA 240bp（T/W）确定F1雄性小鼠是否携带了其父代的Ddx4-cre基因Rosa26 mT/mG TTCCCA TTCTAAACAACACCCTGAA ①CGAGGCGGATCACAAGCAA TA 250bp（mut/mut）；确定F1雄性小鼠是否携带了其母②TCAA TGGGCGGGGGTCGTT 300bp（wt/wt）代的Rosa26mT/mG基因mT AGCTGGACATCACCTCCCACAACG CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 1262bp 验证实验鼠的睾丸组织是否发生了cre酶介导的基因重组1.4动物分组为了研究通过交配产生的动物的基因型和表型，我们选取三组动物。
Ddx4-cre小鼠4只，雄性，周龄4-5周，为阴性对照鼠；Rosa26mT/mG小鼠4只，雄性，周龄4-5周，为红色荧光蛋白对照鼠；双阳性F1代小鼠4只，雄性，周龄4-5周为实验鼠。
1.5DNA提取利用浓盐法提取组织DNA[6]，加入500μl（含5μl蛋白酶K）的组织裂解液放到52℃恒温水浴箱中消化过液，加入5MNaCl 250μl，混匀，冰浴10min。
12000rpm，离心10min，吸上清400μl加入1ml预冷的无水乙醇，12000rpm 离心10min后去上清，干燥沉淀后加入60μl去离子水55℃溶解DNA。
1.6PCR扩增体系PCR反应体系为20μl，包括：10×Buffer 2μl，2.5mMdNTP 1.6μl，10μm引物各0.4μl，5U rTaq酶0.4μl，模板DNA 1μl，去离子水14.2μl。
PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
1.7组织mT基因扩增利用三组动物的睾丸组织（去除被膜组织）及实验鼠的脑、心、肝、脾、肺、肾、肠，提取DNA，PCR扩增检测mT基因。
引物与目的片段（表1）。
扩增条件为94℃30sec，61℃30sec，72℃1min，35个循环。
1.8组织荧光观察颈椎脱臼法处死小鼠，取出脑、心、肝、脾、肺、肾、肠、睾丸，利用小动物成像仪进行离体组织的荧光观察，红色荧光（激发光536/40nm；发射光590/20nm）；绿色荧光（激发光425/26nm；发射光520/35nm），曝光时间均为1s。
1.9组织冰冻切片的荧光观察将固定于4%甲醛溶液中的组织，转入6-10ml 30%蔗糖溶液中沉糖过夜，用OCT胶包埋，储存于-20℃冰箱中，备用。
