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高效液相色谱法测定鸡肉中的二氯二甲吡啶酚程盛华;查玉兵;丁丽;杨春亮【摘要】目的:建立反相高效液相色谱法测定鸡肉中二氯二甲吡啶酚含量的方法.方法:采用Symmetry C18色谱柱(250mm×4.6,5μm);流动相为甲醇-水(20:80),流速1.0mL/min,检测波长266nm,柱温35℃.结果:在0.05～5.00 mg/L的范围内呈良好的线性关系(r=0.999 7),RSD＜5.0%(n=5),检出限为5ug/kg,回收率92.3%～102.1%.结论:此方法快速、简单、准确,实际样品分析结果令人满意,适合于鸡肉中二氯二甲吡啶酚的检测.【期刊名称】《分析仪器》【年(卷),期】2008(000)001【总页数】3页(P39-41)【关键词】高效液相色谱法;二氯二甲吡啶酚;鸡肉【作者】程盛华;查玉兵;丁丽;杨春亮【作者单位】中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001【正文语种】中文【中图分类】TS21 前言二氯二甲吡啶酚俗称克球酚(clopidol)，是一种杀虫效果较高的抗球虫兽药，在畜禽饲养业中应用广泛。
但由于停药期控制不严,常导致药物在禽肉组织中有残留。
目前禽肉中克球酚残留量的测定方法主要有气相色谱法、液相色谱法、酶联免疫法等。
气相色谱法测定克球酚,样品需衍生化后再测定，操作步骤复杂、繁琐，此外因样品中杂质较多，容易产生干扰，造成结果的假阳性，而且定量不准。
酶联免疫法目前尚不成熟，且不能准确定量[1]。
我国曾颁布进出口商品检验行业标准，但该方法操作繁琐，回收率不高，重复性也不好。
本文建立了鸡肉中克球酚残留量的液相色谱法测定法，此方法快速、简单、准确，适合批量检测。
2 实验部分2.1 仪器与试剂Waters2695液相色谱仪，配2996二极管阵列检测器；Empower化学工作站；CXJ-IIB型低速大容量多管离心机；RE-52AA旋转蒸发器；SHB-III型循环水真空泵；MS1旋涡混合器；E120H超声波清洗器；万分之一电子天平。
畜禽肉中多类兽药残留的快速检测黄 立（昆明市食品药品检验所，云南昆明 650032）摘 要：建立了猪肉、牛肉、鸡肉中磺胺类、四环素类、喹诺酮类共15种兽药残留量的快速检测方法。
样品经过Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液-2.5%乙酸乙腈溶液提取，经氯化钠、无水硫酸钠除水盐析后取乙腈相用高含碳量的C18吸附粉吸附净化，再用0.1%甲酸水乙腈（75+25）定容后上机检测。
结果显示，本方法测定三类混合药物的回收率在63.9%～104.0%，RSD在1.1%～12.2%，检测快速、灵敏度高、重复性好，定性定量准确可靠，适用于猪肉、牛肉及鸡肉中磺胺类、四环素类、喹诺酮类药物残留的快速检测。
关键词：液相色谱-串联质谱法；磺胺；四环素；喹诺酮Rapid Detection of Multiple Types of Veterinary Drug Residues in Livestock and Poultry MeatHUANG Li(Kunming Institute for Food and Drug Control, Kunming 650032, China) Abstract: A rapid method was established for the determination of 15 veterinary drug residues of sulfonamides, tetracyclines and quinolones in pork, beef and chicken. The samples were extracted by Na2EDTA-Mcllvaine buffer-2.5% acetic acid acetonitrile solution, and the acetonitrile phase was purified by adsorption with high carbon content C18 adsorbent powder after dehydration salting by sodium chloride and anhydrous sodium sulfate, and then fixed with 0.1% formic acid aqueous acetonitrile (75+25) and detected on the machine. The results showed that the method determines the recovery of the three types of mixed were 63.9%～104.0%, RSD were 1.1%～12.2%, rapid detection, high sensitivity, good repeatability, accurate and reliable qualitative and quantitative, suitable for the rapid detection of sulfonamides, tetracyclines, quinolones drug residues in pork, beef and chicken.Keywords: liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sulfonamide; tetracycline; quinolone合理使用兽药可以提高畜禽养殖效率，节省成本，缩短出栏周期，进而增加收益，但越来越多的人为追求经济效益滥用药物，导致了一些兽药以残留的形式流入人体，从而对身体健康造成威胁[1]。
高效液相色谱串联质谱法检测鸡肉中金霉素差向金霉素摘要：建立了高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）快速测定鸡肉中差向金霉素、金霉素的检测方法。
均质样品用PH=4.0 EDTA-McIIvaine缓冲溶液提取，经Oasis HLB SPE小柱净化，采用LC-ESI-MS/MS和正离子多反应监测（MRM）模式检测。
差向金霉素在0.025~0.8 μg/mL，金霉素在0.005~0.2 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.99。
在0.05、0.10、0.15 mg/kg的加标水平下，回收率为73.0%~101.6%，相对标准偏差（RSD）为2.1%~12.2%。
差向金霉素和金霉素的定量限分别为30.0 μg/kg、10.0 μg/kg。
该方法样品处理简单，可同时检测差向金霉素和金霉素的残留，且准确度和精密度均符合残留分析的要求。
关键词固相萃取；高效液相色谱串联质谱；差向金霉素；金霉素；鸡肉金霉素（Chlortetracycline，CTC）因其抗菌谱广和价格便宜等特点被广泛的应用于兽医临床和畜牧业养殖中。
金霉素在动物经饲料摄取后，能残留于动物肌肉组织、肝脏和肾脏甚至骨骼中[1]。
另外，金霉素在生产和储存以及动物生产代谢的过程中，也会产生多种发酵和代谢产物，代谢产物与母体在活性，毒性以及环境的耐受性上存在差异[2]。
在弱酸性条件下，金霉素易转化为其代谢产物差向金霉素（4-Epi-chlortetracycline，ECTC），差向金霉素为金霉素的差向异构体，无抗菌活性，但毒副作用增加，已经被欧盟确定为残留标识物[3]。
有研究表明[4]：给蛋鸡饲喂含有金霉素的饲料后，鸡蛋中有金霉素的代谢物差向金霉素检出。
而目前，我国对动物食品中金霉素残留的监控，仅停留在原形药物金霉素上，尚未把差向金霉素作为残留标识物来监控。
而国外已开始金霉素及其代谢物的检测方法[5-11]的研究，我国采用的高效液相色谱测定金霉素的检测方法大部分都没有将金霉素和差向金霉素区别开来，关于鸡肉中金霉素及差向金霉素同步快速检测方法，国内外报道甚少。
超高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织和鸡蛋中残留的11种甾体激素类药物贺利民;黄显会;方炳虎;黄士新;曹莹;陈建新;曾振灵;陈杖榴【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2008(26)6【摘要】建立了采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定猪、牛、羊和鸡肌肉组织及鸡蛋中睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等11种甾体激素多残留的分析方法.试样在碱性条件下用叔丁基甲醚提取,冷冻离心脱脂净化,以乙腈和甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,反相液相色谱分离.采用电喷雾离子化、多反应监测方式(MRM),对11种甾体激素同时进行定性定量测定.动物肌肉和鲜蛋中睾酮、甲基睾酮、勃地龙、美雄酮及司坦唑醇的检出限为0.3 μg/kg,群勃龙、诺龙、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙的检出限为0.4 μg/kg.在动物组织及鸡蛋中添加1,2及10 μg/kg 水平的药物回收试验中,睾酮、甲基睾酮、勃地龙、美雄酮及司坦唑醇的回收率均在62.3%～105%之间,相对标准偏差为0.5%～15%;群勃龙、诺龙、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙的回收率大于50.0%,相对标准偏差小于16%.11种甾体激素在1～100 μg/L范围内,线性关系良好,相关系数都大于0.99.该方法的样品前处理简单、快速,测定灵敏、准确,选择性好,可满足动物源食品中甾体激素类药物多残留的同时测定.【总页数】6页(P714-719)【作者】贺利民;黄显会;方炳虎;黄士新;曹莹;陈建新;曾振灵;陈杖榴【作者单位】华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;上海市兽药饲料检测所,上海,201103;上海市兽药饲料检测所,上海,201103;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织中氨基甲酸酯类杀虫剂及其代谢物残留 [J], 邓龙;郭新东;何强;杨群华;沈玉栋;王弘2.高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量 [J], 张凤清;王岩松;范世华;周长民3.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物肌肉组织中6种氨基糖苷类药物残留[J], 钟名琴;黄婷;吴雯娟;罗燕;丁燕玲4.QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱法测定土壤中61种激素类药物残留 [J], 任雪冬; 王璐; 熊爽5.分散微固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定水样中3种氯霉素类和11种激素类药物残留 [J], 粟有志;李艳美;周均;尚爽;李芳;王兴磊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中甲氧苄啶残留量的不确定度评定徐美玲（南京市产品质量监督检验院（南京市质量发展与先进技术应用研究院），江苏南京 210041）摘 要：目的：高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中的甲氧苄啶残留量，评估实验过程中引入的不确定度。
方法：建立数学模型，对不同分量从来源进行不确定度分析，分别量化后合成，最终形成鸡肉中甲氧苄啶残留量测定的不确定度分析方法。
结果：鸡肉样品甲氧苄啶残留量为10.011 3 μg·kg-1，包含因子k=2时，其扩展不确定度为0.778 8 μg·kg-1。
结论：在鸡肉中甲氧苄啶的检测中，可以通过提高标准曲线的准确度以及仪器的精密度降低结果的不确定度，从而提高结果的准确性。
关键词：鸡肉；甲氧苄啶；液相色谱-串联质谱；不确定度Uncertainty Evaluation for Determination of Trimethoprim Residues in Chicken by Liquid Chromatography-TandemMass SpectrometryXU Meiling(Nanjing Institute of Product Quality Inspection (Nanjing Institute of Quality Development and Advanced TechnologyApplication), Nanjing 210041, China)Abstract: Objective: To determine trimethoprim residue in chicken meat by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and to evaluate the uncertainty introduced in the experiment. Method: A mathematical model was established to analyze the uncertainty of different components from the source, which were quantified and synthesized respectively, and finally an uncertainty analysis method for the determination of trimethoprim residue in chicken was formed. Result: The residue trimethoprene in chicken samples was 10.011 3 μg·kg-1, and the estended uncertainty was 0.778 8 μg·kg-1 when k=2 was included. Conclusion: In the detection of trimethoprim in chicken, the accuracy of the results can be improved by improving the accuracy of the standard curve and the precision of the instrument to reduce the uncertainty of the results.Keywords: chicken; metrimethoprim; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; uncertainty甲氧苄啶可以作为磺胺类药物的抗菌增效剂，可以干扰细菌的叶酸代谢进而抑制细菌的生长。
22-第42 卷2014 年12 月分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Jo urnal of Analytical Chemistry第12 期1797 ～1803DO I:10〃11895 / j〃iss n〃0253-3820〃140719在线净化液相色谱-串联质谱法测定畜禽粪便中7 种β2-受体激动剂李丹妮* 严凤吴剑平周悦榕顾欣张鑫( 上海市动物疫病预防控制中心，上海201103)摘要建立了同时测定畜禽粪便中福莫特罗、沙美特罗、卡布特罗、克伦异磅特罗、克伦潘特、克伦塞罗和羟甲基克伦特罗7 种β2 -受体激动剂的超高效液相色谱-串联质谱(U PL C-M S /M S)分析方法。
样品经酸性乙腈充分提取后，再用0．2%甲酸溶液稀释，提取液用阳离子交换在线净化柱(H y p e r S e p Ｒe t a i n C X)净化，2%氨水-甲醇溶液将分析物洗脱转入至H y p e rs il G o l d C18 分析柱，经色谱分离后，用串联质谱检测。
在正离子电喷雾条件下，采用选择反应监测模式检测，以外标法定量。
结果表明，7 种β受体激动剂在0．5 ～100 μg/L 的浓度范围内线性良好，线性相关系数均大于0．9928。
取3 倍信噪比下，畜禽粪便中7 种β2 受体激动剂的检出限为 1μg/k g，定量限为5 μg/k g。
在空白猪、鸡粪便中添加5 ～50 μg/k g水平的7 种β2 受体激动剂，得到平均回收率为67%～112%，其相对标准偏差为2．9%～10．2%。
本方法简单快速，适用于畜禽粪便中β2 -受体激动剂残留的定量及确证分析。
关键词在线净化液相色谱-串联质谱; 7 种β2 -受体激动剂; 残留; 畜禽粪便1 引言β2 -肾上腺素能激动剂，简称β2 -受体激动剂，俗称“瘦肉精”，在动物体内( 猪、鸡) 可通过增加蛋白质合成，促进脂肪组织的分解代谢，显著提高酮体瘦肉率［1 ～3］。
超高效液相色谱泊联质谱测定动物肌肉组织中32种β激动剂、β阻滞剂和糖肽类抗生素药物残留摘要建立了同时测定动物肌肉组织中27种β激动剂、3种β阻滞剂和2种糖肽类抗生素的超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）方法。
样品经酶解、蛋白沉淀后，以乙酸乙酯异丙醇（6∶4，V/V）提取，StarataXC固相萃取净化，BEH C18色谱柱分离，乙腈0.1%甲酸梯度洗脱，串联质谱ESI+电离，多反应监测模式检测，外标法定量。
结果表明，32种目标物在线性范围内相关性良好（R2>0.995），多巴胺、瑞普特罗、万古霉素和去甲万古霉素的方法检出限为5 μg/kg，其它目标物的检出限为3 μg/kg；平均加标回收率为83.6%～103%，相对标准偏差（n=6）为3.9%～10.4%，日间精密度为4.5%～9.8%。
结果表明，本方法准确、灵敏，适用于动物肌肉组织中β激动剂、β阻滞剂，以及糖肽类抗生素的高通量测定。
关键词β激动剂；β阻滞剂；糖肽类抗生素；动物肌肉；超高效液相色谱串联质谱法1引言β激动剂俗称“瘦肉精”，主要作为促生长剂被添加到动物饲料中，长期食用含此类药物残留的畜禽产品可能会引起肌肉振颤、心悸、紧张等症状[1，2]，多个国家和地区已禁止将β激动剂用于畜禽生产[3～5]。
β阻滞剂是一类能拮抗神经递质和儿茶酚胺对β受体激动作用的药物，常在动物运输或屠宰前数小时内使用，以降低动物因应激而造成的突然死亡率及对动物肉质的影响，残留风险较大，欧盟和国际食品安全法典委员会已对动物组织中β阻滞剂卡拉洛尔的残留做了限量规定[6，7]（猪肌肉为5 μg/kg，猪肝、肾为25 μg/kg）。
万古霉素和去甲万古霉素属于糖肽类抗生素，用于治疗细菌感染，我国农业部第560号公告规定万古霉素为禁用兽药[8]。
虽然目前已有动物尿液、血液和肌肉组织中β激动剂[9～13]、β阻滞剂[14]和糖肽类抗生素[15]残留的检测方法研究，但检测对象多为单一的一类药物，没有同时检测这3类药物的研究。
中国科学B辑:化学 2009年 第39卷 第8期: 774~784 774 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留吴永宁①②*, 苗虹①*, 范赛①②, 赵云峰①②①中国疾病预防控制中心营养与食品安全所, 北京100021;②中国农业大学动物医学院, 北京100193* 通讯作者, E-mail: wuyncdc@; miaohong0827@收稿日期：2009-04-26; 接受日期：2009-05-26摘要利用高效液相色谱-线性离子阱质谱(HPLC-ITMS)以同位素稀释技术测定了肌肉组织中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂. 肌肉样品经5%的三氯乙酸溶液酸解提取, 以弱阳离子固相萃取柱进行净化. 以甲醇和含0.1%甲酸的水溶液为流动相在液相色谱柱上梯度洗脱分离, 采用ESI源正离子模式在选择离子监测(SRM)模式下进行扫描. 以9种经氘代同位素标记的β2-受体激动剂为内标进行定量. 猪肉中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的线性范围为5~200 μg/L, 相关系数(r)大于0.995, 各化合物在肌肉中的检出限均能达到0.2 μg/kg. 以空白猪肉样品进行的加标水平为5、10、20 μg/kg的加标回收试验, 各化合物的回收率在47.3%~123.7%之间, 相对标准偏差在3.2%~25.7%之间. 对猪肉样品和鸡肉样品进行了测定, 得到了满意的结果. 该方法灵敏度高, 定性准确, 可以用于畜禽肌肉中β2-受体激动剂和β-阻断剂类药物残留的确证检测. 关键词β2-受体激动剂β-阻断剂肌肉检测HPLC-ITMS1引言β2-受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物(phenthylamines, PEAs), 具有苯乙醇胺结构母核, 苯环上连接有碱性的β-羟胺侧链. 由侧链上取代基的差异, 划分为不同的药物. β2-受体激动剂在临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量, 可用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎等症状. 20世纪80年代初, 一系列的动物实验表明, 当用药剂量超过治疗剂量5倍时, 该类药物如克伦特罗、沙丁胺醇等可以起到促进动物生长, 提高瘦肉率的作用[1~3], 随之而来的被大量非法添加于饲料中, 以促进家畜生长及提高瘦肉率, 因而导致β2-受体激动剂在动物体内的蓄积, 进一步引起食物中毒的情况发生. 自1983年西班牙首次发生克伦特罗食物中毒事件以来, 20世纪90年代, 欧洲因克伦特罗污染引起食物中毒的时间超过500起[4,5], 我国自1998年香港出现克伦特罗中毒事件后亦多次发生, 伴随着国内外对克伦特罗监管的加强, 利益的驱使促使不法分子, 将其他β2-受体激动剂[6], 如沙丁胺醇、马布特罗、溴布特罗和莱克多巴胺等非法添加与动物饲料及饮水中. 因此, 建立β2-受体激动剂多组分残留的测定方法是非常重要的. β-阻断剂类药物则被广泛用于动物运输过程中防治由于动物应激而造成的突然死亡, 由于该类化合物往往是在动物屠宰前的数小时注射使用的, 因此该类化合物中国科学 B 辑: 化学 2009年 第39卷 第8期775相对其他的兽医用药可能对消费者造成的健康风险更大. 长期食用高残留的动物组织除会造成消费者如焦虑、头痛、食欲减退等精神症状外, 还会造成消费者对药物的依赖性. 因此各国对β-阻断剂类药物在动物饲养中的使用也都有明确的规定[7]. 欧盟的96/23/EC 指令[8]规定动物性食品中不得检出β-兴奋剂类药物残留; 我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中将克伦特罗及其盐、沙丁胺醇及其盐和酯、西马特罗及其盐和酯列为禁止使用的兽药, 并规定在动物性食品中不得检出[9].目前用于测定β2-受体激动剂的方法较多, 多采用包括免疫亲和层析、固相萃取(SPE)以及固相基质萃取(MSPD)等方法进行净化, 通过色谱或色谱与质谱串联的手段进行检测[10~19], 但净化之前多采用β-葡萄糖醛酸酶或其他方式进行酶解, 仅有少数报道采用酸解或碱性水解的方式使目标化合物解离[18,19]; 为了满足快速筛查的要求, 有关免疫分析法(ELISA 、RIA)也有报道, Elliott CT 等人采用酶联免疫法(ELISA)对莱克多巴胺进行了检测[20], 沈建忠等人采用时间分辨荧光免疫分析法 (TR-FIA) 对猪组织中的莱克多巴胺进行检测, 检测限可以达到0.1 μg/kg [21], 但免疫分析方法的单一性, 不适应多残留的检测. 对β-阻断剂的检测方法的报道较少, 主要对环境中的β-阻断剂进行检测, M. Dolores Hernando [22]以LC-MS 测定了污水及地表水中的11个β-阻断剂; Hing-Biu Lee [23]采用基质固相萃取技术测定了废水中的12个β-阻断剂和β2-受体激动剂. 有关动物性食品中的β-阻断剂的测定还未见报道. 本文的目的是建立一种高灵敏、快速的对多种β2-受体激动剂和β-阻断剂类药物进行同时测定的分析方法, 以满足对市场动物性食品中β-兴奋剂类药物监管的要求.2 实验部分2.1 试剂及标准溶液甲醇、乙酸乙酯(色谱纯, J.T.Baker 公司), 甲酸(纯度为99%, Ameisensaeure 公司), 高氯酸(优级纯, 北京化工厂)、三氯乙酸(优级纯, 北京化学试剂公司)、氢氧化钠(优级纯, 北京化学试剂公司)、浓氨水(优级纯, 天津市东方化工厂); 实验用水均为超纯水,电阻率为18.2 MQ·cm (Millipore 公司超纯水器制备). β2-受体激动剂标准品：溴布特罗(brombuterol- HCl, 纯度>99%), 克伦异磅特罗(clenisopenterol- HCl, 纯度>99%)、克伦赛罗(clencyclohexerol hy- drochloride, 纯度>99.5%)、(clenhexerol, 纯度>99%)、塞布特罗(cimbuterol, 纯度>99%)、马贲特罗(mapenterol hydrochloride, 纯度>99%)购自WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH, 德国; 马布特罗(mabuterol, 纯度>99.1%)、塞曼特罗(cimaterol, , 纯度>99.5%)购自Boehringer Ingekheim. 沙美特罗(salmeterol, 纯度>98%)购自Toronto Research Chemical Inc., 美国; 克伦普罗(clenproperol, 纯度>99%)、克伦磅特罗(clenpenterol, 纯度>99%)购自EU Reference Laboratory, 德国; 异丙喘宁(metaproterenol, 纯度>99.9%)、特布他林(terbutaline, 纯度>98%)、沙丁胺醇(salbutamol, 纯度>98%)、丙卡特罗(procaterol, 纯度>99%)、非诺特罗(fenoterol, 纯度>98%)、克仑特罗(clenbuterol, 纯度>95%)、莱克多巴胺(ractopamine, 纯度>95.6%)、妥布特罗(tulobuterol, 纯度>98%)、福莫特罗(formoterol fumarate, 纯度>98%)、班布特罗(bambuterol hydrochloride, 纯度>98%)、利托君(ritodrine hydrochloride, 纯度>99%)购自Sigma 公司.β-阻断剂标准品：美托洛尔(metoprolol, 纯度>98%)、拉贝洛尔(labetalol hydrochloride, 纯度>98%)、普萘洛尔(propranolol hydrochloride, 纯度>98%)、倍他洛尔(betaxolol, 纯度>98%)、喷布洛尔(penbutolol sulfate, 纯度>98%)购自Sigma 公司, 美国.氘代同位素标准品：D 7-Cimaterol 、D 6-Salbuta- mol 、D 9-Cimbuterol 、D 7-Clenproperol 、D 5-Ractopa- mine 、D 9-Mabuterol 、D 11-Mapenterol 、D 6-Clenbuterol 购自EU Reference Laboratory, 德国; D 3-Salmeterol 购自Cambridge Isotope Laboratories Inc, 美国.β2-受体激动剂及β-阻断剂标准溶液储备液的配制：精确称取标准品各约0.0100 g, 分别用甲醇溶解并定容至10 mL, 浓度为1000 mg/L, 于−18℃冰箱中保存. 需要时将各标准储备液制成浓度为10 mg/L 的混合标准工作液, 使用时用甲醇稀释成1 mg/L 的混合标准使用液, 使用后置于−18℃冰箱中保存. 氘代同位素标准品, 直接用 1 mL 甲醇溶解, 除D 3-吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留776Salmeterol(1000 mg/L)外制成10 mg/L 的标准溶液, 使用时用甲醇制成1 mg/L 的内标混合使用液, 使用后置于−18℃冰箱中保存.2.2 仪器与设备高效液相色谱-线性离子阱质谱仪(LTQ, Thermo- fisher 公司, 美国), 离心机(Sigma3K-15型, Sigma 公司, 美国), Oasis MCX 固相萃取柱(6 mL, 150 mg, waters 公司, 美国), N2-浓缩仪(N-EVAP, analytical evaporator Associates INC., 美国).2.3 提取精确称取匀浆后的肌肉样品约5.0 g, 加入5%的三氯乙酸溶液10 mL, 涡旋混匀, 置于80℃水浴中加热超声提取30 min, 以10000 r/min 0℃离心10 min, 吸取上清液于25 mL 试管中. 沉淀用5%的三氯乙酸溶液5 mL 再提取一次, 再以10000 r/min 0℃离心10 min. 合并提取液, 待进行净化处理.2.4 净化Waters Oasis MCX 柱(6 mL,150 mg)依次用6 mL 甲醇、6 mL 水活化后, 将提取液上MCX 柱, 弃去流出液, 依次用2 mL 0.1 mol/L 的高氯酸溶液、1 mL 甲醇淋洗, 用6 mL 含5%浓氨水的甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 将洗脱液置于N2-浓缩仪上浓缩至近干, 用1 mL 甲醇-0.1%甲酸水溶液 (10︰90, V ︰V)充分溶解残渣, 将此溶液过0.22 μm 的有机滤膜待进行LC-MS 测定.2.5 基质匹配的标准工作曲线的制备准确吸取1 mg/L 的混合标准使用液, 用初始流动相配比复溶的空白基质溶液制成5、10、20、40、80、160和200 μg/L 的标准系列溶液. 空白基质溶液的制备：称取与试样基质相应的阴性样品5.0 g, 与试样同时进行提取、净化和复溶得到.2.6 仪器条件 2.6.1 液相色谱条件色谱柱：Waters Atlantis ® T3柱, 150 mm×2.1 mm, 3 μm; 流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱, 参考梯度洗脱条件见表1, 流速：250 μL/min, 柱温：30, ℃表1 液相色谱参考梯度条件时间(min) 0.1%甲酸水溶液(%)甲醇(%)0 90 1045 30 7046 5 9547 10 9055 90 10进样量：10 μL.2.6.2 质谱参考条件离子化模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+); 质谱扫描方式：选择离子监测(SRM), 喷雾电压：4 kV; 鞘气流速：35 arb, 辅助气流速：15 arb, 毛细管温度：325℃, 毛细管电压：50 V. 线性离子阱参数: 全扫描目标离子数10000.0; 选择离子监测目标离子数5000.0; 多级质谱目标离子数 (MSn) 5000.0; 精确扫描目标离子数3000.0. 其余质谱参数见表2.3 结果与讨论3.1 样品提取有些β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物在动物组织中会以硫酸轭合物或葡萄糖醛酸轭合物等形式存在, 因此样品要先进行水解, 使待测物游离或从组织中释放已进行后续的提取. 尤其是沙丁胺醇、异丙喘宁等苯酚型药物的轭合物比例较高, 必须经水解后进行提取和净化. 常用的水解方法主要有酶水解[15]、酸水解[18]和碱水解[19]. 本研究采用酸解方式, 一方面三氯乙酸可以起到水解轭合物的作用, 另一方面三氯乙酸具有较强的蛋白沉淀能力, 减少了酶水解中酶制剂本身及其水解后的样品中产生的蛋白类物质对目标化合物的干扰. 样品提取液的 pH 值在3.6~ 4.0之间, 可以直接上经活化后的Waters Oasis MCX 固相萃取柱进行净化.3.2 净化动物源性样品基质较为复杂, 存在着对目标化合物的严重干扰, 本方法采用三氯乙酸提取, 并结合低温高速离心的方式对蛋白物质进行沉淀, 应用固相萃取的方式进行净化. β2-受体激动剂是含氮激素中国科学 B 辑: 化学 2009年 第39卷 第8期777表2 β2-受体激动剂及β-阻断剂质谱采集参数a)化合物 保留时间(min) 母离子(m /z )对应内标Segment 定量离子(m /z )定性离子(m /z ) 碰撞能量(%)扫描范围(m /z )Metaproterenol 3.15 212 D7-Cimaterol 1 194 152 27 149~215 D7-Cimaterol 5.03 2272 209− 19 206~230 Cimaterol 5.14 220 D7-Cimaterol 2, 3 202−26 199~223Terbutaline 6.13 226 D6-Salbutamol 3 152 170,208 26 149~230 D6-Salbutamol 6.22 2463 228 167,148 18 165~250Salbutamol 6.46 240 D6-Salbutamol 3 222 166 20 163~243 D9-Cimbuterol 9.71 2434 225161 18 155~250 Cimbuterol9.87 234 D9-Cimbuterol 4 21616021 155~240Procaterol 12.14 291 D9-Cimbuterol 5 273 232,216 21 213~295 Fenoterol 12.46 304 D9-Cimbuterol 5 286 135,107 24 105~308 Ritodrine 13.09 288 D7-Clenproperol 5 270 150 21 145~292 Clencyclohexerol 13.46 319 D7-Clenproperol 5 301 − 20 298~323 D7-Clenproperol 15.282706252− 17 248~273 Clenproperol 15.42 263 D7-Clenproperol 6 245 − 22 242~266 D6-Clenbuterol 19.43 283 7 265 204 16 201~286 Clenbuterol 19.60 277 D6-Clenbuterol 7 259 203 22 75~280 D5-Ractopamine 18.99 307 7 289 167 18 165~310 Ractopamine 19.02 302 D5-Ractopamine 7 284 164 21 160~305 Bromchlorbuterol 21.20323 D5-Ractopamine830524916246~326Metoprolol 21.45 268 D5-Ractopamine8 191 116 34 113~271Tulobuterol 22.15 228 D9-Mabuterol 8 154 172 28 150~231 Formoterol 21.94 345 D9-Mabuterol 8 327 149 22 145~350 Brombuterol 22.72 367 D9-Mabuterol 8 349 293 18 290~370 D9-Mabuterol 23.13 3208, 9 30223815 235~325Clenpenterol 23.29 291 D9-Mabuterol 8, 9 273 203 21 200~295 Mabuterol 24.17 311 D9-Mabuterol 9 293 237 20 235~315 Bambuterol26.61 368 D11-Mapenterol 10 312294 20 290~371 Clenisopenterol 27.07 291 D11-Mapenterol 10 273 −21 270~295 D11-Mapenterol 27.46 336 10 31823817 235~340Mapenterol 27.73 325 D11-Mapenterol 10, 11307 237 19 235~330 Labetalol 28.00 329 D11-Mapenterol 11 31120719 205~333Propranolol29.83 260 D11-Mapenterol11 183 116,157 31 113~265 Betaxolol 31.66 308 D11-Mapenterol 11, 12116 177,231 31 113~311 Clenhexerol 33.38 305 D11-Mapenterol 12 287−17 284~310 Penbutolol41.31 292 D3-Salmeterol 13 236201 25 197~295 D3-Salmeterol 41.71 419 13 401383 19 380~422 Salmeterol41.76 416 D3-Salmeterol 13 39838018 375~420a) 碰撞能量(%)为归一化能量; −表示母离子被施予能量打碎后只有一个碎片离子. 分离窗口宽度为2(m /z ), Q 值为0.25吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留778中的苯乙胺类药物, 均具有苯乙醇胺结构的母核, 按照苯环上取代基不同, 常将其分为苯胺型和苯酚型, 由于含有氨基或酚羟基, 故通常具有极性, 但由于取代基的不同, 极性差异较大, 如结构中具有芳伯氨基, 则多表现为中等极性. 而Waters Oasis MCX 固相萃取柱是具有混合型阳离子交换反相吸附剂的固相萃取柱, 考虑到β2-受体激动剂具有的苯乙醇胺母核及取代基, 在偏酸性情况下对β2-受体激动剂以及β-阻断剂类化合物多能与H +结合形成阳离子, 被MCX 柱的填料吸附, 从而具有高的选择性和灵敏度[14], 起到较好的净化效果.3.3 质谱参数的优化通过流动注射200 μg/L 的以甲醇−0.1%甲酸水溶液(50︰50, V /V )为溶剂的单标标准, 并同时开启液相色谱流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(50︰50, V /V),流速为250 μL/min, 对碰撞能量及质谱参数如喷雾电压, 毛细管电压、毛细管温度、鞘气及辅助气流速等参数进行了优化, 具体优化结果见2.6.2节的质谱参参数. 经过优化后, 选择离子监测(SRM)模式下, 23 种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂均得到了较高的响 应值.表2 β2-受体激动剂及β-阻断剂质谱采集参数表中Cimaterol 、Clencyclohexerol 、Clenproperol 、Clenisopenterol 、Clenhexerol 的二级质谱碎片均只有一个, 分别为202、301、245、273和287. Shao 等[15]采用waters 公司的三重四极杆质谱测定了猪肝、猪肾及猪肉中的16种β2-受体激动剂, 其中Cimaterol 的质谱碎片离子为159.7和142.7、Clencyclohexerol 的质谱碎片离子为300.9和202.8、Clenproperol 的质谱碎片离子为245和203、Clenisopenterol 的质谱碎片离子为273.0和216.9. 由于离子阱质谱与四级杆质谱的工作原理不同, 对液质联用方法来说常会发生裂解碎片不同的情况, 但本实验中只有一个二级碎片离子不能满足质谱确证的要求. 在今后的实验工作中可以增加二级质谱的碰撞能量或发挥离子阱质谱的优势做三级质谱扫描来解决此问题.3.4 线性方程、检出限及定量限为了更好的降低基质效应的干扰, 本研究采用了基质匹配的标准溶液进行线性实验. 按照2.5配制基质匹配的系列标准系列溶液并注入液质联用仪进行分析, 记录各化合物的色谱峰面积(A )和内标的色谱峰面积(A i ), 以A 和A i 的比值(氘代同位素内标除对应各自的化合物外, 其他化合物按色谱保留时间顺序以相近的氘代同位素化合物为内标)对相应的标准溶液中化合物的浓度进行线性回归计算, 得出线性方程、线性范围和相关系数(r ), 结果见表 3. 由结果可见, 在5~200 μg/L 范围内, 各物质均取得良好线性相关, 相关系数(r )大于0.995. 浓度为80 μg/L 的基质匹配标准溶液的选择离子监测(SRM)的总离子流图见图1, 各化合物的定量离子提取色谱图见图2.采用空白基质加标的方式, 以信噪比(S /N )为3的含量定为方法的检出限(LOD), 以信噪比(S /N )为10的含量定为方法的定量限(LOQ), 23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的检出限及定量限结果列于表 3中.3.5 加标回收实验结果加标回收试验采用空白猪肉样品进行试验, 加标水平分别为5、10和20 μg/kg. 测定结果列于表4中, 加标水平为 5 μg/kg 时, 各化合物的回收率在47.3%~111.5%之间, RSD 在7.2%~23.5%之间; 加标水平为10 μg /k g 时, 各化合物的回收率在47.3%~123.7%之间, RSD 在4.8%~25.7%之间; 加标水平为20 μg /k g 时, 各化合物的回收率在52.2%~117.7%之间, RSD 在3.2%~23.0%之间. β2-受体激动剂分为苯胺型和苯酚型, 由于含有氨基或酚羟基通常具有极性, 但由于取代基的不同, 极性差异较大. 且本方法同时检测28种化合物, 加上9个氘代 同位素内标, 共有37个化合物, 从梯度洗脱的液相色谱的保留时间上从3 min 开始出峰到42 min 第37个化合物沙美特罗出峰, 也可以看出各化合物的极性差异, 因此可能在MCX 柱上的保留量和洗脱量会因极性差异而有所不同. 多次试验我们都发现在色谱上最后一个出峰的沙美特罗回收率均较低, 由于沙美特罗取代基类型为水杨醇型, 极性较弱不易与H +结合形成阳离子, 故在MCX 柱上保留较差. 另外加标水平较低为5 μg/kg 时, 受基质效应的影响有些化合物的回收率也较低, 但平行测定结果之间的精中国科学 B 辑: 化学 2009年 第39卷 第8期779表3 线性方程、相关系数及检出限和定量限化合物 线性方程 相关系数(r ) 检出限(LOD, μg/kg)定量限(LOQ, μg/kg)Metaproterenol Y = 0.0736x + 0.0736 0.99950.100.25Cimaterol Y = 0.0237x + 0.6583 0.9958 0.20 0.50 Terbutaline Y = 0.0869x + 0.0854 0.9971 0.200.90Salbutamol Y = 0.0756x − 0.0092 0.9972 0.05 0.20 Cimbuterol Y = 0.0311x + 0.0100 0.9997 0.20 0.50 Procaterol Y = 0.0508x + 0.0843 0.9957 0.20 1.00 Fenoterol Y = 0.0276x + 0.0048 0.9992 0.20 1.00 RitodrineY = 0.1259x + 0.1179 0.9980 0.15 0.50 Clencyclohexerol Y = 0.0364x + 1.3427 0.9964 0.10 0.20 Clenproperol Y = 0.0379x + 0.0203 0.9992 0.20 1.00 Ractopamine Y = 0.0606x + 0.0253 0.9996 0.20 0.50 ClenbuterolY = 0.0367x + 0.0388 0.9970 0.200.50Bromchlorbuterol Y = 0.0316x − 0.0057 0.9966 0.20 1.00 Metoprolol Y = 0.0249x + 0.0248 0.9991 0.10 0.25 Formoterol Y = 0.0695x + 0.0563 0.9966 0.201.00Tulobuterol Y = 0.0576x − 0.0002 0.9993 0.10 0.20 Brombuterol Y = 0.0393x + 0.0412 0.9982 0.20 1.00 Mabuterol Y = 0.0993x + 0.0831 0.9994 0.20 0.50 Clenpenterol Y = 0.0455x + 0.0697 0.9965 0.20 1.00 Bambuterol Y = 0.0826x + 0.1578 0.9981 0.10 0.20 Clenisopenterol Y = 0.0457x + 0.0834 0.9953 0.20 1.00 Mapenterol Y = 0.0417x + 0.0246 0.9991 0.20 1.00 Labetalol Y = 0.0633x + 0.1315 0.9961 0.20 1.00 Propranolol Y = 0.0307x + 0.0643 0.9964 0.10 0.20 Betaxolol Y = 0.0245x + 0.0486 0.9975 0.10 0.20 Clenhexerol Y = 0.0487x + 0.0912 0.9980 0.20 1.00 Penbutolol Y = 0.1649x + 0.3397 0.9969 0.20 0.50 SalmeterolY = 0.1117x + 0.06710.99580.201.00图1 基质匹配的混合标准溶液(80 μg/L)的SRM 总离子流图1. Metaproterenol;2. Cimaterol;3. D 7-Cimaterol;4. Terbutaline;5. Salbutamol;6. D 6-Salbutamol;7. Cimbuterol;8. D 9-Cimbuterol;9. Procaterol;10. Fenoterol; 11. Ritodrine; 12. Clencyclohexerol; 13. Clenproperol; 14. D 7-Clenproperol; 15. Ractopamine; 16. D 5-Ractopamine; 17. Clen-buterol; 18. D 6-Clenbuterol; 19. Bromchlorbuterol; 20. Metoprolol; 21. Tulobuterol; 22. Formoterol; 23. Brombuterol; 24. Mabuterol; 25. D 9-Mabuterol; 26. Clenpenterol; 27. Bambuterol; 28. Clenisopenterol; 29. Mapenterol; 30. D 11-Mapenterol; 31. Labetalol; 32. Propranolol; 33. Betaxolol; 34. Clenhexerol; 35. Penbutolol; 36. Salmeterol; 37. D 3-Salmeterol.吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留780图2基质匹配的混合标准溶液( 8 0μg / L )的S R M 定量离子提取色谱图中国科学 B 辑: 化学 2009年 第39卷 第8期781表4 β2-受体激动剂及β-阻断剂在猪肉样品中的加标回收实验结果加标水平(5 μg/kg)加标水平(10 μg/kg) 加标水平(20 μg/kg)化合物平均回收率(%, n =6)RSD(%)平均回收率(%, n =6)RSD(%)平均回收率(%, n =6)RSD(%)Metaproterenol 101.3 9.2 70.9 5.3 109.4 7.0Cimaterol 88.6 7.5 91.8 14.6 85.8 13.7Terbutaline 62.3 18.1 95.8 19.1 117.7 3.2Salbutamol 68.0 9.2 107.5 7.7 87.4 4.7Cimbuterol 57.0 8.5 58.2 21.5 93.7 6.0Procaterol 111.5 20.3 102.6 8.2 101.7 10.9Fenoterol 69.8 17.3 79.3 11.3 103.5 16.0 Ritodrine 104.9 9.7 86.3 11.8 100.2 14.1Clencyclohexerol 70.3 12.1 117.8 7.3 112.5 18.7Clenproperol 56.2 11.8 70.9 9.9 81.2 17.2Ractopamine 77.5 14.4 70.5 13.9 86.4 3.9 Clenbuterol 105.8 7.2 85.5 9.8 85.4 6.1Bromchlorbuterol 98.9 17.3 77.7 5.3 88.0 13.3Metoprolol 84.5 7.8 123.7 6.0 99.4 14.2Tulobuterol 51.6 11.3 56.7 11.7 62.3 14.7Formoterol 73.1 11.0 82.8 15.2 84.7 9.6Brombuterol 47.3 8.0 67.3 10.4 79.1 5.0Mabuterol 51.5 17.8 105.4 8.8 100.4 7.1Clenpenterol 53.9 11.0 69.7 8.7 76.2 9.5 Bambuterol 59.6 8.8 118.6 4.8 99.2 9.9Clenisopenterol 51.8 22.4 59.4 14.4 66.5 15.2Mapenterol 47.9 8.5 121.6 6.0 98.4 7.7Labetalol 54.6 9.3 83.3 10.0 76.2 7.7Propranolol 50.5 12.0 81.0 8.6 71.5 7.7Betaxolol 52.0 9.9 122.8 5.5 101.8 6.0Clenhexerol 50.0 20.3 57.2 25.7 59.6 23.0Penbutolol 50.2 14.1 69.0 11.4 66.9 6.3Salmeterol 47.4 23.5 47.3 22.1 52.2 7.7密度良好. 加标回收实验结果表明本方法的精密度和准确度基本良好, 除个别物质外, 基本符合欧盟2002/657/EC [24]对残留检测方法的规定.3.6 实际样品分析利用建立的检测方法, 采集北京地区不同区域、不同市场的猪肉及鸡肉样品进行检测, 只有一例鸡肉样品同时检出克伦特罗(clenbuterol)与莱克多巴胺(ractopamine), 含量分别为2.31和2.17 μg/kg, 未检出其他β2-受体激动剂及β-阻断剂. 其SRM 定量离子提取的色谱图见图 3. 检出率虽然较低, 但暴露出新的问题, 饲料中添加的β2-受体激动剂类药物已由单一添加改为多种药物同时添加, 饲料中单一药物剂量减少, 导致畜禽体内单一药物的蓄积量减少, 而蓄积动物体内的β-兴奋剂类药物种类增多, 造成引起食物中毒的情况并未得到有效缓解, 不同药物的协同毒性可能更甚于单一药物. 因此, 本文建立的灵敏度高, 多组分同时检测的方法, 能够更好的应用于市场动物性食品中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留的监管.吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留782图3 鸡肉样品的SRM定量离子提取色谱图4结论随着克伦特罗与莱克多巴胺在国内外的禁用和监控的加强, 利益的驱使将促进不法分子将其他β2-受体激动剂, 如沙丁胺醇、西玛特洛、溴布特罗等非法添加与动物饲养和饮水中. 除单组分残留测定外, 多组分残留测定方法的建立是β2-受体激动剂残留分析的重要发展方向. 本文建立了HPLC-MS同时检测肌肉中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的分析方法. 该方法简便快速, 可以同时检测23种β2-受体激动剂和5种β-阻断剂药物残留, 具有较高的灵敏度高, 最低检出限均可以达到0.2 μg/kg, 实际样品在 5 μg/kg的加标水平下基本能达到较好的回收率, 更适用于动物性食品中β-兴奋剂的多残留分析检测, 能够更好的应用于市场动物性食品中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留的监管.致谢本工作得到国家自然科学重点基金(批准号：20837003)和“十一·五”国家科技支撑计划(编号：2006BAK02A27, 2006BAK01A02-5)项目资助, 特此一并致谢.参考文献1 Wellenreiter R H, Tonkinson L V. 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Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Centre for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China;2. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, ChinaAbstract: A delicate method has been developed for the simultaneous determination of 23 β2-agonists and 5 β-blockers illegal drugs in muscle tissues by high performance liquid chromatography-linear ion trap mass spec-trometry using isotope dilution technique. The muscle samples are acid hydrolyzed and extracted with 5% tri-chloracetic acid in water, and then cleaned up using MCX solid phase extraction (SPE) cartridge. Methanol and 0.1% formic acid are used as mobile phases for gradient elution, a Waters Atlantis®T3 column is used for separation, and ESI positive ion scan mode is used with selective reaction monitor(SRM). 9 β2-agonists labeled by the deuterium isotope were used as internal standards for quantification. The linear ranges of 23 β2-agonists and 5 β-blockers are 5~200 μg/L, the coefficient of correlation is not less than 0.995, and the limit of detection for each compound in the muscle tissue is below 0.2 μg/kg. The recoveries of each compound in the spiked samples at three levels 5, 10, 20 μg/kg are in the range of 47.3%~123.7%, and the relative standard deviations are in the range of 3.2%~25.7%. The developed method is sensitive and specific for the determination of β2-agonists and β-blockers in pork and chicken muscle samples.Keywords: β2-agonists, β-blockers, muscle, determination, HPLC-ITMS784。
