邻苯三酚自氧化法

河北职业技术师范学院学报　第14卷第2期,2000年6月Journal of Hebei Vocation2Technical Teachers College Vol.14　No.2　J une2000NB T光还原法、邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较(简报)张文军1,葛　超2(1河北职业技术师范学院教务处,昌黎,066600;2河北职业技术师范学院食品工程系)关键词:SOD;酶活性测定方法;NB T光还原法;邻苯三酚自氧化法中图分类号:Q554+16 文献标识码:A 文章编号:1008-9519(2000)02-0068-03超氧化物歧化酶(SOD)是催化O-2歧化反应的酶类,它催化的反应是O-2+O-2+2H+H2O+ O2。

由于O-2是一种极不稳定的氧自由基,因此,检验SOD活性一直采用间接的方法。

笔者针对目前较普遍采用的邻苯三酚自氧化法和NB T光还原法,从灵敏度、精确度、反应特异性三个方面对两方法进行比较,以确定提纯过程中非纯品SOD及纯品SOD两种材料酶活测定的适用方法。

1　材料与方法111　材料纯品牛红细胞SOD、玉米SOD粗提液(自制)、超滤液(超滤膜MW=4000)、透析液(体积分数为014～019的硫铵分步沉淀后)。

本实验所用药品牛红细胞SOD为电泳纯、核黄素(上海化学试剂采购站供应,进口分装),Met(甲硫氨酸)、邻苯三酚为国产分析纯。

112　方法11211　NB T光还原法　根据Stewart和Bewley报导[1],在3mL反应液中含有13×10-3mol甲硫氨酸;75×10-5mol NB T;2×10-6mol核黄素;100×10-9mol ED TA;50×10-3mol磷酸缓冲液(p H 718),在4000lx光下照射15min后,NB T光化还原产物蓝色甲月替在560nm有最大吸收,在此条件下,反应被抑制50%所需酶量为1个活力单位。

邻苯三酚法测定超氧阴离子自由基的清除作用1. 邻苯三酚自氧化改进：1.1 试剂的配制1. pH8.2 50mM Tris-HCl（含EDTA）缓冲液 500mL：称取 3.028g Tris固体溶于250mL蒸馏水中，溶解后加入0.9542mL浓盐酸，加入0.1gEDTA后定溶到500mL，装入棕色瓶备用。

2. HCl配0.1mM 邻苯三酚：称取62.22mg邻苯三酚（即焦性没食子酸），溶于5mL10mM HCl（吸取0.0833mL浓盐酸稀释到100mL），吸出100μL溶于10mL同样的HCl中，装入棕色瓶备用（室温一般保存3天）。

1.2 试验方法按下表取50mM Tris-HCl缓冲液、蒸馏水、多糖，混匀后在25℃水浴保温20分钟，取出后立即加入25℃预热过0.1mM 邻苯三酚（用10mM HCl配），迅速摇匀后倒入比色杯（1cm），325nm下测OD，30秒记录一次数据。

实验重复三次。

抑制率AI（％）＝（A对照－A样品）×100%/A对照。

举例：反应体系Tris-HCl(ml)蒸馏水或者10mMHCl(ml) 多糖(ml)邻苯三酚(ml)空白 2 1 0 0对照 2 0.6 0 0.4处理组1 2 0.5 0.1 0.4处理组2 2 0.4 0.2 0.4处理组3 2 0.3 0.3 0.4处理组4 2 0.2 0.4 0.4处理组5 2 0.1 0.5 0.4注意事项：1．多糖母液浓度最好选在1~2mg/ml2．邻苯三酚一般现用现配，放置一般放3天，3．A325nm/分的读数一般为0.7~1之间，实验系统才比较准确，4．用蒸馏水代替HCl配制邻苯三酚是可以的，只是放置时间不能太长2. 试验结果2.1 虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用从图21和表26实验结果看，虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基有清除作用，且清除作用的大小随多糖浓度增加而增加，表现出一定的线性关系。

分别加入100μL、200μL、300μL、400μL、500μL多糖后，对超氧阴离子的清除率分别为14.167%、34.286%、54.762%、70.592%、85.714%。

1、目的采用邻苯三酚自氧化法测定大蒜不同部位的SOD酶活性2、原理根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（m g∕mL）;每ml 样品中的酶活性单位数（U∕mL）。

酶的纯度越高酶的活性也就越高。

SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。

在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。

利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。

反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。

加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm[1]处测定溶液的吸光度。

酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。

邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加[1,2]。

3、仪器、试剂和材料1)仪器UV-260紫外分光光度计（或其他型号），比色杯，样品管，自氧化管2)试剂和材料a)取培育的大蒜等量的须根，茎，叶；b)所用试剂邻苯三酚、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)、EDTA-2Na、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、30%H2O2、三(羟甲基)氨基甲烷、浓HCl,均为分析提纯。

c)Tris-HCl 缓冲液4、操作步骤4.1SOD粗酶液的提取称取鲜重3.00 g的样品,加入少量预冷的pH=7.8的磷酸缓冲液(含0.1 mmol/L的EDTA、质量浓度为4 %的聚乙烯吡咯酮烷),冰浴研磨.将匀浆液于4 000 r/min下离心20 min.取其上清液,于60℃水浴15 min,待其冷却后,于4 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,将上清液定容到10 mL容量瓶,4℃冰箱中保存备用[3,4]。

邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。

1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。

1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mgNa2EDTA，混合，稀释到80 mL。

用pH计测量，pH应为7.4。

用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。

（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。

1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。

再往里加连苯三酚14.6 mg (M。

W.126.1 )，即得。

（当天有效,以上为1个样品的用量）。

2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。

附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。

因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。

抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。

2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。

三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。

2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。

3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。

4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。

现配现用，4h内有效。

四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。

邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量一、实验原理:邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。

当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。

二、实验试剂：大宝sod蜜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管 8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根这个液体貌似是不能研磨的，而且本身就是酶，正常的生物体内的酶不都是可溶的？研磨是为了破碎细胞的。

我觉得应该是通过加水——打碎胶体，把抗氧化剂全都搞到水中（这个拜托查下）——分液——乙醇-氯仿沉淀（用来鉴别是带Mn还是CuZn）（不知道会不会有另外两种抗氧化剂干扰）——透析（去离子电泳用）乙醇-氯仿的浓度比酶的保存问题：测一下大宝pH应该可以作为参考，但是这个酶种类太多了，要点就是pH至少不能小于6，关于最适合pH是否也要测量？还是说我们是为了测量大宝里面SOD的活性所以就按照大宝的pH保存。

还有一个小小的想法就是。

这部分是1次做完还是两次做完？EDTA二钠：几乎不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。

用于络合金属离子和分离金属。

干扰物，但是没有氧化性三、实验步骤：（1）SOD提取：取大宝sod蜜加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。

(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)（2）除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。

3经验交流3邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择孙雪奇,陈齐英,别小琳(四川省药品检验所,四川成都610034)提要:用岛津UV-240型、260型和T-1901紫外可见分光光度计进行实验,确定邻苯三酚自氧化法测定S OD活性的最适波长非文献使用的420nm和325nm,而应为320nm。

关键词:邻苯三酚自氧化法;S OD活性;波长中图分类号:R917文献标识码:B文章编号:1006-0103(2004)05-0404-02 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,S OD)为体内自由基的清除剂,在生物体的正常代谢中起重要作用,其活性测定常用邻苯三酚自氧化法[1]。

该方法主要是通过测定邻苯三酚自氧化前4min内, S OD对自氧化初始中间产物增加的抑制作用来测定S OD活性。

文献报道的测定波长主要有420nm[1]和325nm[2]。

为探讨初始中间产物的吸收峰位置,进而确定测定波长,特对此进行了研究。

1　实验部分111　仪器与试剂 UV-260和UV-240紫外可见分光光度计(日本岛津公司);T-1901紫外可见分光光度计(上海科学仪器厂)。

试剂均为国产分析纯。

112　方法 吸取4.5ml100mm ol・L-1的T ris-HCl缓冲液(pH812)和4146ml蒸馏水,混匀后置25℃水浴中20min,立即加入在25℃预热的30mm ol・L-1邻苯三酚40μl(10mm ol・L-1的HCl溶液配制),立即混匀,迅速倒入比色池中,以10mm ol・L-1的HCl溶液为空白,分别用上述3种型号的紫外可见分光光度计测定邻苯三酚自氧化中间产物的吸光度。

113　结果 UV-240紫外可见分光光度计测定可知,邻苯三酚自氧化初始中间产物的吸收峰在320～319nm 处。

T-1901和UV-260紫外可见分光光度计两种仪器测得的λmax均出现在320nm波长处,此时在420nm处吸光度还很小,到5min时吸光度<011,可见420nm处吸光度的变化不能反映中间产物的积累,因此,用420nm进行S OD酶活性测定是不正确的。

实验原理 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可见光区最大吸收峰为515 nm[17-20]，当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱。

因此可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力。

其作用原理如图1。

图1 DPPH 自由基清除作用原理Fig. 1 Principle of DPPH free radical scavenging1.2.6 DPPH 自由基清除试验的测定方法将每种供试品溶液分别取20 μL 加样在96 孔板中，再在每个孔中平行加入180 μL DPPH 溶液。

同时设立对照组（等量乙醇代替供试液），空白组（20 μL 乙醇加入180 μL DPPH 溶液）。

轻轻振荡，使充分混匀，将96 孔板放置在避光环境下反应30 min。

药物与自由基反应完全，在波长515 nm 处测定，记录最终吸光度（A）值。

自由基清除率D=（A 对照组−A 样品组）/（A 对照组−A 空白）式中A 样品组为加入测试样品后反应液的吸光度；A 对照组为对照组未加药的吸光度；A 空白为空白组的吸光度。

为了减小实验误差，每样品设6 复孔，6 复孔取平均值。

DPPH·(二苯代苦味酞自由基)在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其孤对电子在sl7nm附近有强吸收(显深紫色)。

当有机清除剂存在时,孤对电子被配对,吸收消失或减弱,通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除剂的活性。

DPPH·法用以评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速(反应时间仅需20min左右)、简便、灵敏可行的方法。

原理:DPPH·(二苯带苦基麟基自由基)是一个大分子的稳定自由基抗氧化剂预期作用模式为:AH十DPPH·~DPPH一H十A·依据DPPH·具有单电子,在517nm处有一强吸收(深紫色),当自由基清除剂与其单电子配对使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系,因而可用分光光度法进行定量分析[91。