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实验报告课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________实验名称：蔗糖酶分离纯化产物的SDS －PAGE 检测分析及蛋白质相对分子质量测定 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的基本原理和操作方法2、蔗糖酶分离纯化产物的SDS －PAGE 检测分析3、学习测定蛋白质相对分子质量(Mr)的方法二、实验内容和原理（1）实验内容1、SDS －PAGE 凝胶制作；2、蔗糖酶分离纯化产物的SDS －PAGE 电泳分离；3、洗脱测定并计算相对分子质量。
（2）实验原理 1、电泳是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即向着与其电荷相反的电极移动的现象。
2、电泳法分离、检测蛋白质混合样品主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所产生的电泳迁移率的差别。
3、区带电泳是样品物质在一惰性支持物上进行电泳,因电泳后，样品不同组分形成带状区间，故称区带电泳。
4、聚丙烯酰胺凝胶（PAG)由丙烯酰胺和交联试剂N,N ’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在有催化剂（如过硫酸铵或核黄素）和增速剂（如N,N,N ’,N ’-四甲基乙二胺，TEMED ）的情况下聚合而成的。
专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡学号： 3130100246 日期： 2015.6.2 地点： 生物实验中心310装订线5、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，这主要是由蛋白质样品所带的电荷和分子质量的差异性进行分离；在电泳过程中仍保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性。
6、聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为⑴连续系统凝胶缓冲液的pH值及凝胶浓度不变。
浙大生化实验报告氨基转换反应实验目的：1. 了解尿素循环和氨基酸代谢的概念。
2. 掌握氨基转换反应的基本原理和方法。
3. 熟悉氨基转换反应的实验步骤和操作技巧。
实验原理：氨基转换反应是将氨基酸中的氨基转化为尿素排除体外的过程。
氨基酸进入肝脏后，通过转氨酶作用，将其氨基转移至α-酮酸中，生成相应的α-氨基酸。
肝细胞内存在尿素循环，即氨酸通过一系列酶的作用，转化为尿素，最后排出体外。
这一过程中，合成尿素的酶有五种，其中肝素合成酶（OTC）是尿素循环的速率限制酶。
在氨基转换反应中，尿素循环起到了重要的作用，通过测定血中尿素和谷草转氨酶（AST）的活性，可以判断肝脏的状态和氨基酸代谢状况。
实验步骤：1. 取适量的血清置于试管中，记录试管编号。
2. 分别在不同的试管中加入不同的试剂：试管A：加入5μl生理盐水。
试管B：加入2μl L-谷氨酰胺。
3. 在每个试管中加入10μl 的反应液，混匀后放置于37℃水浴中反应1小时。
4. 在每个试管中加入40μl 的去离子水，混匀后加入2ml 三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白质。
5. 试管中的混合液混匀后，离心5min，将上清液转移到新的试管中，加入40μl 的1.5%四氯化碳（TCB）、200μl 1%吲哚丙酮、200μl 2.5%氨水，混匀后放置于室温下反应10min。
6. 在每个试管中加入2ml 甲醇，混匀后离心5min。
7. 将上清液转移到新的试管中，加入1ml 1.5%四氯化碳（TCB）。
8. 在每个试管中加入等量的去离子水，混匀后放入比色皿中，使用比色计测定各试管中产生的7-羟-库欣胆酸的吸收值。
实验结果：试管编号反应液产生的7-羟-库欣胆酸吸收值A 生理盐水 X实验分析：通过测定各试管中产生的7-羟-库欣胆酸吸收值，可以判断氨基转换反应的情况，以及肝脏的状态和氨基酸代谢状况。
通过比较试管B和试管C的吸收值，可以得出氨基酸代谢是否正常。
如果试管B的吸收值比试管C高，则说明肝脏合成尿素的能力正常，代谢氨基酸的能力也正常。
第一章测试1.用50ml离心管离心样品时，错误操作是（）。
A:离心前样品配平B:离心前若离心机内壁悬挂水珠，需擦拭干净C:当分离效果达不到预期时可适当提高离心力。
D:离心管中样品尽量装满答案:D2.可见分光光度计错误操作是（）A:测试前比色皿用擦镜纸擦净外壁B:使用前调0%TC:用空白溶液调100%TD:使用石英比色皿答案:D3.有关移液器操作正确的是（）。
A:吸头内有液体时不可平放或倒置移液器B:吸液完成后需要在液面下方稍停留1~2秒，防止吸入气泡C:吸取普通溶液时（正向移液），按压操作按钮至第2深停点D:吸取普通溶液时（正向移液），按压操作按钮至第1浅停点答案:ABD4.有关缓冲体系，下面说法正确的是（）A:稳定的pH值有利于维持蛋白质和酶的立体结构B:缓冲液浓度越高越好C:可以稳定氢离子浓度D:缓冲液浓度越低越好答案:AC5.适用于酶标仪的只有透明塑料微孔板（）A:对B:错答案:B第二章测试1.【2.1】亲和层析根据蛋白质的什么性质进行分离（）。
A:电荷B:亲和性C:分子量大小D:分子形状答案:B2.【2.1】阴离子交换剂本身（）A:不带电B:是两性离子C:带负电荷D:带正电荷答案:D3.【2.1】按照分子大小进行蛋白质分离的技术有：（）A:超滤B:亲和色谱C:离子交换色谱D:凝胶排阻色谱答案:AD4.【2.1】下列哪种色谱技术对蛋白质样品具有浓缩作用。
（）A:离子交换色谱B:反相色谱C:亲和色谱D:分子筛色谱答案:ABC5.【2.1】离子交换层析和分子筛层析流速越大，分辨率越高。
（）A:对B:错答案:B6.【2.2】SDS-PAGE测定的是（）A:蛋白质糖基化B:寡聚蛋白分子量C:亚基分子量D:蛋白质等电点答案:C7.【2.2】westernblot 是（）A:通过一抗/二抗复合物对膜上的目标蛋白进行特异性检测的方法B:蛋白质等电点检测方法C:对蛋白质活性进行检测的方法D:对蛋白质进行分离的方法答案:A8.【2.2】蛋白质凝胶染色方法有 ( )A:金属离子负染B:有机试剂染色C:银染D:荧光染料染色答案:ABCD9.【2.2】琼脂糖凝胶的浓度越高，孔径越小，DNA条带的分辨率越低。
酵母蔗糖酶的制备原理一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：缓冲液抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，DEAE-Sepharose柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：㈡、离子交换DEAE-Sepharose柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE 纤维素（二乙胺基乙基-纤维素）、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具有如下特点：可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
选择性：离子所带的电荷越多，水合离子半径越小越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交 换剂结合方向进行。
酵母蔗糖酶的制备原理
一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介
蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化
本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，离子交换柱层析分离纯化。
前三步分离纯化的原理如下：
甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质
酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等
研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等
取中层50℃水浴中上清：蔗糖酶、可溶性糖等
（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白
取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等
冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等
三、蔗糖酶活力的测定原理
蔗糖酶
蔗糖葡萄糖+ 果糖(G和F都具半缩醛羟基，该半缩醛羟基可被pH4.5~5.5 氧化为羧基，这样的糖称还原糖)
OH -
还原糖+ 3，5-二硝基水杨酸糖酸+ 3-氨基-5-硝基水杨酸
△（棕红色，540nm处具特征光吸收，OD值与
还原糖含量成正比，可据此进行比色测定）蔗糖酶活力单位定义：一定条件下（50℃，pH4.6），一分钟内能产生1mg 还原糖的酶量。
有不舒服记得找医生，千万不要小不舒服酿成大问题。
诚信考试沉着应考杜绝违纪浙江大学2008__ –2009 学年春夏学期《医学生物化学实验》课程期末考试试卷A
开课学院：医学院，考试形式：闭卷，允许带___________入场
考试时间： 09 年 6 月 23 日,所需时间：120 分钟
考生姓名： _____学号：专业： ______考生承诺：“我确认本次考试是完全通过自己的努力完成的。
”
一填空题（每格3分，共60分）
1、实验中常用的浓缩方法有：、、等方法
2、核酸的含量可用和法来测定。
蛋白质提取纯化中
防止变性的基本防范措施是__________________及__________________ 。
3、脂薄层层析中通常用作为支持剂，
用作显色剂
4、凝胶层析法基本原理是，
纸层析法一般以为固定相，
以为流动相。
5、亲和层析是的一种层析技术。
固定相由和共价结合构
亲和层析洗脱方法分和两种方法。
6、电泳是指，聚丙烯酰胺凝胶电
泳具有较高分辨率其原理是具有、、
、等效应。
二、问答题（共40分每题20分）
1、简述真核生物基因组DNA提取纯化的基本原理和基本操作过程。
2、简述两种常用的蛋白质含量测定的方法原理和特点。
