SOD活力测定法(连苯三酚自氧化法)-操作图解

超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂）操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。

1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。

1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。

用pH计测量，pH应为7.4。

用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。

（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。

1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。

再往里加连苯三酚14.6 mg (M。

W.126.1 )，即得。

（当天有效,以上为1个样品的用量）。

2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。

（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。

由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。

此时的ΔA为ΔA0。

3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。

摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。

跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。

实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。

一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。

分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。

在微生物中主存于需氧菌。

SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。

自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。

二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

SOD作为治因而受到医药界的关注。

目前中国国内已进入临床试验阶段。

本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。

SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。

阻止中间物的积累而测定其酶活性。

1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。

(2)UV－754紫外分光光度计。

2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。

在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。

(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。

0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。

蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。

4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。

最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。

每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。

第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。

Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。

其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。

在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。

其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。

化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。

1、目的采用邻苯三酚自氧化法测定大蒜不同部位的SOD酶活性2、原理根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（m g∕mL）;每ml 样品中的酶活性单位数（U∕mL）。

酶的纯度越高酶的活性也就越高。

SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。

在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。

利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。

反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。

加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm[1]处测定溶液的吸光度。

酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。

邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加[1,2]。

3、仪器、试剂和材料1)仪器UV-260紫外分光光度计（或其他型号），比色杯，样品管，自氧化管2)试剂和材料a)取培育的大蒜等量的须根，茎，叶；b)所用试剂邻苯三酚、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)、EDTA-2Na、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、30%H2O2、三(羟甲基)氨基甲烷、浓HCl,均为分析提纯。

c)Tris-HCl 缓冲液4、操作步骤4.1SOD粗酶液的提取称取鲜重3.00 g的样品,加入少量预冷的pH=7.8的磷酸缓冲液(含0.1 mmol/L的EDTA、质量浓度为4 %的聚乙烯吡咯酮烷),冰浴研磨.将匀浆液于4 000 r/min下离心20 min.取其上清液,于60℃水浴15 min,待其冷却后,于4 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,将上清液定容到10 mL容量瓶,4℃冰箱中保存备用[3,4]。

万方数据邻苯三酚自氧化法测定SOD活性作者：李永利， 张焱作者单位：河南省卫生防疫站,郑州,450003刊名：中国卫生检验杂志英文刊名：CHINESE JOURNAL OF HEALTH LABORATORY TECHNOLOGY年，卷(期)：2000,10(6)被引用次数：33次1.戴有盛食品的生化与营养 19942.胡学智;张惠荪酶法食品分析 19801.王文博.孙建光.徐晶螺旋藻产品活性物质检测与免疫功能研究[期刊论文]-中国食品卫生杂志 2011(1)2.赵文宝.张珍.郭建华.金晶牦牛血中超氧化物歧化酶提取工艺研究[期刊论文]-甘肃农业大学学报 2010(1)3.陈世彪.李莉.李海涛柑橘黄酮体外清除活性氧自由基作用的研究[期刊论文]-安徽农业科学 2010(9)4.徐玲玲.张均平.邵邻相.张耀斌.毕洁琼.巩菊芳大豆磷脂对老龄大鼠学习记忆及抗氧化能力的影响[期刊论文]-浙江师范大学学报（自然科学版） 2010(2)5.李志明.陈青.金启安.唐超.温海波.彭正强高温对椰心叶甲啮小蜂保护酶系活性的影响[期刊论文]-热带作物学报 2010(6)6.万军.黄国钧.周霞邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中检测波长的优化[期刊论文]-安徽农业科学 2010(14)7.张瑞东.迟玉杰.陈晨.阮长青蛋清蛋白酶解物抗氧化与血管紧张素转换酶抑制活性的研究[期刊论文]-营养学报2010(4)8.武夷岩茶茶多酚的体外抗氧化作用[期刊论文]-武夷学院学报 2009(2)9.汪福保.罗莉.张桂众.颜忠.刘本祥Fe、Zn、Cu不同组合对岩原鲤生长、体组成和血清生化指标的影响[期刊论文]-淡水渔业 2009(4)10.原龙.王新.杨平大蒜中超氧化物歧化酶提取工艺的研究[期刊论文]-西安工程大学学报 2009(1)11.印君.尹宗宁超氧化物歧化酶的固定及其活性检测[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2009(7)12.陈晨.迟玉杰.刘丽蛋清的蛋白酶解物清除自由基能力的研究[期刊论文]-营养学报 2009(5)13.苏传福.罗莉.李芹.文华.汪福保硒对草鱼抗氧化功能及组织结构的影响[期刊论文]-西南师范大学学报(自然科学版) 2008(5)14.张贵生镧暴露对鲤鱼脑和肌肉中酶和脂质过氧化水平的影响[期刊论文]-水生生物学报 2008(4)15.张贵生.朱道玉镧长期暴露对鲤鱼的毒性影响研究[期刊论文]-中国饲料 2008(10)16.张贵生稀土元素对鲤鱼肝胰脏多种酶及MDA含量的影响[期刊论文]-生物技术 2008(2)17.张贵生镧对鲤鱼五种组织超氧化物歧化酶同工酶及酶活性的影响[期刊论文]-四川动物 2008(4)18.刘晓红.李向东.刘婷.周帼萍热变性法提纯猪血SOD的工艺优化[期刊论文]-武汉工业学院学报 2008(1)19.张贵生镧对鲤鱼肾和鳃抗氧化性和酯酶同工酶的影响[期刊论文]-生态学杂志 2008(8)20.李书倩.辛广.戴亚东.刘长江白灵菇多糖抗氧化性质的研究[期刊论文]-鞍山师范学院学报 2007(2)21.王学军自组装分子印迹聚合物制备及其水相识别的研究[学位论文]博士 200722.孙桂玲.孟磊.何华红.张相年.赵树进大蒜超氧化物歧化酶分离方法的研究[期刊论文]-中药材 2006(12)23.蔡英卿.赖钟雄.沈金山.陈义挺.李国清.林玉玲.郑文炉余甘子各器官超氧化物歧化酶活性的测定[期刊论文]-热带作物学报 2006(4)24.李鸿梅.郭平.倪鹏.冯永巍.徐力.张学忠玉米蛋白粉制备玉米肽脱脂及水解工艺研究[期刊论文]-吉林农业大学学报 2006(3)25.蔡英卿.赖钟雄.徐丽珠.陈义挺.陈怀宇.庄卫东.林文忠.林玉玲龙眼各营养器官SOD活性的测定分析[期刊论文] -河北林果研究 2006(4)26.耿晓修.丁诗华.孙翰昌.廖品福.张涛六价铬对草鱼肝脏SOD和GSH-Px活力的影响[期刊论文]-西南农业大学学报（自然科学版） 2006(2)27.孙希云.刘宁.陈波.孟宪军马齿苋总黄酮抗氧化性质的研究[期刊论文]-沈阳农业大学学报 2006(1)28.阿祥仁.张鑫生利舒康胶囊对高原地区中老年人氧自由基代谢指标的影响[期刊论文]-中国老年学杂志2005(10)29.大蒜中SOD的提取研究[期刊论文]-化学与生物工程 2005(10)30.侯建平中药黄芪有效成分的抗氧化活性及其对益生菌促生作用的研究[学位论文]硕士 200531.卜春文鹅血中SOD、IgG的提取工艺研究[期刊论文]-食品科技 2004(5)32.陈田飞.吴大洋.李春峰家蚕冷冻精液超氧化物歧化酶(SOD)活性分析[期刊论文]-蚕学通讯 2004(4)33.侯振建.王帅领.余军锁活性花粉酒的研制[期刊论文]-酿酒 2004(3)34.王文博.孙建光.徐晶螺旋藻产品活性物质检测与免疫功能研究[期刊论文]-中国食品卫生杂志 2011(1)本文链接：/Periodical_zgwsjyzz200006016.aspx。

改进的连苯三酚法：一种适用于所有抗氧化剂超氧自由基（•O2-）清除试验（适用于SOD）【名词辨析】•O2-：该微粒既含有一个成单的电子，所以，可以属于自由基，又带一个单位负电荷，也属于阴离子。

所以，可以称为“超氧自由基”、“过氧自由基”、“过氧阴离子自由基”、“过氧阴离子”、“超氧阴离子自由基”、“超氧阴离子”。

SOD：过氧化物歧化酶，使过氧自由基发生岐化反应，而清除之。

连苯三酚：有些文献也称为“邻苯三酚”。

但邻苯三酚是不准确的名称。

因为分子含有三个取代基，应当称为“连”。

【操作示意图】操作示意图[1]操作示意图的说明：最初的连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）法是专门为超氧化物歧化酶开发的，现在广泛用于测量其他抗氧化剂的超氧化物清除。

然而，强烈的pH影响被忽略了。

在本研究中，首次系统地研究了影响因素，大量实验证明pH值至关重要。

由于主要抗氧化剂含有羧酸、酯或内酯基团，pH 8.2应改为生理pH 7.4。

改进的程序如下。

将连苯三酚溶液（在1 M HCl中）与pH 7.4的Tris-HCl溶液充分混合；在37°C下每隔30秒测量一次A325nm值，持续5分钟。

由于ΔA325nm，控制值反映基质•O2-的初始浓度−, 应妥善控制，以保证方法的准确性。

改进的连苯三酚法是一种可靠且廉价的超氧自由基清除试验，适用于所有类型的抗氧化剂。

用石英比色皿，不能用玻璃比色皿，因为玻璃比色皿在325nm处有吸收。

【详细介绍】[1]有几种方法可以测定食品的超氧阴离子交换活性，包括细胞色素还原、硝基四氮唑蓝（NBT）、电子自旋共振（ESR）、化学发光、荧光和高效液相色谱。

所有这些方法都需要特殊且昂贵的仪器或生物试剂。

连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）自氧化法相对便宜。

它最初由Marklund 专门为超氧化物歧化酶（SOD）而设计，而不是为其他抗氧化剂而设计。

近几十年来，由于其方便性，它还被用于测定其他抗氧化剂，如多酚、酚酸、单宁、黄酮、花青素、蒽醌、多糖，甚至各种营养添加剂和提取物。