邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量

邻苯三酚—鲁米诺发光体系测定SOD活性
徐靖;杨秀岑
【期刊名称】《郧阳医学院学报》
【年(卷),期】1999(18)2
【摘要】目的：建立一种测定ＳＯＤ活力的方法。

方法：利用邻苯三酚在碱性条
件下自氧化—鲁米诺化学发光体系测ＳＯＤ活性。

结果：本方法一个活力单位
（抑制５０％发光程度）的ＳＯＤ量为１６ｎｇ／ｍｌ。

本法测定ＳＯＤ浓度范围为５～１５０ｎｇ／ｍｌ，线性回归方程的相关系数：ｒ＝０．９９８。

检测限为１ｎｇ。

重复性：批内Ｃ．Ｖ．＝１．０％，批间（隔７ｄ）Ｃ．Ｖ．＝５．１％。

结论：本法具有简易、灵敏、试剂价廉等优点。

【总页数】3页(P68-70)
【关键词】鲁米诺;超氧化物歧化酶;化学发光;邻苯三酚
【作者】徐靖;杨秀岑
【作者单位】郧阳医学院基础化学教研室;华西医科大学药学院应用化学研究室【正文语种】中文
【中图分类】Q554.903
【相关文献】
1.多酚氧化酶对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的干扰 [J], 荣俊;杨待建
2.鲁米诺、异鲁米诺和邻苯三酚发光效率的比较 [J], 陈玉兰
3.邻苯三酚自氧化法在SOD活性测定中的应用 [J], 贾红玉;王亚森;田晓辉;张伟;杜
建芳;康明;刘建荣
4.邻苯三酚自氧化—化学发光法测定SOD活性 [J], 郭蔼光;王振镒
5.邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择 [J], 孙雪奇;陈齐英;别小琳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

实验三 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定一、 实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种能够专一性清除超氧离子自由基-2O 的金属酶。

它是一种酸性蛋白，对热、pH 和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

SOD 催化下述反应：222222O O H O H +→+-+.。

机体内-2O 过量或不足都会对人体产生危害，SOD 对过量的-2O 及时清除保证-2O 含量的相对平衡。

本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为材料，从中提取SOD 并进行纯化。

该实验SOD 酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，其酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%酶量定义一个酶单位。

样品中蛋白质含量采用考马斯亮蓝250-G 法测定。

考马斯亮蓝250-G 在游离状态下呈粉红色，与蛋白质结合后呈蓝色。

在一定范围内，溶液在595nm 波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围是1-1000ug 。

SOD 同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。

二、试剂与材料[1]试剂：ACD 抗凝剂、0.9%NaCl 、丙酮、05%乙醇、氯仿、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/LEDTA 钠盐溶液、3 mmol/L 邻苯三酚钠溶液、考马斯亮蓝250-G 标准蛋白质溶液、[2]器材：分光光度计、试管、刻度吸管、离心机、烧杯。

三、操作步骤1、SOD 提取[1] 取40ml 新鲜猪血，5000r/m 离心10min ，去上层血浆，取下层红血球粘稠液。

加入2倍体积的0.9%Nacl 溶液清洗，5000r/m 离心10min ，弃上层清液。

[2] 向洗净的红血球中加入适量蒸馏水至15ml ，剧烈搅拌30min ，使其充分溶血。

再向溶血溶液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%的乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，均浆呈红色，再继续搅拌15min ，4000r/m 离心10min ，去变性蛋白质沉淀物，得上层液，留样1ml 。

一、原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。

SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。

SOD催化下述反应：2+2→+。

机体内的过量和不足均对机体不利，SOD 对过量的的及时清除保证了机体内的含量相对的平衡。

机体内的形成可分为生理性和病理性两方面。

在一些正常生理过程中会形成一些。

例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些。

在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的。

过量的如不及时清除，会对细胞损伤。

SOD将歧化为和，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。

2.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。

有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。

3.邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。

本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。

邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，产生，生成有颜色的中间产物。

反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，吸光度值与反应时间能在3～4 min内维持线性关系。

邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性
蔡骏;李颖;尹宗宁
【期刊名称】《华西药学杂志》
【年(卷),期】2005(20)1
【摘要】目的建立超氧化物歧化酶 (SOD)缓释片的活性测定方法。

方法采用邻苯三酚自氧化法。

结果在SOD浓度为 0 .0 6 0～0 . 0 0 6mg·ml-1时线性关系良好(r=0 .9996 ) ;平均空白加样回收率为 10 1 .94 % (n=9)。

结论所用方法简单、快速 ,结果准确。

【总页数】2页(P54-55)
【关键词】缓释片;超氧化物歧化酶(SOD);超氧化物歧化酶;邻苯三酚自氧化法;活性测定;方法;线性关系
【作者】蔡骏;李颖;尹宗宁
【作者单位】四川大学华西药学院
【正文语种】中文
【中图分类】R446.11;Q503
【相关文献】
1.多酚氧化酶对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的干扰 [J], 荣俊;杨待建
2.邻苯三酚自氧化法测定甲烷氧化菌素-铜配合物的超氧化物歧化酶活性 [J], 陈林林;张伟;王振兴;辛嘉英
3.邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究 [J], 许雅娟;赵艳景;胡虹
4.四种邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性方法的比较 [J], 张宏;谭竹钧
5.邻苯三酚自氧化法测定血中超氧化物歧化酶的活性 [J], 赵云斌;刘敏;余忠谊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。

阻止中间物的积累而测定其酶活性。

1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。

(2)UV－754紫外分光光度计。

2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。

在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。

(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。

0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。

蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。

4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。

1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。

1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mgNa2EDTA，混合，稀释到80 mL。

用pH计测量，pH应为7.4。

用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。

（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。

1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。

再往里加连苯三酚14.6 mg (M。

W.126.1 )，即得。

（当天有效,以上为1个样品的用量）。

2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。

超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。

最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。

每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。

第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。

Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。

其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。

在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。

其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。

化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。

邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究摘要：目前超氧化物歧化酶(SOD)活性测定结果混乱，为提高测定结果的可比性, 对邻苯三酚自氧化法测定SOD 活性的方法进行了研究，就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH 及所含的EDTA 量等因素对测定结果的影响进行了探讨，根据实验结果，提出了新的改良方法.超氧化物歧化酶(SOD)是一种特殊的金属酶, 它能催化超氧阴离子自由基(O2—)发生歧化反应, 从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基(O2—), 是生物体重要的细胞防御系统之一, 具有防御氧毒、抗辐射、防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效[1]，超氧化物歧化酶(SOD)这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景,激起了人们广泛的研究热情. 自1969 年McCord 等首次发现具有活性的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase简称SOD) 以来，众多测定SOD的方法已逐步建立起来，其中以化学法最为常用. 经典的邻苯三酚法是Marklund等[2]于1974 年发表的一种通过比色测定SOD 的简便方法. 此后，邻苯三酚法在国内外得以广泛应用. 与其他方法相比，邻苯三酚自氧化法具有操作简便，快速，试剂便宜且用量小，重复性好等优点；但文献报道的邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的测定条件各不相同，这就造成了测定结果的混乱和缺乏可比性. 为此我们对邻苯三酚自氧化法测定SOD 活性的方法进行了研究，就该测活体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH及所含的EDTA 量等因素对测定结果的影响进行了探讨.1 原理在碱性条件下, 邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系. SOD 加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定SOD 活性的理论依据.2 材料与方法（1）2.1 试剂和主要仪器一.试剂0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml 与0.2mol/L HCl44.76ml 混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl 配制成6mmol/L 溶液，存放于冰箱备用; 所用试剂均为国产分析纯; 实验用水为自制双蒸水;二、仪器:721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)操作方法2.2 方法2.2.1 邻苯三酚自氧化速率的测定在试管中按表1加入缓冲液和双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的邻苯三酚(对照管用10mmol/L盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325nm 处每30s 测定一次吸光值A02.2.2 SOD 活力的测定SOD 活性测定法按上述表1 操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量SOD，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述2.2.1 相同，所测吸光度为方法2：一、试剂及其配制:1.pH8.2，100mM三羟甲基氨基甲烷一二甲胂酸钠缓冲液(内含2mM二乙基三氮基五乙酸)。