PUF蛋白在小鼠雄性生殖细胞及人肿瘤细胞增殖中的功能研究

PUF蛋白在小鼠雄性生殖细胞及人肿瘤细胞增殖中的功能研究最近研究发现,RNA结合蛋白可能在动物发育过程和细胞增殖分化过程中发挥了重要的作用,但是多数RNA结合蛋白的作用尚有待发现。

PUF(Pumilio-Fem3-binding factor)蛋白家族是真核生物RNA结合蛋白家族中高度保守的一类,它们在低等动物中主要对基因表达起负性调控的作用。PUF蛋白可以通过Pumilio的同源结构域去结合目标mRNA的3’UTR(3’Untranslated Region)上高度特异性序列,最终导致mRNA降解和翻译水平的降低。

PUF家族蛋白广泛分布于真核生物,从酵母、线虫、果蝇到小鼠和人均存在同源基因。在果蝇和线虫中它们被发现在生殖细胞发育过程起重要作用,比如原始生殖细胞的增殖和迁移,生殖干细胞的自我更新等等。人和其他哺乳动物主要存在两种PUM蛋白,即PUMILIO1(PUMI)和PUMILI02(PUM2),它们在人和其他哺乳动物中的功能还不清楚。

尤其是它们是否像在果蝇、线虫中一样参与生殖细胞的发育和干细胞的维持还尚无报道。有研究表明,Puml或者Pum2基因敲除小鼠仍然存在生育能力;但是我们课题组前期发现两个基因同时缺失会导致胚胎致死,这对研究它们在哺乳动物精子发生过程中的作用造成了极大的困难。我们实验室前期通过生殖细胞特异性Cre(Vasa-cre和Stra8-cre)工具鼠构建了 Pum基因条件性敲除小鼠,可以使其分别在特定时间点将睾丸生殖细胞中的Pum蛋白敲除。

通过对这两种条件性敲除小鼠的表型进行分析发现,它们的睾丸显著小于对照组睾丸,并且不育。与此同时,在出生后6天时,这种睾丸的重量差异就已经变得非常显著了,这说明PUM很有可能在早期生殖细胞的发育过程中起着重要的作用。为了解释Pum基因条件性双敲小鼠的不育原因,我们首先对其进行了组织学

的分析。

我们发现条件性敲除小鼠睾丸管腔中的生殖细胞出现了大量丢失,同时变形的长形精子数目显著减少,并且这种生殖细胞的减少在出生后12天的

VDKO(Vasa-cre/+;PumlFL-;Pum2-l-)小鼠睪丸内就能观察到,生殖细胞标记物VASA抗体染色也进一步验证了我们的结果。通过在不同阶段生殖细胞表达的标记物染色发现,条件性双敲小鼠丢失的细胞主要为精母细胞和圆形精细胞。成年双敲小鼠的睾丸生殖细胞的大量丢失一方面可能与其增殖显著减慢有关,此时其精原干细胞的数目也是显著减少的;另一方面也可能与其成年时凋亡细胞显著增加有关,并且增加的许多凋亡细胞都为精母细胞。

因此,我们的工作表明PUF家族蛋白在哺乳动物的生殖细胞维持和增殖中起重要作用,支持Pum在生殖细胞中的作用是高度保守,也是其最古老的功能之一。鉴于Pum蛋白在哺乳动物生殖细胞增殖中的高度保守作用,以及Pum基因在多个组织中都有表达,我们提出了 PUM蛋白可能参与人肿瘤细胞的增殖调控的假说。我们选取了男性生殖系统肿瘤中最常见的前列腺癌来作为研究对象。

我们发现前列腺癌病人组织切片中中PUM1的表达显著高于癌旁组织,同时在前列腺癌细胞系DU145及PC3中,敲减PUM1蛋白会导致前列腺癌细胞增长显著减慢而凋亡增加,形成克隆的能力下降且形成的肿瘤也显著减小。我们进一步发现抑癌基因P27蛋白在PUM1敲减后升高,且其3’UTR上带有PUM结合位点,提示PUM1可能通过调控P27的翻译影响增殖。因此,我们在前列腺癌细胞中的工作支持我们提出的PUM调控肿瘤细胞增殖的假说。

综上所述,PUM1蛋白对于雄性生殖细胞的维持以及前列腺癌细胞的生长起

着重要的作用,这为研究雄性不育及寻找肿瘤发病机制提供了新的线索。