柱前和柱后衍生高效液相色谱分析氨基酸方法进展与评述

高效液相色谱柱前衍生化法测定不同产地灵芝中氨基酸的含量朱龙平1苗慧1陈建文1（1.中山大学药学院，广东广州5100062.）摘要：有关灵芝中氨基酸含量测定的报道相对较少，且大多数都是用氨基酸分析仪来测定。

本方法用异硫氰酸苯酯为衍生化试剂，处理灵芝样品后用高效液相色谱法测定了不同产地灵芝中六种氨基酸的含量，方法简便可靠，适用于灵芝中氨基酸含量的测定。

关键词：灵芝，高效液相色谱法，柱前衍生化，氨基酸灵芝又称灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝（G．lucidum·karst）和紫芝（G．japonicrn L loyd）的总称。

灵芝作为拥有数千年药用历史的中国传统珍惜药材，具备很高的药用价值，现代药理学研究证实，灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。

市面上灵芝类保健品种类繁多，目前国内的每年销售额约十几亿元人民币。

笔者对无限极（中国）公司提供的不同产生的灵芝样品中氨基酸含量进行分析，为更好的利用灵芝提供一些参考。

1实验部分1.1仪器：岛津LC-20A高效液相色谱仪，梅特勒AG285分析天平。

1.2试药灵芝，无限极（中国）有限公司提供，产地如下：经中山大学药学院生药学教研室杨得坡教授鉴定为多孔菌科灵芝属真菌紫芝（G．japonicrn L loyd）。

，氨基酸对照品门冬氨酸，谷氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸。

色谱纯乙腈（百灵威），异硫氰酸苯酯（阿拉丁），三乙胺，正己烷等均为分析纯，高纯水实验室自制。

2.实验方法与结果2.1色谱条件色谱柱为venusil Mp柱（250mm×4.6mm，5u m），流动相A为0.1mol/L醋酸钠溶液-乙腈（93:7），流动相B为乙腈-水（8:2）流速为1ml/min梯度洗脱，柱温箱40℃，进样体积2uL，检测波长254nm。

洗脱梯度见表1表1流动相洗脱梯度t（min）A（%）B（%）0 100 013 93 723 77 2329 65 3535 60 4040 0 10045 0 10047 100 02.2对照品溶液分别精密称取缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等对照品约6.0mg，置5ml容量瓶中用纯水稀释并定容至刻度。

·药物研发·
柱前衍生高效液相色谱法测定
血管紧张素的氨基酸组成
丁金国 * 李晓倩 黄臻辉 （上海上药第一生化药业有限公司 上海 200240）
摘 要 目的 ：建立一种测定血管紧张素氨基酸组成的柱前衍生高效液相色谱法。方法 ：血管紧张素经酸水解产
生的游离氨基酸，用 AQC 衍生后，以醋酸钠溶液和乙腈作为流动相，流速为 1.0 ml/min，经 AccQ·Tag 色谱柱梯度洗
1 材料和方法
1.1 材料
血管紧张素（自制）；混合氨基酸标准溶液（各氨基 酸含量除 Cys 为 1.25 mmol/ml 外，余均为 2.5 mmol/ml）、 AccQ·Tag 色谱流动相 A、B 和衍生试剂盒（包括 AQC 衍生试剂粉末及稀释剂、硼酸缓冲）均购自 Waters 科 技有限公司。
脱，于波长 254 nm 处测定。通过外标法计算样品中氨基酸组成。结果 ：His、Arg、Pro、Tyr、Val、Phe 在浓度范围
0.02~1.00 mmol/ml 内与峰面积呈良好的线性关系，Asp 在 0.02~0.75 mmol/ml 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。结论：
本实验建立的分析方法分离效果较好，可用于血管紧张素氨基酸组成测定和肽含量测定。
with precolumn derivation
DING Jinguo*, LI Xiaoqian, HUANG Zhenhui (SPH NO.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 200240, China)
ABSTRACT Objective: To establish an HPLC method with precolumn derivation to determine amino acid composition and peptide content of angiotensin amide. Methods: The free amino acids were derivatized with AQC after angiotensin amide was hydrolyzed by hydrochloric acid. The derivatives were eluted by gradient solutions composed of sodium acetate solution and acetonitrile on HPLC at flow rate of 1.0 ml/min and detective wavelength of 254 nm. The contents of amino acids in angiotensin amide were calculated based on external standard. Results: The standard curves were linear over the concentration range of 0.02~1.00 mmol/ml for His, Arg, Pro, Tyr, Val, and 0.02~0.75 mmol/ml for Asp. Conclusion: The method is suitable for the analysis of amino acid composition and peptide content of angiotensin amide.

１．２．２氨基酸ＨＰＬＣ分析方法的分类
氨基酸ＨＰＬＣ分析，按是否衍生可分为两大类：一类是直接分析法；另一类是衍 生化间接分析法刚。
１．２．２．１直接分析法
近年来，氨基酸直接分析法得到迅速发展，基于离子交换色谱的氨基酸分析仪己 成为直接分析法的主流，戴安公司上世纪推出的氨基酸ＡＡＡ－ＤｉｒｅｃｔｌＭ系统就是此种 方法的代表，采用高效阴离子交换色谱积分脉冲安培捡Ｎ法（ＨＰＡＥＣ．ＩＰＡＤ）。此法可 同时对一级和二级氨基酸进行检测，无需柱前、后衍生，直接进样；分离效果好、灵 敏度高、操作简单。但此类氨基酸分析仪专属性强，价格昂贵，大大限制其推广与应 用【２１２２１。
综上不难看出，氨基酸与人类生活密切相关。
１．２氨基酸ＦＩＰＬＣ分析
由于氨基酸对人类生活的重要性，氨基酸分析也一直是分析领域研究的重要课题 之一．
１．２．１氨基酸分析的发展
１９５４年，Ｈｉｔｓ、Ｍｏｏｒ、Ｓ画ｎ【６川较早提出采用磺酸盐离子交换树脂分析氨基酸， 并在此后几年将此项技术进一步发展；１９５８年，Ｓｐａｃｋｍａｎ、Ｍｏｏｒ、Ｓｔｅｉｎ合作嘲研制 出世界上第一台用离子交换树脂和柱后茚三酮衍生检测法的自动氨基酸分析仪，使氨 基酸定量分析进入一个崭新的阶段。２０世纪６０至８０年代，氨基酸分析的速度、灵 敏度、自动化程度均大大提高［９－１４１。２０世纪８０年代中后期，柱前衍生ＨＰＬＣ方法已 逐渐占据主导地位ｎ习。其中，激光诱导荧光检测器在ＨＰＬＣ中的应用，使检测灵敏 度提高到一个新的台阶【１６１。２０世纪９０年代戴安公司开发了ＡＡＡ－Ｄｉｒｅｅｔ ＴＭ氨基酸分 析系统，采用积分脉冲安培检测器直接检测。近年来，质谱、核磁与ＨＰＬＣ联用技术 引入氨基酸分析，大大提高了定性分析的准确性１１７－１９１。
１．１．２．４从营养学角度分类

避光， 于 &# C 水浴保温 ) - ， 放 冷， 加平衡溶液至刻 度， 放置 )$ /)* 后备测定。 ! ! &" 标准曲线的绘制 ! ! 取 “)4 !” 节衍生化的样品分别进样 )# " & ， 测得 （ ";） 做线 性回 归， 峰面积。以峰面积 " 对进样量 # 得精氨酸和脯氨 酸 线 性 回 归 方 程 分 别 为 " $ & % )$"
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生物有机化学氨基酸的分析方法综述A Review on Amino acid Analysis Methods摘要:氨基酸电分析研究是生命科学中令人关注的课题。

本文就各种氨基酸的分析化学研究的最新进展进行了综述。

关键词:氨基酸分析方法综述Abstract：The analysis methods of amino acids are very important in ream of industry, agriculture and life science. Inthis paper，the analysis methods of amino acid are reviewed，with focus on chemistry method, spectrophotometry method, chromatography method and electrochemistry method.Key words: amino acids;analysis;review1 前言氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。

作为小分子,氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。

各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能,如生物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系,L 一半胱氨酸能增强生物体的抗病能力,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。

目前,对氨基酸的分析测定多采用离了交换色谱( IEC) [1]、高效液相色谱(HPLC) [2] 或气相色谱(GC) [3]等仪器,这些仪器所用的检测器包括紫外可见光谱吸收、荧光、化学发光等。

然而,由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱, 自身又无荧光,因此不能直接检测。

通常需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性。

电化学方法以其简单、灵敏、无放射、无污染等特点越来越受到人们的关注。

物， 影响各 组分 的分 离和保 留 时问 。 ２ ． １ ． ２ 温 度 的影响 精密 移取样 品 ， 加入 １ ． ０ ｍＬ衍生 溶液 ， 分别 在 ４ Ｏ ℃、 ５ Ｏ ℃、 ６ Ｏ ℃、 ７ ０ ℃、 ８ Ｏ ℃衍 生 ， 结
果表 明 ， 温 度 的升高有 利于 样 品衍 生完 全 ， 但 过 高会增 加副 产物 ， 以６ Ｏ ｜ Ｃ为最 佳 。
小儿 复 方氨基 酸 注射 液是 一种 含 有 较 高 浓 度 的小 儿 必 需 氨基 酸 的 产 品 。根 据 小 儿肝 酶 系统 的特 殊 性， 增 加 了酪 氨酸 含量 ， 含 有一 定量 的胱 氨 酸及 与ｆ ｌ ， Ｊ Ｌ 生 长 发育 关 系密 切 的牛磺 酸 。复方 氨基 酸 注射 液可
效评 价其 质量 提供 依据 。
１ 实 验 ｅ ｒ ｓ ５ １ ５二 元高 压 高效 液相 色谱 仪 ， 配备 ２ ９ ９ ６二 极 管 阵列 检 测 器 ， Ｐ Ｃ Ｍ 泵 控制 器 ， Ｅ ｍｐ ｏ ｗｅ ｒ 工 作
软件 ， 柱 温箱 ， ７ ７ ２ ５ ｉ 手动 进样 器 （ ２ Ｏ Ｉ 定量 环 ） 。
过滤 ， 得供试 品溶 液 。另取 １ ４种 氨基 酸标准 品适 量 ， 精 密 称定 ， 配 成 与供 试 品 溶 液浓 度 相 当 的溶 液 ， 以相
同方 法衍生 ， 作为 对照 品溶 液 。
取 对照 品溶液 和供试 品溶液各 ２ Ｏ Ｌ ， 分 别注 入液 相色谱 仪测 定 ， 按外标 法 以峰 面积计 算含 量 。
表 １ 流 动相 梯 度 洗 脱 程 序
Ｔａｂ ｌ ｅ １ Ｇｒ ａ ｄｉ ｅ ｎ ｔ ｅ ｌ ｕｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｂｉ ｌ ｅ ｐｈ ａ ｓ ｅ

㊀基金项目:山东省重点研发计划(Ｎｏ.２０１８ＧＳＦ１１８１３２)㊀作者简介:邓红英ꎬ女ꎬ研究方向:药学ꎬＥ－ｍａｉｌ:８４２６７１９７３＠ｑｑ.ｃｏｍ㊀通信作者:李永贵ꎬ男ꎬ高级工程师ꎬ研究方向:新药研发ꎬＴｅｌ:１３５０５４０２３９０ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｙｇ－１２３０＠１６３.ｃｏｍ柱前衍生高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量邓红英１ꎬ张永文２ꎬ李永贵３ꎬ４(１.山东大学齐鲁医院药品调剂科ꎬ山东济南２５００１２ꎻ２.济南市中心医院药剂科ꎬ山东济南２５００１４ꎻ３.山东省药学科学院ꎬ山东省化学药物重点实验室ꎬ山东济南２５０１０１ꎻ４.山东省药学科学院ꎬ山东省医用高分子材料重点实验室ꎬ山东济南２５０１０１)摘要:目的㊀建立以２ꎬ４－二硝基氟苯为衍生化试剂ꎬ高效液相色谱法(ＨＰＬＣ)测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中各氨基酸含量的方法ꎮ方法㊀采用ＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８色谱柱ꎬ乙腈－水(６０ʒ４０)为流动相Ａꎬ乙腈－磷酸盐缓冲液(９ʒ９１)流动相Ｂꎬ梯度洗脱ꎬ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ检测波长３６０ｎｍꎬ柱温２７ħꎮ结果㊀复方氨基酸注射液中各氨基酸分离度良好ꎬ线性相关系数均大于０.９９８９ꎬ平均回收率均在９８％~１０２％之间ꎬＲＳＤ％均小于２％ꎮ结论㊀本方法可以用于复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中氨基酸检测ꎮ关键词:柱前衍生ꎻ２ꎬ４－二硝基氟苯ꎻ复方氨基酸注射液ꎻ１８ＡＡꎻ含量测定中图分类号:Ｒ９２７.２㊀文献标识码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２０)０１－００２７－００４ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２０.０１.００６ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎＣｏｍｐｏｕｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＩｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＨＰＬＣａｆｔｅｒｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎＤＥＮＧＨｏｎｇｙｉｎｇ１ꎬＺＨＡＮＧＹｏｎｇｗｅｎ２ꎬＬＩＹｏｎｇｇｕｉ３ꎬ４(１.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｉｓｐｅｎｓｉｎｇꎬＱｉｌｕＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎａｎ２５００１２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＪｉｎａｎＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＤｒｕｇꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１０１ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｏｌｙｍｅｒｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＪｉｎａｎ２５０１０１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎ(１８ＡＡ)ｂｙｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ(ＨＰＬＣ)ｗｉｔｈ２ꎬ４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅａｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｒｅａｇｅｎｔ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＡｎＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎｗａｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｗａｔｅｒ(６０ʒ４０)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＡａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ(９ʒ９１)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＢ.Ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ３６０ｎｍａｎｄｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ２７ħ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎｗａｓｇｏｏｄ.Ａｌｌｔｈｅｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｗｅｒｅｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎ０.９９８９.Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｗｅｒｅｂｅｔｗｅｅｎ９８％ａｎｄ１０２％ｗｉｔｈＲＳＤｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ２％.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎ(１８ＡＡ).Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎꎻ２ꎬ４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅꎻＣｏｍｐｏｕｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＩｎｊｅｃｔｉｏｎꎻ１８ＡＡꎻＤｅｔｅｒｍｉ￣ｎａｔｉｏｎ㊀㊀复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)是一种含有合成人体蛋白质所需要的１８种氨基酸与其他辅料配制而成的灭菌水溶液ꎬ临床上主要用于蛋白质摄入不足以及吸收障碍等氨基酸不能满足机体代谢需要患者的治疗ꎬ也常用于改善手术后患者的营养状况[１]ꎮ由于氨基酸具有高极性㊁低挥发性㊁大部分无强发色基团的特性ꎬ因此其分离和检测都较为困难ꎬ目前常用的检测方法有氨基酸分析仪检测法㊁离子色谱法㊁柱前衍生高效液相色谱(ＨＰＬＣ)法等ꎮ方法存在仪器昂贵㊁运行费用高㊁衍生物不稳定且有一定毒性㊁各组分分离效果差㊁样品检测时间长等诸多问题[２－７]ꎮ本研究建立了２ꎬ４－二硝基氟苯作为衍生化试剂[８－９]ꎬ高效液相色谱法检测复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中氨基酸的方法ꎬ该方法分离效果好ꎬ且重现性稳定ꎮ１㊀仪器与试药１.１㊀仪器㊀高效液相色谱仪(ＬＣ－２０ＡＴ型泵㊁ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ型检测器ꎬＬａｂｓｏｌｕｔｉｏｎ液相色谱数据工作站ꎬ日本岛津公司)ꎻＢＴ１２５Ｄ分析天平(Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ)ꎻＰＨＳＪ－３Ｆ精密酸度计(上海雷磁仪器厂)ꎻ超纯水机(艾柯)ꎮ１.２㊀试药㊀门冬氨酸(批号:１４０６９１－２００４０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ谷氨酸(批号:１４０６９０－２０１２０３ꎬ纯度:１００％)ꎻ丝氨酸(批号:１４０６８８－２０１１０２ꎬ纯度:１００％)ꎻ甘氨酸(批号:１４０６８９－２０１６０５ꎬ纯度:１００％)ꎻ苏氨酸(批号:１４０６８２－２０１３０２ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ盐酸精氨酸(批号:１４０７８１－２００８０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ脯氨酸(批号:１４０６７７－２０１５０７ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ丙氨酸(批号:１４０６８０－２０１３０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ缬氨酸(批号:１４０６８１－２０１２０２ꎬ纯度:９９.６％)ꎻ甲硫氨酸(批号:１４０６８４－２０１１０２ꎬ纯度:１００％)ꎻ胱氨酸(批号:１４０６３２－２００５０２ꎬ纯度:９９.３％)ꎻ异亮氨酸(批号:１４０６８３－２０１３０２ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ亮氨酸(批号:１４０６８７－２０１５０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ色氨酸(批号:１４０６８６－２０１３０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ苯丙氨酸(批号:１４０６７６－２００４０５ꎬ纯度:１００％)ꎻ盐酸组氨酸(批号:１４０６９３－２００４０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ盐酸赖氨酸(批号:１４０６７３－２０１５０９ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ酪氨酸(批号:１４０６０９－２０１５１３ꎬ纯度:９９.８％)对照品均购自中国食品药品检定研究院ꎮ复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)(自制中试品ꎬ批号:２０１６０５０１㊁２０１６０５０２㊁２０１６０５０３)ꎻ２ꎬ４－二硝基氟苯(批号:２０１５１２２７１ꎬ纯度:９９.０％ꎬ成都艾科达化学试剂有限公司)ꎻ乙腈为色谱纯ꎻ碳酸氢钠㊁磷酸二氢钾㊁氢氧化钠㊁磷酸为分析纯ꎮ２㊀方法与结果[１０]２.１㊀溶液制备㊀配样溶剂:ｐＨ７.０磷酸盐缓冲液ꎮ混合对照品储备溶液:精密称取氨基酸对照品各适量ꎬ加水溶解ꎬ制成每１ｍＬ中含有门冬氨酸６２.４５μｇ㊁谷氨酸１８.８３μｇ㊁丝氨酸２５.１１μｇ㊁甘氨酸１９０.０２μｇ㊁苏氨酸６２.５０μｇ㊁盐酸精氨酸１２５.０２μｇ㊁脯氨酸２５.０８μｇ㊁丙氨酸５０.０６μｇ㊁缬氨酸８９.９５μｇ㊁甲硫氨酸５６.２５μｇ㊁胱氨酸２.６５μｇ㊁异亮氨酸８８.０５μｇ㊁亮氨酸１２２.１５μｇ㊁色氨酸２２.５０μｇ㊁苯丙氨酸１３３.２０μｇ㊁盐酸组氨酸６２.５２μｇ㊁盐酸赖氨酸１０７.５８μｇ㊁铬氨酸６.３０μｇ的混合溶液ꎮ混合对照溶液:精密量取混合对照品储备溶液２ｍＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入５％碳酸氢钠溶液１ｍＬ与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ摇匀ꎬ置６０ħ水浴ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎮ供试品溶液:精密量取复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)５０μＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入５％碳酸氢钠溶液１ｍＬ与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ摇匀ꎬ置６０ħ水浴中ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎮ空白溶液:按处方称取除氨基酸外的各组分ꎬ加水配成空白对照溶液ꎮ精密量取空白对照溶液５０μＬ至１０ｍＬ量瓶中ꎬ照供试品溶液配制方法配制成空白溶液ꎮ２.２㊀色谱条件㊀色谱柱:ＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎬ流动相Ａ为乙腈－水(６０ʒ４０)ꎬ流动相Ｂ为乙腈－磷酸盐缓冲液(０.０１４ｍｏｌ Ｌ－１的磷酸盐缓冲液ｐＨ８.２)(９ʒ９１)ꎻ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎻ柱温２７ħꎬ检测波长:３６０ｎｍꎻ进样体积１０μＬꎮ梯度程序见表１ꎮ表１　梯度洗脱程序表时间/ｍｉｎ流动相Ａ(％)流动相Ｂ(％)００１００２１５８５１２２４７６１４３１６９３２４１５９４０８０２０２.３㊀专属性试验㊀分别取 ２.１ 项下混合对照品溶液㊁供试品溶液及空白溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎮ记录色谱图及峰面积ꎮ试验结果表明ꎬ在本检测条件下ꎬ空白溶液对氨基酸检测无干扰ꎬ且１８种氨基酸分离良好(见图１)ꎮ２.４㊀定量限与检测限㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照溶液ꎬ加配样溶剂稀释ꎬ制成不同浓度梯度的溶液ꎬ按上述色谱条件进行测定ꎬ分别取各溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图ꎮ计算各氨基酸的定量限与检测限ꎮ２.５㊀线性试验㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照品储备溶液１㊁１.５㊁２㊁２.５㊁３ｍＬꎬ分别置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入对应比例的５％碳酸氢钠溶液与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液ꎬ摇匀ꎬ分别置６０ħ水浴ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为线性试验溶液ꎬ分别取上述各溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图及峰面积ꎬ以浓度Ｃ为横坐标ꎬ峰面积Ａ为纵坐标做线性回归ꎬ求得线性方程及相关系数ꎬ结果见表２ꎮ２.６㊀精密度试验㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照溶液１０μＬꎬ注入液相色谱仪ꎬ连续进样６次ꎬ记录色谱图ꎬ计算ＲＳＤꎬ结果各氨基酸峰面积ＲＳＤ均小于２％ꎬ表明仪器精密度良好ꎮ２.７㊀溶液稳定性试验㊀取 ２.１ 项下混合对照溶液ꎬ分别于０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１２㊁２４ｈ精密量取１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图ꎬ计算ＲＳＤꎬ结果各氨基酸峰面积ＲＳＤ均小于２％ꎬ说明混合对照品溶液２４ｈ内稳定ꎮ２.８㊀回收率试验㊀精密量取空白基质５０μＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ分别加入１８种氨基酸对照品适量(约相当于处方量的８０％㊁１００％㊁１２０％)ꎬ照 ２.１ 项下供试品配制方法配制成回收率试验溶液ꎬ平行配制３份ꎮ依法测定ꎬ计算平均回收率及ＲＳＤꎬ结果见表３ꎮ㊀Ａ.空白溶液ꎻＢ.混合对照品溶液ꎻＣ.供试品溶液㊀１.门冬氨酸ꎻ２.谷氨酸ꎻ３.丝氨酸ꎻ４.甘氨酸ꎻ５.苏氨酸ꎻ６.盐酸精氨酸ꎻ７.脯氨酸ꎻ８.丙氨酸ꎻ９.缬氨酸ꎻ１０.甲硫氨酸ꎻ１１.胱氨酸ꎻ１２.异亮氨酸ꎻ１３.亮氨酸ꎻ１４.色氨酸ꎻ１５.苯丙氨酸ꎻ１６.盐酸组氨酸ꎻ１７.盐酸赖氨酸ꎻ１８.酪氨酸图１㊀ＨＰＬＣ图谱表２㊀各氨基酸组分线性方程㊁相关系数㊁线性范围㊁定量限与检测限名称线性方程相关系数线性范围/μｇ ｍＬ－１定量限/ｎｇ(Ｓ/Ｎʈ３)检测限/ｎｇ(Ｓ/Ｎʈ１０)门冬氨酸Ａ＝６９７７０Ｃ＋４７４０６０.９９９５６.２４５０~１８.７３５００.１２０.０４谷氨酸Ａ＝５７０５５Ｃ＋１１９２００.９９９２１.８８３０~５.６４９００.０９０.０４丝氨酸Ａ＝８７２１４Ｃ＋１３２０４０.９９９２２.５１１０~７.５３３００.０５０.０２甘氨酸Ａ＝１２４６０２Ｃ＋１７９５６８０.９９９６１９.００２０~５７.００６００.１３０.０３苏氨酸Ａ＝８２４５８Ｃ＋５４４３００.９９９６６.２５００~１８.７５０００.１３０.０４盐酸精氨酸Ａ＝４４７０８Ｃ＋５５２７００.９９９２１２.５０２０~３７.５０６００.２５０.０９脯氨酸Ａ＝６０９７５Ｃ＋１７５３５０.９９９４２.５０８０~７.５２４００.１３０.０５丙氨酸Ａ＝１０４７８０Ｃ＋５６３７７０.９９９４５.００６０~１５.０１８００.１００.０４缬氨酸Ａ＝５８３１４Ｃ＋５６３７７０.９９９４８.９９５０~２６.９８５００.１８０.０６甲硫氨酸Ａ＝６３８０３Ｃ＋３４２８７０.９９９２５.６２５０~１６.８７５００.２８０.１１胱氨酸Ａ＝１ˑ１０６Ｃ＋３４２８７０.９９９２０.２６５０~０.７９５００.１５０.０６异亮氨酸Ａ＝７２２６１Ｃ＋６６２９６０.９９９３８.８０５０~２６.４１５００.１８０.０６亮氨酸Ａ＝７１２５６Ｃ＋８９５９５０.９９９３１２.２１５０~３６.６４５００.２５０.０９色氨酸Ａ＝３４７７８Ｃ＋９０５１.７０.９９９１２.２５００~６.７５０００.３５０.１２苯丙氨酸Ａ＝５７５９９Ｃ＋７１０４６０.９９９５１３.３２００~３９.９６０００.２３０.０８盐酸组氨酸Ａ＝２４５４３４Ｃ＋７１０４６０.９９９５６.２５２０~１８.７５６００.６１０.１２盐酸赖氨酸Ａ＝２３３１８Ｃ＋４９２２３０.９９９７１０.７５８０~３２.２７４００.０８０.０２酪氨酸Ａ＝５４８７８Ｃ＋２３０４０.９９９１０.６３００~１.８９０００.９４０.３１表３㊀回收率试验结果名称平均回收率(％)ＲＳＤ(％)门冬氨酸９９.８００.７８谷氨酸１００.１９０.７９丝氨酸１０１.０９１.９３甘氨酸９９.５６１.３８苏氨酸１０１.２４１.４２盐酸精氨酸１００.１２１.０３脯氨酸９８.７３０.５２丙氨酸９９.９５０.６８缬氨酸９８.８７０.９９甲硫氨酸１００.３４１.３９胱氨酸９９.１６１.８２异亮氨酸９９.５８０.９２亮氨酸１００.２２１.８０色氨酸１００.０８１.４５苯丙氨酸９９.９３１.１７盐酸组氨酸９９.８０１.７０盐酸赖氨酸１００.２３１.２７铬氨酸９９.７７１.４０２.９㊀样品检测㊀取本品３批ꎬ照 ２.１ 项下方法制备混合对照溶液及供试品溶液ꎬ照 ２.２ 项下色谱条件检测各氨基酸含量ꎬ结果见表４ꎮ表４㊀样品测定结果名称含量(％)２０１６０５０１２０１６０５０２２０１６０５０３门冬氨酸９９.６８１００.２７１００.９９谷氨酸９９.１９９９.１５１００.１７丝氨酸１００.４３９９.５０１０１.５５甘氨酸９９.９５１００.０７１０１.３１苏氨酸１００.２９１００.４３１０１.８７盐酸精氨酸１００.５１１００.６０１０１.７８脯氨酸９９.６７１００.４８１０１.０１丙氨酸９９.６８１００.７２１０１.０２缬氨酸９９.７０９９.７０１０１.０３甲硫氨酸１００.２４１００.０８１０１.３０异亮氨酸１００.０６９９.０３９８.２９亮氨酸１０１.２３１０１.２９１０２.５４色氨酸９９.９７１００.８２１０１.２６苯丙氨酸１００.７９１０１.０５１０２.７９盐酸组氨酸９９.９４９９.８６１０１.４７盐酸赖氨酸１０１.４２１０１.１５１０１.１８酪氨酸１０１.１７１００.９５１０２.０５３　讨论３.１㊀衍生化条件选择㊀本研究分别对衍生化试剂用量㊁衍生化温度及衍生化时间进行研究ꎬ结果使用１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ在６０ħ条件下衍生化１ｈꎬ样品中各氨基酸均能衍生化完全ꎬ样品检测重复性好ꎮ３.２㊀流动相研究㊀本研究流动相Ｂ为乙腈－磷酸盐缓冲液(０.０１４ｍｏｌ Ｌ－１的磷酸盐缓冲液ｐＨ８.２) (９ʒ９１)ꎬ９％的乙腈能防止流动相长菌㊁沉淀ꎬ延长流动相使用时间ꎻ磷酸盐浓度对氨基酸的分离效果有改善作用ꎻｐＨ值８.２要求选用耐碱色谱柱进行试验ꎮ３.３㊀柱温研究㊀本研究最佳柱温为２７ħꎬ研究发现柱温波动对色氨酸与组氨酸分离影响较大ꎬ当柱温在(２７ʃ１)ħ时ꎬ各氨基酸能较好地分离ꎮ３.４㊀本检测方法胱氨酸可以与其他氨基酸完全分离ꎬ但是由于其含量低ꎬ检测浓度接近定量限浓度ꎬ因此含量测定时未做计算ꎮ参考文献:[１]㊀李莉ꎬ崔红艳ꎬ钟佳琪ꎬ等.ＨＰＬＣ法同时直接测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中的蛋氨酸亚砜和蛋氨酸砜[Ｊ].分析实验室ꎬ２０１８ꎬ３７(１１):１３０９－１３１４.[２]谢升谷ꎬ胡楚楚ꎬ黄巧巧ꎬ等.ＨＰＬＣ法测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中焦谷氨酸的含量[Ｊ].药物分析杂志ꎬ２０１５ꎬ３４(４):７０５－７０９.[３]国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１５年版(二部)[Ｓ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１５:８１１－８１２. [４]ＬＩＷꎬＨＯＵＭꎬＣＡＯＹꎬｅｔａｌ.Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ２０ｆｒｅｅａ￣ｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎａｓｐａｒａｇｕｓｔｉｎｂｙｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｍｅｔｈｏｄａｆｔｅｒＰｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].ＦｏｏｄＡｎａｌＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１２ꎬ５(１):６２－６８.[５]陈建秋ꎬ王玉红ꎬ李鹏ꎬ等.核壳液相色谱－蒸发光散射检测法直接检测２０种氨基酸[Ｊ].上海医药ꎬ２０１５ꎬ３６(１１):７５－７９.[６]陈丽梅ꎬ尚艳芬ꎬ赵孟彬ꎬ等.柱前衍生化－超高效液相色谱法快速测定酱油中的１８种氨基酸[Ｊ].色谱ꎬ２０１０ꎬ２８(１２):１１５４－１１５７.[７]万丹晶ꎬ陈妙芬ꎬ翟咏虹.用ＨＰＬＣ法和氨基酸分析仪测定多维氨基酸片中１８种氨基酸[Ｊ].药学服务与研究ꎬ２００６ꎬ６(３):２１２－２１４.[８]楼永明ꎬ林敏ꎬ陈秀琳.ＨＰＬＣ测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)有关物质的初步研究[Ｊ].中国药品标准ꎬ２０１９ꎬ２０(１):３７－４１.[９]付宜和ꎬ杨国庆ꎬ龚道芬ꎬ等.２ꎬ４－二硝基氟苯柱前衍生化法测定复方氨基酸注射液ＨＰＬＣ色谱条件的优化[Ｊ].药物分析杂志ꎬ２００５ꎬ２５(７):７６２－７６４.[１０]李永贵ꎬ张锡霞ꎬ王晶ꎬ等.一次性使用无菌注射器中抗氧剂１０１０的迁移研究[Ｊ]生物医学工程研究ꎬ２０１６ꎬ３５(２):１３３－１３５.。

柱前衍生氨基酸分析方法（Pico_Tag 法）测定复方氨基酸注射液（18AA-III）中半胱氨酸的含量摘要】目的建立用高效液相色谱仪代替氨基酸分析仪测定18AA-III 中半胱氨酸含量的方法。

方法通过系统适用性试验回收试验，线性试验，重复性试验，溶液稳定性试验验证Pico_Tag 方法能准确测定18AA-III 中半胱氨酸的含量；并分别采用Pico_Tag 方法与柱后衍生氨基酸分析方法（使用仪器：氨基酸分析仪）对3批试制样品中半胱氨酸进行含量测定。

结果该方法回收率、线性和重复性良好，溶液稳定；两种方法测定半胱氨酸的含量没有明显差异。

结论本法能代替柱后衍生氨基酸分析方法准确测定18AA-III 中半胱氨酸的含量。

【关键词】高效液相色谱仪氨基酸分析仪 Pico_Tag 方法柱后衍生氨基酸分析方法复方氨基酸注射液（18AA-III）半胱氨酸含量测定【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2012）07-0318-02国家药品标准WS1-（X -313）-2003Z 中半胱氨酸的含量采用氨基酸分析仪测定，由于氨基酸分析仪不如高效液相色谱仪普及，根据生产实际，采用高效液相色谱仪测定18A A - I I I 中半胱氨酸的含量（柱前衍生氨基酸分析方法，Pico_Tag方法，美国waters 公司开发）。

通过系统适用性试验，回收试验，线性试验，重复性试验，溶液稳定性试验，证明该方法回收率、线性和重复性良好，溶液稳定，可以准确测定18AA-III中半胱氨酸的含量。

还通过柱后衍生氨基酸分析方法和本法（柱前衍生氨基酸分析方法）同时测定三批样品中半胱氨酸的含量，结果表明两种方法测定半胱氨酸的含量没有明显差异。

1 仪器与试药1.1 仪器Waters515/717/2489 高效液相色谱仪，Empower 2 色谱工作站，L-8800 氨基酸分析仪。

1.2 试药异硫氰酸苯（PITC）（美国Waters 公司衍生试剂）；三乙胺（美国Tedia公司，色谱纯）；乙腈（德国默克公司，色谱纯）；注射用水（0.45μm微孔滤膜滤过）；其余试剂均为广州化学试剂厂分析纯试剂。

河 北 医 科 大 学 学 报JO U RN A L OF HEBEI M ED ICA L U NI VER SI T YV o 1.17　No .3　1996高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量许彦芳　许新民　王永利药理教研室(050017) 摘　要　本文利用高效液相色谱(HP L C )柱前邻苯二甲酝酿(OP A )自动衍生、自动进样程序测定脑组织中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和r -氨基丁酸含量。

该法的最低检出限为10nmol /ml ,5种氨基酸峰面积测定值的变异系数平均为2.0±1.3%,线性相关系数平均为0.97±0.03。

关键词　HPL C;氨基酸;OP A ;自动衍生;自动进样HPLC -PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OFAMINO ACIDS BY AUTOMATIC PRECOLUMN DERIVATIZATIONXu Yan fang Xu Xinmin Wang YongliDep artment of Ph armacologyABSTRACT Glutamate,asparate,glycine,taurine and GABA in brain w ere seperated and determined by HPLC system of the autom atic processes of precolum n o -phthaldialdehydeder iv atization and injection .Average co efficient o f variatio n for peak areas of 5amino acids w as 2.0±1.3%w ith the detectio n lim it o f 50ng.Av erag e line co orelatio n coefficient w as 0.97±0.03.KEY WORDS HPLC ;o -phthaldialdehyde ;amino acids ;automatic derivatizatio n ;au-tom atic injection 生物样品中的微量氨基酸测定在医学领域中占重要地位。

柱前衍生和柱后衍生高效液相色谱分析氨基酸方法的进展与评述美瑞泰克有限公司中国代表处整理柱前和柱后衍生高效液相色谱分析氨基酸方法进展与评述以下主要对两种类型的七种应用广泛的氨基酸分析方法进行介绍，讨论和研究。

1、柱前衍生技术和反向色谱分离氨基酸à衍生物à色谱分离1.1 AQC(6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯)法优点：能同时检测一级二级氨基酸，检出现1pmole缺点：pH值和洗脱温度要求控制准确。

1.2 PITC（异硫氰酸苯酯）法缺点：PITC试剂进入柱子使柱填料过早的老化，柱子寿命降低，因此过量的衍生剂需要真空干燥除掉，为此，仪器要附设衍生及真空干燥装置。

（主要用在生物饲料及食品分析中应用）1.3 OPA （邻苯二甲醛-巯基乙醇）缺点：OPA只能与伯氨反应，使二级氨不能同时被检测。

由于反向柱分离过程中会有部分衍生物发生裂解，致使OPA-氨基酸的稳定性很差，尤其是胱氨酸和赖氨酸衍生物信号衰减较快，灵敏度低。

1.4 DANSYL-Cl（丹磺酰氯）法优点：同时可以检测1，2级氨基酸同时能够准确的测定样品中的胱氨酸。

缺点：衍生物在紫外光下不稳定，特别是蛋氨酸对紫外光十分敏感，收率很低，因此衍生反应必须避光进行，而且反应最好要在室温下进行40min左右，如果温度高于45度降低衍生物的产率。

1.5 FMOC-Cl（芴甲氧羟基氯）法2 柱后衍生技术和阳离子交换色谱分离2.1 OPA（邻苯二甲醛-巯基乙醇）法优点：程序化柱后衍生，OPA以极快的速度于氨基酸反应成发荧光团物质，又在很短的时间内进入灵敏度很高的荧光检测器检测，消除了柱前手动衍生是衍生物不稳定的因素，该方法具有较高的分辨率和灵敏度。

2.2 Nin-hydrin（茚三酮）法优点：程序化衍生，衍生反应速度快（60S），衍生物稳定性好，衍生试剂能同时与一级和二级氨基酸反应并同步检测。

缺点：衍生物只能用紫外检测器检测，使灵敏度较低而不适合微量氨基酸测定；衍生反应条件要求较高，需要附设加温衍生装置，仪器造价高；流动相与衍生液同时泵入体系，体系平和时间较长长。

Ａｂｓｒ ｅ： ＲＰＨＰ Ｃ ｔｏ ｏ ｈ ｅｅｍｉａｉｎｏ ｍｉｏａ ｉ ｎＬⅢｕ ｗａ ｓａ ｌ ｈ ｄ ＯＤＳ ｐ ｒｉ Ｃ１ ｏｕ （ ｔａ ｔ Ａ Ｌ ｍｅｈ ｄｆｒｔｅｄ ｔｒ ｎ ｔｏ ｆａ ｎ ｃｄ ｉ ｍ ｓｅ ｔｂｉ ｅ Ａ ｓ ２ Ｈｙ ｅｓ１ ８ｃ ｌｍｎ４６ｍｍｘ ５ ２ ０ｍｍ．５ｐ ｗａ ｍ） ｓ
ｍ
２ ～ ６ ６ ｍｉ．ｆ ｍ ５％－ ０％ ： ６ ６ ３ ｎ ｆｏ ８ ３ ６ ２ ． ｎ ｆ ｏ ６ ８ ２ ～ ２ ｍｉ ． ｒ ｍ ０％～ ５％ Ｔ ｅ ｒｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔｌ ｉｄ ｆａ ｎ ｃ ｄ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｉ ｌ ｍ ｓ ｅ ｉｌ ｒ Ａｍｉ ｏ ９ ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｋ ｎ ｓｏ ｍｉ ｏ ａ ｉ ｓ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉｅ ｎ Ｌｉｕ ｅ ｐ ｃａｌ Ｐ ｏ ｓ ３ ｉ ｙ ｎ
ｕ ｅ ｔ ｏ ｕ ｉ ｎ Ａ ｆ ａ ｃｔｉｔ ｙ ａ ｉ ｅ ＴＨＦ ｎ Ｏ Ａｃ ａ ｅｏ ｉ ｉｅｍ ｅｈ ｎ ｌａ ｂ ｌ ｈ ｓ Ｃｏｕ ｎ ｔｍ ｐ ｒ ｔ ｒ ５ ℃ ａ ｄ ｄ ｔ ｃ ｉｎ ａ ３ ｍ Ｔｈ ｓ ｄ ｗｉ ｓ ｌ ｔ ｏ Ａ — ｅ ｈ ｌｍ ｎ ． ｈ ｏ Ｎ ｒ ａ ｄ Ｂ ｆＮａ — ｃ ｔ ｎ ｔ ｌ ． ｔ ａ ｏ ｓ ｍｏ ｉ ｐ ａ ｅ ｒ ｅ ｌｍ ｅ ｅ ａ ｕ ｅ ３ ｎ ｅｅｔ ｔ ０ｎ ｏ ３ ｅ Ｖｏｕ ａ ｔ ｎ ｏ ｏ ｉ ｈ ｓ ｓ ｒ ｇ ａ ｌ ｍｎｆ ｃｉ ｆＢ ｍ ｂ ｌ ｐ ａ ｅｗａ ｏ ｒ ｍｍ ｅ ｎ ａｌ ｅ ｔ ｎ ｓｆｌ ｗｓ ０ ２ ｎ ｆｏ — ０ ％ ： ２ ２ ｉ ．ｒ ｍ Ｏ ％～ ０％ ： ３ ２ ｉ，ｒ ｍ ０％ － ５％ ： ｒ ｏ ｅ ｐ ｄｌ ｅ ｒ ｉ ｓ ｃ ｉ ｓａ ｏｌ ｉ ｙｎ ｏ ｏ ： － ２ ｍｉ ．ｒ ｍ ０％ ４ ２ ～ ３ｍ ｎ ｆｏ ４ ６ ２ － ３６ｍ ｎ ｆ ｏ ６ ６

Ｄ ｎｙ Ｃ 法检 测 极 限与 Ｏ Ａ 和 Ｆ Ｃ 法相 ａｓｌ ｌ － Ｐ ＭＯ
［］ ．ｅ ｇＧ Ｊ ｕｈ ，． ａ Ｗｉｉ ｅ，．． ｉ ２ Ｃ Ｄ Ｊ ，． Ｈ ｇｅ ＥＶｎ ｒｇ Ｋ ＪＷｌ ｏ ｎ ． ｓ ｅｎ ｎ －
ｓｎＪＣ ｒｍ ｔｇ．２１３５１８） ｏ ， ｈｏ ａ ｒ，４ ，４（９２． ． ｏ ［］ ． ． ｉ ｉ ｓ ａ ，Ａ ｖｎｅ ｉ Ｃ ｒｍ ｔ ｒｐｙ ， ３ ＪＣ Ｇｄ ｎ ｅ ｌ ｄ ｇ ｔ ． ｄａｃ ｎ ｏ ａｏ ａｈ ｓ ｈ ｇ
氨基酸不稳定， 特别是甘 氨酸、 赖氨酸衍生物的信号 衰减很快， 此法多用于全自动的在线衍生（ｎｌｅ。 ｏ－ｎ） ｉ ４Ｏ Ａ法分析配合饲料氨基酸回收率较低， ．Ｐ 这可能 是配合饲料中的盐分影响了衍生（） ０ ｌ。
一、 邻苯二甲醛 Ｏ Ａ） Ｐ 法
邻苯二甲醛（Ｐ 衍生法， Ｏ Ａ） 早在１７年就由 ９１ Ｒ ｔ 提出， ｏｈ 由于其灵敏度比茚三酮法高出十倍， 故
Ａ － Ｈ ＋Ｄ ｎｙ Ｃ Ａ Ｎ － ａｓ －ｌ Ｃ Ａ Ｎ ２ ａｓｌ ｌ Ａ Ｈ Ｄ ｎｙ Ｃ＋Ｈ ｌ ｌ
从仪器设备上讲， 均采用两元梯度淋洗， 需要两 台高压液相色谱泵， 紫外或荧光检测器等。 分析柱多 采用反相Ｃ８ Ｆ Ｃ法以反相Ｃ柱居多。 １ ＭＯ 柱， ８ 从仪器 生产厂家看， 惠普公司和吉尔森公司采用 Ｏ Ａ与 Ｐ Ｆ Ｃ结合法（ ， ｔｓ ＭＯ ２ Ｗａ ｒ公司则建议采用 ＰＴ ５ ） ｅ ＩＣ 法， 并推出了专用的氨基酸分析柱Ｐｃ－ａ 及衍生 ｉ Ｔｇ ｏ 工作站，Ｋ Ｌ Ｂ公司则认为 Ｏ Ａ Ｆ Ｃ和 ＰＴ Ｐ ＭＯ ＩＣ三 法均可使用。 在实际应用中，Ｐ Ｏ Ａ和Ｆ Ｃ在生理 ＭＯ 体液中应用较多， 而在食品和饲料工业中ＰＴ ＩＣ法 占主导地位。 据Ｆｒ 统计结果表明， ｓ ｔ 每年采用Ｏ Ａ Ｐ 法大约分析８０个生理体液样品，ＭＯ ＩＣ和 ００ Ｆ ＣＰＴ

高效液相色谱法测定氨基酸的研究进展赫欣睿;武中庸;叶永丽;高旭东;陈士恩;马忠仁【摘要】氨基酸是构成生物体的基础物质,氨基酸分析是生命科学研究中最重要的领域之一.高效液相色谱法因分析速度快、操作简便、检测灵敏、适用范围广等优点而广泛应用于食品工业、制药工业、生命科学研究等领域.该文综述了高效液相色谱分析氨基酸的方法,包括柱后衍生法、柱前衍生法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法和高效液相色谱-蒸发光散射检测法.并对上述方法进行了比较,为日常的氨基酸分析提供了参考.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2016(035)007【总页数】7页(P922-928)【关键词】氨基酸;高效液相色谱法(HPLC);柱前衍生;柱后衍生;综述;研究进展【作者】赫欣睿;武中庸;叶永丽;高旭东;陈士恩;马忠仁【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124【正文语种】中文【中图分类】O657.72;O629.7氨基酸是构成蛋白质大分子的基础物质，与生命活动息息相关。

目前，自然界中发现的氨基酸约有300种，而组成生物体蛋白质的氨基酸约有20种。

氨基酸分析在生物化学、食品科学、临床医学、饲料科学、化工等领域具有重要作用，因此改进和发展氨基酸的分析方法对于人类具有重要意义。

高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展的新型分离分析技术，具有分离效能高、速度快、操作简便、检测灵敏度好、对样品适用范围广等特点，已广泛应用于各领域。

高旭东等[1]建立了黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的高效液相色谱检测方法。

年,
一 邢健
一
通讯作者
。
石 家 庄 市 科 学技 术 研 究 与 发 展 计 划 资助 项 目
作者简介
一 , 女 , 河北张家 口人 , 硕士研究生 , 研究方 向为食品安全与检测 。
中国食 品添加剂
专 论 综 述 的应 用 , 已 成 为 一种 较 为 理 想 的 氨 基 酸 检 测 方
方 法的发展 , 柱 前 衍 生 反 相 高效 液 相 色谱 法 、 高
短 、 准确 性 好 、 灵 敏 度 高 、 适 用 性 广 等优 点 , 逐
渐取 代柱 后衍 生 一阳离 子交 换 色谱 在 许 多领 域 中
年第 期
专 论 综 述
中 国食 品添加 剂
外 吸 收 增 强 , 可 由 紫外 检 测 。
达 。
可与一 、 二
胧 氨 酸准确定 量 。衍 生物 在 紫外 光 下 不 稳 定 , 待 别是蛋 氨酸对 紫 外 光 十 分 敏感 , 收 率 很低 , 因此 反 应需 在密 闭和 避光 条件 下 进行 , 衍生 完 成 后 需
方 法进 行综 述 。
法 。 目前 用于 氨基酸 分 析 的 柱 前 衍生 试 剂 主要有
邻苯 二 甲醛
氨基 甲酸 醋 、 一 `了 等。 ,
〕 、 苯 异硫 氰 酸 醋
一二 硝基 氟 苯
' 、 一 氨基唆琳基 一 一 羚基一 唬泊酞亚
口 、丹黄酞氯
甲醋 二 甲醛
一
及氯 甲酸药
在还原 剂琉 基 乙 醇或 琉 基 丙 酸 存 在 下 , 邻 苯 与一级氨基酸迅速反应生成 衍生化方法
也可用 高灵 敏度荧 光检 测 。
法 不仅 具 有 与离
子交换 色谱相 媲 美 的 高精 密度 、 高 灵 敏度 , 而且 还 不受 电解质 、 维 生 素 、 微 量 元 素 的干 扰 , 适 用 范围极 广 。 是近些 年才 发展起 来 的一种 衍生 剂 , 反应 需避 光进行 , 发 生在 ℃水浴 的弱碱 性 介 质 中 , 其将 苯环 引人 氨 基 酸分 子 构 型 , 使 氨 基 酸紫

氨基酸分析方法的研究进展邢健;李巧玲;耿涛华;仪宏;宋思远【期刊名称】《中国食品添加剂》【年(卷),期】2012(000)005【摘要】氨基酸分析技术在生命科学、食品科学、临床医学等领域研究中都起着至关重要的作用.近年来,人们越来越重视氨基酸分析方法的革新和改进,氨基酸分析的速度、灵敏度、仪器自动化水平提高至一个崭新的水平,使氨基酸分析方法发展成为一种具有广泛适应性的分析方法.本文综述了氨基酸分析检测的常用方法及其研究进展,主要介绍了柱后衍生阳离子交换色谱法(HPCEC)、柱前衍生反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、积分脉冲安培检测法(HPAEC-IPAD)、超高压液相色谱法(UPLC)及毛细管电泳法(CE),探讨了其各自的优缺点,比较了常用的柱前衍生剂,并对氨基酸分析方法的发展趋势进行了展望,为建立氨基酸分析方法提供了参考.【总页数】5页(P187-191)【作者】邢健;李巧玲;耿涛华;仪宏;宋思远【作者单位】河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018;河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018;河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018;河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018;河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018【正文语种】中文【中图分类】TS207.3【相关文献】1.氨基酸分析方法的研究进展 [J], 江海风;马品一;金月;冯旭东;王兴华2.氨基酸类神经递质分析方法的研究进展 [J], 赵艳萍;丁晓霞;王勇;黄艳辉;杨华3.茶叶中氨基酸分析方法研究进展 [J], 杜颖颖;叶美君;刘相真4.人乳中氨基酸的含量及分析方法研究进展 [J], 任向楠;荫士安;杨晓光;杨振宇5.痕量氨基酸分析方法研究进展 [J], 何继杰;张晓凤;钱莉莉;封丽;赵天涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第22卷第1期2003年1月 无锡轻工大学学报Journal of Wuxi U niversity of Light Industry Vol.22　No.1Jan.　2003　文章编号:1009-038X (2003)01-0074-03 收稿日期:2002-07-08;　修回日期:2002-09-05.作者简介:吴艳(1977-),女,山东烟台人,食品科学与工程硕士研究生.柱前衍生反相高效液相色谱法分析碱性氨基酸吴艳1,　艾连中1,　丁先锋2,　彭奇均2,　汤坚1(1.江南大学食品学院,江苏无锡214036; 2.江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214036)摘　要:采用柱前衍生反相高效液相色谱法(RP 2HPLC )测定碱性氨基酸含量,衍生化试剂为2,42二硝基氯苯(CDNB ),流动相为0.2mol/L 的醋酸2醋酸盐缓冲液(p H 5.20)和甲醇的混合溶液,其体积配比为75∶25,不需梯度洗脱;采用C 18柱,在波长360nm 条件下进行紫外检测,碱性氨基酸质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,相关系数均在0.98以上,分离效果较好.关键词:碱性氨基酸;2,42二硝基氯苯;柱前衍生化;反相高效液相色谱中图分类号:Q 517文献标识码:APrecolumn Derivation RP 2HPLC Method of B asic Amino AcidsWU Yan 1,　A I Lian 2zhong 1,　DIN G Xian 2feng 2,　PEN G Qi 2jun 2,　TAN G Jian 1(1.School of Food Science and Technology ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214036,China ;2.School of Chemical and Material Engineering ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214036,China )Abstract :A method for determination of basic amino acids by RP 2HPLC with 2,42dini 2trochlorobenzene precolumn derivation has been developed.Chromatographic conditions were as follows :mobile phase —0.2mol/L acetate buffer (p H 5.20)and methanol in a ratio of 75∶25;separation column C 18;detection wavelength 360nm.G ood linear relation between the concentration of basic amino acids and peak area was obtained ,and correlative coefficient was over 0.98.Basic amino acids were well separated by the method.K ey w ords :basic amino acids ;2,42dinitrochlorobenzene ;precolumn derivatization ;RP 2HPLC 氨基酸分析在食品、生化、医学乃至生命科学领域中有着广泛的应用.传统的分析方法主要是采用氨基酸自动分析仪测定,但该仪器对氨基酸测定的专用性强,且仪器的价格昂贵,不能广泛应用于其它成分的分析.近20年来,随着键合反相色谱的应用及柱前衍生化技术的发展[1],氨基酸的分析多采用高效液相色谱法,它具有分辨率高、灵敏度高,操作简单且可一机多用的优点.常用的衍生化试剂[2]包括邻苯二甲醛(OPA )、丹酰氯(Dansy —Cl )、2,42二硝基氟苯(FDNB )、异硫氰酸苯酯(PITC )等.随着对氨基酸研究的不断深入,碱性氨基酸在医药、食品及饲料等领域的应用也日益普遍.赖氨酸是人体及动物自身不能合成的一种必需氨基酸,可用于治疗营养缺乏、发育不全及氮平衡失调症,同时还可用于食品及饲料强化剂;精氨酸与脱氧胆酸制成的复合制剂(明诺芬)是主治病毒性黄疸的有效药物;组氨酸可用于生产治疗心脏病、贫血、风湿性关节炎和消化道溃疡等的重要药物[3].目前,从提取胱氨酸母液或者猪血粉中制备碱性氨基酸都需要对其进行分析检测,作者采用2,42二硝基氯苯(CDNB )作为柱前衍生化试剂来分析碱性氨基酸,其柱前衍生和色谱分析条件与FDNB 法[4]类似,但与FDNB 法相比,具有衍生试剂价廉易得,理化性质稳定,制备试样方便简单,过量的CDNB 对测定结果无干扰等特点[5].CDNB 在碱性条件下能与氨基酸缩合,生成二硝基苯基氨基酸(DN P 2氨基酸)[6]及副产物DN P 2OH 等.该衍生物由于硝基苯环的引入有强的紫外吸收,并且有很好的稳定性.各种DN P 2碱性氨基酸由于R 基不同,在流动相洗脱过程中其保留时间有所不同,从而达到分离的目的.衍生化反应的方程式如下:1　材料与方法1.1　试剂组氨酸(His )、赖氨酸(Lys )、精氨酸(Arg )均为上海化学试剂公司产品;2,42二硝基氯苯(CDNB )、醋酸、醋酸钠、无水碳酸钠、甲醇、盐酸均为分析纯试剂.1.2　仪器高效液相色谱仪,配有二极管阵列检测器(DAD K 22700型),德国KNAU ER 公司产品;PHS 23型精密数显酸度计,上海天达仪器有限公司产品.1.3　实验方法1.3.1　碱性氨基酸的衍生化1从待测的碱性氨基酸溶液中各精密量取1mL 置10mL 的容量瓶中,加质量分数1%的Na 2CO 3溶液(p H =9)1mL ,再加质量分数1%的2,42二硝基氯苯(CDNB )的甲醇溶液1mL ,密封摇匀,置85℃恒温水浴中暗处反应1h ,取出冷却,分别加入稀盐酸0.5mL ,用水稀释至刻度,摇匀.在一定的色谱条件下(见表1)取20μL 进样测定.1.3.2　线性关系的测定1准确称取适量组氨酸、赖氨酸、精氨酸,配成质量浓度分别为0.005,0.01,0.05,0.10,0.16,0.20,0.25,0.30mg/mL 的溶液,按上述衍生化方法制得DN P 2氨基酸并测定其线性关系.表1　CDNB 衍生化氨基酸的分离条件T ab.1　Separation conditions of CDNB derivatization ofalkaline amino acids色谱条件参 数色谱柱Kromasil C 18,4.6mm ×250mm 流动相A :甲醇;B :0.2mol/L NaAc —HAc缓冲体系(p H 5.20);V (A )∶V (B )=25∶75,经0.45μm 滤膜过滤,超声波水浴脱气30min.柱温40℃检测波长360nm 流量1mL/min2　结果与讨论2.1　回归方程 以DN P 2氨基酸峰面积为纵坐标Y ,碱性氨基酸的质量浓度为横坐标X ,对测得的数据进行直线回归,结果见图1.回归方程、相关系数和线性范围见表2.结果表明,被测氨基酸在此质量浓度范围内,经衍生化后生成的DN P 2氨基酸峰面积与碱性氨基酸质量浓度呈线性关系.图1　碱性氨基酸的回归直线Fig.1　The regression line of b asic amino acids2.2　衍生化试剂CD NB 的加入质量根据上述反应方程式可知,1mol 碱性氨基酸与1mol CDNB 在碱性条件下可生成1mol DN P 2氨基酸,1mg 碱性氨基酸需要衍生剂的理论质量见表3,但为了保证衍生反应完全,衍生试剂应适当过量.多次试验的结果表明,当衍生剂的实际加入质量是理论加入质量的4～6倍时,衍生反应完全且对分离不产生干扰,故作者在实验过程中选用衍生剂的质量为理论质量的5倍.57第6期吴艳等:柱前衍生反相高效液相色谱法分析碱性氨基酸表2　线性关系测定结果T ab.2　The linear regression equ ation and correlation coeff i2 cient of b asic amino acids碱性氨基酸回归方程相关系数质量浓度的线性范围/(mg/mL)His Y=3387.7X+55.2950.99330～0.21 Lys Y=777.17X+11.8080.98970～0.30 Arg Y=563.11X+39.5860.99120～0.25表3　每毫克碱性氨基酸衍生化所需CDNB理论加入质量T ab.3　The theoretical value of CDNB needed for per mgb asic amino acid碱性氨基酸CDNB理论加入质量/mgHis 1.31Lys 1.39Arg 1.162.3　衍生化反应的条件2.3.1　温度1氨基酸与CDNB分别在碱性条件下于50,60,80,90℃各反应1h,80℃和90℃反应条件下,DN P2氨基酸得率较高.为使衍生化反应完全,反应条件选定为85℃.虽然甲醇的沸点为65℃,在此反应条件下极易挥发,但是甲醇并不参加衍生化反应,而是将CDNB溶解为CDNB的甲醇溶液,当氨基酸与过量的CDNB接触,反应就开始发生,这样有利于反应的快速进行.2.3.2　缓冲体系的p H值　经过多次实验摸索,在缓冲液和甲醇的体积配比不变时,降低缓冲体系的p H值可以明显提高各组分间的分离度,但并不意味着p H值越低分离效果就越好.在p H值为5.30, 5.20,5.10　3个不同条件下对混样进行分析,因组氨酸和DN P2OH较难分离,故主要考察两者的分离度,结果发现在p H值为5.20时分离效果最好(见表4).表4　缓冲液pH值与分离度的关系T ab.4　The relationship betw een pH of buffer solution and resolutionp H值R5.30 1.435.20 1.925.10 1.542.4　衍生化产物本方法于30min内可较好地分离碱性氨基酸,结果见图2. 其中赖氨酸为二氨基氨基酸,可与CDNB衍生反应生成3种物质,色谱图中标有两种赖氨酸衍生物.在样品测定时,可任选一种衍生物峰定量.另外,衍生化产物DN P2氨基酸的最佳p H值为9,为避免因进样量大对色谱柱填料及组分的分离产生影响,应加适量稀盐酸将试液调至p H值为8左右,稀盐酸用量不可太大,否则当p H值小于6时, DN P2氨基酸会产生沉淀.1.DNP2OH;2.DNP2His;3.DNP2Lys第一个峰;4.DNP2Arg;5.DNP2Lys第二个峰图2　碱性氨基酸的标准色谱图Fig.2　The stand ard chromatogram of b asic amino acids 3　结　论采用柱前衍生反相高效液相色谱法分析碱性氨基酸是一种灵敏、快速的方法.该法具有衍生反应完全、分离测定无干扰、结果准确可靠等特点.所采用的衍生化试剂为2,42二硝基氯苯(CDNB),流动相为醋酸2醋酸盐缓冲液(p H5.20)和甲醇的混合溶液,其体积配比75∶25,不需梯度洗脱,在85℃衍生化反应1h,碱性氨基酸能得到很好的分离.参考文献:[1]GIDDIN GS J G.Advances in Chromatography[M].New Y ork:Marcel Dekker Inc,1983.[2]常碧影,梁冬生,阎惠文,等.氨基酸分析技术研究进展[J].分析化学,1993,21(10):1220-1227.(下转第81页)67 无　锡　轻　工　大　学　学　报 第21卷 由图8可以看出,原淀粉与丙烯酰胺接枝聚合后,其团粒结构仍然存在,丙烯酰胺只是覆盖在淀粉团粒的表面,淀粉团粒内部还没有进行反应.3　结　论1)引发剂用量、单体用量、反应温度和反应时间对玉米淀粉与丙烯酰胺合成产物的接枝率和单体聚合率有很大影响.当淀粉用量为5.0g ,丙烯酰胺为8.0g ,Ce 4+用量为1.0mL ,温度为60℃,反应2h 时,其接枝率达83.40%,单体聚合率为98.13%.2)淀粉是一种弱还原剂,除了作为接枝共聚反应的骨架材料以外,它对单体的聚合本身有一定的促进作用.3)Ce 4+—S 2O 2-8复合体系可以提高单体的聚合率,其原因是实现了Ce 4+—Ce 3+—Ce 4+的多次循环,既保证了Ce 4+引发的高接枝率和高聚合速率,又可减少Ce 4+的用量.4)从扫描电镜观察可以看出,原淀粉与丙烯酰胺的接枝聚合只发生在淀粉颗粒表面,内部没有发生反应,且有氮时的接枝率和单体聚合率都比较大.参考文献:[1]曾宪家.接枝淀粉的应用[J ].广西化工,1991,(1):12-19.[2]谢铁凌,邱学青,杨卓如.淀粉化工的研究现状及进展[J ].广东化工,1997,(2):6-8.[3]鲁德忠,巫拱生,胡应模,等.丙烯酰胺与玉米淀粉接枝共聚的合成及其对含石油废水的处理[J ].吉林大学自然科学学报,1989,(1):81-85.[4]潘松汉,黎国康,王真智,等.淀粉与丙烯酰胺接枝共聚反应动力学的研究[J ].石油化工,1993,(3):177-181.[5]张友松.变性淀粉生产与应用手册[M ].北京:中国轻工业出版社,1999.[6]潘松汉,王贞,黎国康,等.淀粉糊化对淀粉-丙烯酰胺接枝聚合的影响[J ].精细化工,1993,(10):56-59.[7]巫拱生,阎少羽,鲁德忠,等.Ce 4+引发丙烯酸丁酯与玉米淀粉接枝共聚反应规律的研究[J ].吉林大学自然科学学报,1989,(3):97-98.[8]王玉芹,杨巍,崔丹.铈盐-过硫酸盐复合引发淀粉与丙烯酰胺接枝共聚合产物的研究[J ].高分子学报,1996,(1):111-114.[9]张连生,王玉芹,杨巍.Ce 4+—Ce 3+循环体系引发淀粉与丙烯酰胺接枝共聚合反应动力学的研究[J ].高分子学报,1994,(3):354-357.(责任编辑:李春丽,杨萌)(上接第76页)[3]张伟国,钱和.氨基础生产技术及其应用[M ].北京:中国轻工业出版社,1997.[4]陈娅兰,付宜和,王国林,等.十八种氨基酸注射液的HPLC 2,42二硝基氟苯柱前衍生化法含量测定[J ].药物分析杂志,1990,10(3):149-151.[5]蒋新宇,周春山.氨基酸的柱前衍生高效液相色谱分析述评[J ].湖南化工,1999,29(2):9-11.[6]杨胜.饲料分析及饲料质量检测技术[M ].北京:北京农业大学出版社,1993.(责任编辑:朱明)18第1期胡青平等:玉米淀粉接枝丙烯酰胺合成。

Ｆ ｏ－ｍｎ ａ ｄ ｏ ｒ ｅｅ－ｈｓ Ｈ Ｌ ａｄ ｍ ｃａｉ ｃ ｓ ｅ ｒｄｐａ ＰＣ ｏ ｎ ｓ ｉ ｖ ｅ ｎ
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讨
论
在ｐ ７ 的条件下Ｆ ｏ－ １ Ｈ． ７ ｍ ｃＣ 可与氨基酸 迅速反应生成有荧光的Ｆ ｏ－ ｍ ｃ氨基酸，反应
式如下：
ｔａｏ ｗ ｈ ｏ Ｇ ｏ ｎｉ Ｈｕｎ Ｙ ｌｎ ｉ ｔｎ Ｆ ｃ Ｙ ， ｚｉ ｉ ｍ ｔ ｕ ａ ａｇ ｉｉ ｇ ａ ｄ ｏ ｉｎ ｓ ｔｔ ｏ Ｂ ｓ Ｍｅｉ ｌ ｎ Ｙ Ｚ ｉ ａ Ｉ ｔ ｕｅ ａｉ ａ ｈ ｎｉ ｃ ｄｃ ． ａ Ｓｉ ｃ ，ｃ ｄｍ ｏ Ｍｉｉ ｒ Ｍｅｉ ｌ ｉ ｃ ｎｅ Ａａ ｅｙ ｅ ｓ ｌｔ ｙ ｄｃ Ｓ － ａ ａ ｃ ｅｃ ， ｅ ｉｇ ｎｅ Ｂ ｉ ｎ ｓ ｊ Ｆ ｏ （ｕｒ ｙ ｅ ｙ ｘ ｃ ｂｎｌ ｌ ｉ ） ｍ ｃ ｆ ｏ ｎｌ ｔ ｌ ｙａ ｏｙ ｈ ｒ ｅ ｌ ｅ ｍ ｈｏ ｒ ｃｏ ｄ ｉ ａ ａ ｉ ｐｏ ｃｎ ｇ ｕ， ｈｃ ｈｓ ｎ ｓ ｅ ｍｎ ｒｔ ｔ ｇ ｐ ｗ ｉ ａ ｂ ｎｗ ｏ ｅ ｉ ｒ ｏ ｈ ｅ ｅ ａｐ ｅ ｉ ｐｐ ｄ ｓ ｔ ｓ． ｓ ｏ ｒ ｃ ｗｔ ｐｌｄ ｅｔｅ ｈ ｉ Ａ Ｆ ｃ ｔ ｉ ｉ ｎ ｉ ｙ ｅ ｓ ｎ ｍ ｅ ｓ ｈ ａ ｐｉ ａｙ ｉ ， ｓ ｌａ ｓ ｏａｙ ｉ ｉｃｎ ｒ ｒ ａ ｎ ａ ｗ ｌ ｅ ｎｒ ａ ｎ ｔ ｍ ｍ ｅ ｅ ｓ ｃ ｍ ｅ ａ ｂ ｕｅ ａ ａ －ｏ ｍ ｄｒ ａ ｚ ｇ ｇ ｔ ｅ ｄ ｐｅ ｌ ｎ ｉ ｔ ｉ ｒ ｅ ｆｒ ｓ ｓ ｒ ｃ ｕ ｅ ｖ ｉ ｎ ｅ ｎ ｏ ａ ａａ ｓ ｏ ｔｔ ａ ｉ ａ ｄ ｂ Ｈ Ｌ ． ｈｖ ｎｌ ｉ ｆ ａ ｍｎ ｃ ｓ Ｐ Ｃ Ｗｅ ｅ ｙ ｓ ｏ ｌ ｏ ｉ ｙ ａ ｉ ｅ ｉ ｔ ｔ ｃ ｏ ａ ｇ ｒｈ ｃｎｉｏｓ ｎ ｓｇ ｅ ｈ ｈ ｍ ｔ ｒ ｐ ｃ ｄ ｉ ｏ ｖ ｔ ａ ｄ ｅ ｒ ｏａ ｏ ｔｎ ｆ