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干细胞定向分化的实验技巧干细胞是具有自我更新和分化为多种细胞类型潜能的细胞群体。
干细胞定向分化是指将未分化的干细胞诱导分化为特定细胞类型的过程。
这项技术在医学研究和临床应用中具有巨大的潜力，可以用于组织工程、再生医学和疾病治疗等领域。
在干细胞定向分化的实验中，一些关键的技巧和方法是必不可少的。
本文将介绍一些常用的干细胞定向分化实验技巧。
1. 干细胞培养和扩增在进行干细胞定向分化实验之前，首先需要培养和扩增干细胞。
常用的干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞（iPS细胞）。
在培养过程中，需要提供适当的培养基和生长因子来维持干细胞的自我更新和增殖能力。
在扩增时要注意细胞的密度控制，以避免细胞在过度拥挤的环境中产生自发分化。
2. 诱导分化因子的选择和优化干细胞定向分化的关键是选择合适的诱导分化因子。
对于每种分化类型，诱导因子的选择和浓度需要进行优化。
通常，这些诱导因子可以是细胞因子、转录因子或化学物质。
例如，要将干细胞定向分化为神经细胞，可以添加神经生长因子等相关因子。
在优化过程中，可以通过调整因子的浓度、处理时间和培养条件来实现更有效的定向分化。
3. 细胞外基质的使用细胞外基质（ECM）是一种提供细胞黏附和信号传导的支持物质。
在干细胞定向分化实验中，使用细胞外基质可以模拟体内的微环境，促进特定细胞类型的定向分化。
常用的细胞外基质包括胶原蛋白、纤维蛋白和海藻酸。
选择合适的细胞外基质可以提高定向分化的效率和特异性。
4. 流式细胞术分析流式细胞术是一种常用的细胞分析方法，可以用来检测和分离不同细胞类型。
在干细胞定向分化实验中，可以利用流式细胞术来检测和定量特定细胞表面标记物的表达。
通过标记特定蛋白或分子，可以确定定向分化的效率和细胞类型的纯度。
流式细胞术还可以用于分离和纯化特定细胞群体，以进一步进行后续实验。
5. 功能性分析在干细胞定向分化实验中，除了表面标记物的表达外，还需要进行功能性分析来验证定向分化的效果。
胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展
刘革修;张洹
【期刊名称】《第二军医大学学报》
【年(卷),期】2003(24)5
【摘要】最近研究表明胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)在体内外均可以发育分化出神经组织细胞,这对于了解神经发育的机制和研究神经组织退化性或者脑组织损伤性疾病的治疗具有重要的意义。
本文就胚胎干细胞定向分化为神经组织细胞及其基因表达特点作一综述。
【总页数】4页(P514-517)
【关键词】胚胎干细胞;定向分化;神经细胞;研究进展
【作者】刘革修;张洹
【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R329.2;Q813
【相关文献】
1.全反式维甲酸诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的研究进展 [J], 陈盛;何念海
2.胚胎干细胞定向诱导分化为神经细胞的方法研究进展 [J], 陈海萍;黄晓琳;陈红
3.胚胎干细胞体外定向诱导分化为神经细胞的方法 [J], 尹华伟;郑国栋;闫家阁
4.淫羊藿素诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为神经细胞 [J], 朱丹雁;张翔南;杜悦;
陈燕;王志强;楼宜嘉
5.小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展 [J], 陆建峰;宋后燕
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胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展（姓名：李翔单位：宁夏师范学院化学与化学工程学院11级科学教育班）摘要：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞,具有多向分化潜能和自我更新的特性。
胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞,可为细胞移植提供无免疫原性的材料,为难以治愈的疾病的细胞移植治疗提供可能。
本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用。
关键词：胚胎干细胞;定向诱导分化;分化潜能;自我更新胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从早期胚胎(桑椹胚、囊胚)或原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。
ES细胞具有多向分化潜能,可分化形成外胚层、中胚层和内胚层细胞的谱系干细胞,再成长为不同的神经、造血、肌肉,骨骼等各种细胞基于其特性,目前普遍认为,ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育,基因表达调控,药物的筛选和致畸实验及作为组织细胞移植治疗,克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。
1998年,T homson和Gearhart2个研究组分别从人ICM和PGCS建立了人类ES细胞系,在国际上引起了轰动。
Science杂志将人类ES细胞研究成果评为1999年世界十大科技进展之首,美国《时代》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首,并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域,由此掀起了ES细胞研究的高潮。
1体外诱导ES细胞的原理在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。
在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。
从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异。
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。
方法将小鼠胚胎干细胞以“无血清”方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。
结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。
结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。
[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence,reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons,immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed,RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat,Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition,providing a new source of nerve graft.[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究方兴未艾,且取得了一定成果,但由于其多取材于胚脑的神经干细胞,为日后临床应用埋下了伦理道德问题之患,并且受到供体来源短缺的限制[1]。
干细胞的分化与定向诱导技巧干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的一类基础细胞。
在医学领域，干细胞具有广阔的应用前景，可以用于组织重建、疾病治疗以及新药研发等方面。
干细胞的分化与定向诱导是实现这些应用的关键步骤，本文将介绍干细胞分化的基本原理和常用的定向诱导技巧。
干细胞分化的基本原理是指通过调控细胞内外环境来引导干细胞向特定细胞类型分化的过程。
在自发分化过程中，干细胞通过自身的遗传调控和信号传导路径来实现分化。
而定向诱导技巧则是通过外部介入，利用特定的因子和技术手段来控制干细胞的分化方向，使其转变为目标细胞类型。
在干细胞分化的过程中，存在内源性和外源性两种分化信号。
内源性信号是指体内存在的调控因子，如基因表达调控和细胞信号通路等。
外源性信号则是指通过外部途径引入的调控因子，如特定细胞因子和生化材料等。
这些信号可以单独或联合作用，通过激活或抑制细胞内特定信号通路，从而实现干细胞向特定细胞类型的转变。
定向诱导技巧主要包括生化诱导和物理诱导两种方法。
生化诱导是利用生物化学因子来诱导干细胞的分化。
常见的生化诱导因子包括生长因子、转录因子和化学物质。
生长因子可以通过激活特定信号通路促进细胞增殖和分化，转录因子则可以通过与DNA结合来控制基因表达，进而诱导细胞分化。
化学物质则可以改变细胞内的环境，如酶抑制剂和分化诱导剂等。
生化诱导的优势在于可以精确地调控分化的时间和程度，但其不足之处在于需要优化诱导因子的浓度和时间，以及需要解决因子稳定性和细胞毒性等问题。
物理诱导是利用物理力学原理来诱导干细胞的分化。
常见的物理诱导方法包括微环境模拟和力学刺激。
微环境模拟是通过模拟细胞自然生长环境，如细胞外基质、细胞间隙和培养基等，来提供合适的生长条件和机械性刺激，从而引导干细胞的分化。
力学刺激是通过应用机械压力、牵拉力或剪切力等来调节细胞内外环境，从而影响干细胞的分化。
物理诱导的优势在于可以模拟细胞自然生长环境，更好地保持细胞功能和生化特性，但其不足之处在于需要优化刺激力的强度和时间，以及需要解决刺激对细胞的毒性和特异性等问题。
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）的研究一直是生物学和医学领域的重要课题。
这些细胞具有自我更新和多潜能的特性，为再生医学、疾病模型、药物筛选等多个领域提供了巨大的研究潜力。
近年来，随着对小鼠胚胎干细胞研究的深入，新型小鼠胚胎干细胞系的建立显得尤为重要。
本文旨在详细介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程、方法和应用前景。
二、材料与方法1. 材料准备（1）实验动物：选择合适的小鼠品系作为供体，确保其遗传背景清晰。
（2）实验试剂：包括培养基、生长因子、抗生素等。
（3）实验设备：显微镜、培养箱、离心机等。
2. 方法（1）胚胎获取：从小鼠中获得早期胚胎。
（2）胚胎培养：将胚胎置于特定培养基中，加入生长因子，进行体外培养。
（3）干细胞诱导：通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
（4）干细胞系建立：经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
三、实验过程与结果1. 胚胎获取与培养通过超数排卵和人工授精等方法，从小鼠中获得早期胚胎。
将胚胎置于含有适当营养成分和生长因子的培养基中，置于适宜温度和湿度的培养箱中培养。
2. 干细胞诱导与分化通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
这一过程需要严格控制培养条件和时间，以确保干细胞的成功诱导和分化。
3. 干细胞系的建立与鉴定经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
通过细胞形态观察、生长曲线绘制、基因表达分析等方法，对干细胞系进行鉴定和评估。
四、讨论与分析1. 小鼠新型胚胎干细胞系的特点与优势新型小鼠胚胎干细胞系具有较高的分化潜能、稳定的遗传背景和良好的扩增能力等特点。
与以往的小鼠胚胎干细胞系相比，新型干细胞系在研究过程中具有更高的可靠性和实用性。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的应用前景（1）再生医学：小鼠新型胚胎干细胞系可用于研究细胞分化和组织再生，为再生医学提供新的治疗策略。
（2）疾病模型：通过基因编辑技术，可以构建特定疾病的小鼠模型，为疾病研究和药物筛选提供有力工具。
克隆：将体细胞核移植到去核卵细胞中，通过细胞培养，胚胎移植等技术培养新个体细胞工程：是用人工方法对细胞成分进行加减和更替而获得所需的功能细胞顶体反应：是精卵接触时，精子受卵周的胶膜或透明带诱导发生顶体胞吐，释放蛋白水解酶的过程。
胚泡（囊胚）：第四天桑葚胚继续增加，卵裂球达100个左右，细胞间出现腔隙，腔内充满液体，胚呈囊泡状。
胚胎诱导：在胚胎发育中，一部分细胞对其邻近的另一部分细胞产生影响，并决定其分化方向的作用。
定向分化：诱导胚胎干细胞定向分化为某种特殊类型的细胞内细胞群：是在胚泡腔一端的大约由30个细胞组成的细胞群次级神经：指外胚层细胞下陷进入胚层形成实心细胞索，接着再产生空洞形成神经管。
图式形成：胚胎细胞形成不同组织、器官、构成有序空间结构的过程透明带：在初级卵泡早期，卵母细胞和卵泡细胞之间出现一层含糖蛋白的嗜酸性膜。
1、多细胞个体发育的两大功能：一是产生细胞多样性并使各种细胞在本世代有机体中有严格的时空特异性；二是保证世代交替和生命的连续。
2、脊椎动物的精子发生在曲精小管中进行；减数分裂完成时，细胞质分裂是不完全的，形成生精皮（合胞体）3.原肠作用的细胞迁移的主要方式有外包，内陷，内卷，分层，内移和集中延伸。
4．初级神经胚形成是由脊索中胚层诱导上面覆盖的外胚层细胞分裂，内陷并与表皮质脱离形成中空的神经管。
5、人的胚胎发育过程中，后端神经管区域在27天时如不能合拢，则产生脊髓裂；若前端神经管区域不能合成，则胚儿前脑发育被停止，产生致死的无脑畸形，这些神经管闭合缺陷症约50%可由孕妇补充叶酸加以避免。
6、血管形成的两个过程包括由血岛形成血管；血管的出芽生长。
7、胚胎诱导的感受性特性有时间特异性、区域特异性、种间特异性、受遗传控制。
8．雌性哺乳动物的生殖道由缪勒氏管的分化而来，发育为输卵管、子宫、子宫颈和上阴道，而乌氏夫氏管退化。
9、果蝇的性别是通过X/A的比率来决定的，分母为常染色体数，分子为 X 染色体数。
维甲酸定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化覃敏;黄林;李慕军;莫曾南【摘要】目的初步探讨体外条件下定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞分化为雄性生殖细胞的条件,建立有效诱导分化技术平台.方法分离BALB/c小鼠NT-ESCs样集落并鉴定.NT-ESCs消化后分4组:1)采用维甲酸诱导NT-EBs向雄性生殖细胞方向分化;2)未分化的NT-ESCs;3)分化培养前的NT-EBs;4)自主分化的NT-EBs;5)小鼠胚胎成纤维细胞.RT-PCR法检测各组Oct-4、VASA、Scp3、Sry、Tex14和β-actin的mRNA表达;免疫荧光染色法检测VASA、Scp3蛋白表达.结果 NT-ESCs 集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性.NT-EBs维甲酸诱导组Oct-4、VASA、Scp3、Sry、Tex14和β-actin均有表达,对照组为阴性;NT-EBs细胞诱导分化后Scp3荧光强度为(+);实验组VASA荧光强度(+)也优于对照组的(±).结论采用维甲酸诱导可促进核移植胚胎来源NT-ESCs分化为雄性生殖细胞.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2014(034)011【总页数】5页(P1458-1462)【关键词】核移植;胚胎干细胞;雄性生殖细胞;诱导分化【作者】覃敏;黄林;李慕军;莫曾南【作者单位】广西医科大学第一附属医院人类精子库,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院人类精子库,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院人类精子库,广西南宁530021【正文语种】中文【中图分类】R617男性不育症总发病率逐年升高，其中精子形态异常引起的不育或生殖力低下的占男方因素的30%～40%[1]。
目前，能有效治疗男性不育症的方法是辅助生殖技术，但对于内源性生殖细胞缺如无精子症或精子畸形综合征患者, ART或药物治疗无效[2]。
胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)可诱导分化为成体器官不同胚层的所有细胞, 因此诱导ESCs在体外分化为雄性生殖细胞，可以为生殖发生提供一个理想的平台[3]。
而结合胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术，可在体外培育出与患者遗传特征完全相同的核移植胚胎干细胞(nuclear transfer embryonic stem cells，NT-ESCs)，为男性不育提供种子细胞的新来源。
NT-ESCs理论上可分化为各个组织, 但男性生殖细胞分化的研究尚少[4- 5]。
本研究旨在探讨雄性生殖细胞定向诱导分化条件及分子生物学基础。
1.1 材料雌性C57BL/6小鼠25 g，雌性BALB/c小鼠25 g[上海斯莱克动物有限公司,许可证号：SCXK(沪)2003- 000]。
RA、LIF、H-DMEM、bFGF、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、丝裂霉素C等(Sigma公司)。
cleavage medium、blastocystmedium(Sage BioPharma公司)。
1.2 NT-ESCs的培养和鉴定构建核移植胚胎并检测其DNA来源[6]。
重构胚常规培养，挑取形态典型，未分化的NT-ESCs集落传代。
经形态学、碱性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、类胚体实验、体内分化方法鉴定。
1.3 NT-EBs细胞诱导分化培养3～4 d后的NT-EBs接种于铺有0.1%明胶的24孔板。
加入含2 μmol /LRA、1 000 U/mL LIF、20 ng/ mL 成纤维细胞生长因子、30 ng/mL 干细胞生长因子、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、0.1 mmol/L β巯基乙醇,2 mmol/ L谷氨酰胺的高糖DMEM培养液，诱导其向雄性生殖细胞分化，观察NT-EBs生长和形态变化。
设4组对照组:1)未分化的NT-ESCs；2)分化培养前的NT-EBs；3)无共培养、自主分化的NT-EBs；4)小鼠胚胎成纤维细胞。
1.4 RT-PCR法检测诱导后雄性生殖细胞发育相关基因的表达收集培养的NT-EBs提取总RNA反转录为cDNA。
引物序列及退火温度见表1。
PCR参数: 95 ℃预变性4 min, 94 ℃45 s, 55 ℃～67 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环,72 ℃10 min。
产物电泳，结果以目的基因/β-actin条带密度比值表示(n=6)。
1.5 间接免疫荧光染色法检测VASA、Scp3蛋白的表达共培养12 d后按间接免疫荧光法, 检测分化组和对照组NT-EBs的VASA、Scp3蛋白表达，显微镜下观察并照相。
判断标准：(-)无荧光；(±)极弱的可疑荧光；(+)荧光较弱，但清楚可见；(++)荧光明亮；(+++～++++)荧光闪亮。
1.6 统计学分析采用 SPSS 13.0软件分析, 数据以均数±标准差表示, 方差齐性后选择q检验。
2.1 NT-ESCs的鉴定NT-ESCs呈椭圆形或鸟巢状细胞集落，边缘清晰(图1)；AKP染色呈强阳性,集落呈深蓝色 (图2A)；细胞具有20对染色体核型的结构 (图2B)；NT-ESCs悬浮培养能形成简单的NT-EBs，较为致密，形态规则 (图2C)；体内注射NT-ESCs可形成畸胎瘤,肿瘤包含源自3个胚层分化的衍生物(图2,D,E,F)。
2.2 NT-EBs体外诱导的生长观察NT-EBs呈圆球状悬浮于ESCs培养液, 细胞透亮活性好, 大小比较均一，内部细胞致密, 边缘规则(图3A)。
分化培养第4天部分细胞由梭形或杆状变为圆锥形，培养7和12 d的细胞增殖能力强，大而圆形细胞增多(图3C,D)。
2.3 RT-PCR检测雄性生殖细胞标志物的表达诱导12 d后的NT-EBs能够表达雄性生殖细胞相关的特征基因(VASA、Scp3、Sry、Tex14)。
与未分化NT-ESCs(0.68±0.03)相比，诱导后Oct4的mRNA相对表达量为0.31±0.06，呈下调趋势; Vasa, Scp3和Sry mRNA相对表达量为: 1.03±0.08、0.95±0.07、1.03±0.06，明显上调 (Plt;0.05)。
在诱导前和自然分化的NT-EBs中几乎未能检测到Texl4的表达。
小鼠胚胎成纤维细胞均不表达上述相关基因 (图4)。
2.4 NT-EBs细胞VASA和Scp3蛋白的表达诱导后第12天即可见NT-EBs细胞表达VASA (+)和Scp3 (+)，细胞成簇分布，部分细胞呈现一字形排列；在自然分化对照组NT-EBs中, 未见Scp3阳性细胞，微弱表达VASA (±)(图5)。
多项研究提示，由ESCs获得精子的技术是可行的[5,7]，基于体细胞核移植技术与胚胎干细胞技术NT-ESCs向男性生殖细胞分化有可能同时解决移植物来源和免疫排斥这两大难题。
本实验构建成功的小鼠NT-ESCs符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性并具有多能性，这为进一步研究组织修复及再生提供了技术平台。
虽然ESCs已证实可诱导分化为雄性生殖细胞，但分化的效率非常低[8]。
既往研究大多采用微环境对ESCs进行体外诱导，能使细胞在三维空间结构中进行移动并且与微环境相互作用。
例如，用骨形态发生蛋白4BMP4、RA诱导[9- 10]，或将ESCs体外诱导为原始生殖细胞样细胞进而分化成雄性生殖细胞[11]。
目前使用最多的方法是采用EB的形式，其含有3个胚层的细胞类型，提供了三胚层细胞间的相互接触模型。
目前体外形成EB的微环境能够支持生殖细胞的发育，并能消除生殖细胞发育早期亲缘印迹[12]。
在本实验中我们模拟体内微环境，并经RA诱导增殖，研究了胚胎干细胞的诱导分化情况。
本实验检测了4种NT-ESCs和雄性生殖细胞发育相关基因, Oct4为NT-ESCs特异性基因；VASA、Scp3、Sry和Tex14这4个基因为生殖系统特异性表达基因，特别在精子发生中起着重要作用。
经诱导后，NT-ESCs的Oct4表达减弱，VASA、Scp3、Sry和Tex14基因逐渐开始表达，说明RA可促进NT-ESCs表达雄性生殖细胞发育相关基因。
同时, 诱导后的NT-ESCs表达雄性生殖细胞标志蛋白VASA和Scp3，与报道类似[13]。
以上结果提示RA可诱导NT-ESCs向雄性生殖细胞分化，NT-ESCs具备向中胚层细胞分化的潜能。
但是，本研究分化后的细胞虽表现出雄性生殖细胞的相关蛋白，仅仅是一种前祖细胞，而非一种特定的生殖细胞。
目前，NT-ESCs技术仍具有优势，核移植技术已可生成人类胚胎干细胞，这一成果具有里程碑意义[14]。
因此，进一步精确、规范、增殖和鉴定分化中所涉及到的重要蛋白质的生化性质，筛选出影响诱导分化的关键因素，对NT-ESCs的定向诱导分化不仅在理论上且在实践中均具有重要的现实意义。
【相关文献】[1] Moskovtsev SI, Mullen JB, Lecker I, et al. Frequency and severity of sperm DNA damage in patients with confirmed cases of male infertility of different aetiologies[J]. Reprod Biomed Online, 2010,20:759- 763.[2] Larson KL, de Jonge CJ, BarnesAM, et al. Sperm chromatin structure assay parametersas of failed pregnancy following assisted reproductive techniques[J].Hum R eprod,2000,15: 1717- 1722.[3] Fadel HE.Developments in stem cell research and therapeutic cloning: Islamic ethical positions, a review[J].Bioethics,2012,26:128- 135.[4] Jung EM, Son HY, Jeung MK, et al. Epigenetic signatures of somatic cell nuclear transfer-derived embryonic stem cells[J].nt J Mol Med,2011,28:697- 704.[5] Nayernia K, J Nolte, HW Michelmann, et al. 1n vitro differentiated embryonic stem cells give rise to male gametes that can generate offspring mice[J]. Dev Cell,2006,11:125- 132. [6] 覃敏，何敏，宣强，等. 近交系小鼠体细胞核移植囊胚的微卫星DNA鉴定[J]. 基础医学与临床,2009,29:924- 928.[7] Yu Z, Ji P, Cao J, et al. Dazl promotes germ cell differentiation from embryonic stem cells[J]. J Mol Cell Biol, 2009, 1: 93- 103.[8] Yamano N, Kimura T, Watanabe-Kushima S, et al. Metastable primordial germ cell-like state induced from mouse embryonic stem cells by AKT activation[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,392:311- 316.[9] Toyooka Y, Tsunekawa N, Akasu R, et al. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci,2003,100:11457- 11462.[10] Chen W, Jia W, Wang K, et al.Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,418:571- 577.[11] Greber B, Wu U, Bememann C，et al. Conserved and divergent roles of FUF signaling in mouse epiblast stem cells and human embryonic stem cells[J]. Cell Stem Ce11,2010,8: 215- 226.[12] Geijsen N, Horoschak M, Kim K, et al. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells[J]. Nature,2004,427:106- 107.[13] Celso Silva,Jennifer R. Wood, et al. Expression Profile of Male Germ Cell-Associated Genes in Mouse Embryonic Stem Cell Cultures Treated with All-Trans Retinoic Acid and Testosterone[J].Mol Reprod Dev,2009,76: 11- 21.[14] Tachibana M, Amato P, Sparman M, et al. Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer[J].Cell,2013,153:1228- 1238.。
