高效液相色谱柱后衍生法检测啤酒中黄曲霉毒素的研究

高效液相色谱.柱前衍生法测定食用油中黄曲霉毒素B1和B2的方法研究作者：陈瑞莲来源：《现代食品·上》2019年第01期摘要：采用高效液相色谱一柱前衍生法对食用油中的黄曲霉毒素B1和B2进行检测。

样品经85%乙腈水提取后，氮吹至近干，用正己烷和三氟乙酸衍生，在高效液相色谱仪荧光检测器上检测。

结果表明：黄曲霉毒素B1和B2在0.2～40ng·mL-1内呈良好的线性关系，r>0.999，黄曲霉毒素B1和B2添加浓度在0.2～10ug·kg-1回收率范围为83.7%～92.8%，RSD 为4.0%～8.3%，检出限分别为0.075ug·kg-1和0.068ug·kg-1，并用所建方法同GB5009.22-2016中的第二法进行比较分析，从而为食用油中黄曲霉毒素B1和B2的检测提供一种更快速、更节约成本的方法。

关键词：高效液相色谱;柱前衍生;食用油：黄曲霉毒素B1;黄曲霉毒素B2中图分类号：0657.7黄曲霉毒素（Analoxin，AF）属于真菌毒素，是黄曲霉在生长繁殖过程中产生的一种次级代谢产物。

1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织癌症研究机构划定为一类致癌物，是毒性极强的物质，其中以黄曲霉毒素B1的毒性最强，其毒性是氰化物的10倍、砒霜的68倍。

黄曲霉可使花生、大豆、玉米、大米等粮食和油料作物发生霉变，其代谢产物黄曲霉毒素能造成粮食及油料的污染。

研究表明，黄曲霉毒素对人和动物有很强的致病性，尤其是肝癌与黄曲霉毒素的相关性较大。

近年来，我国食品监督抽检或者企业及个人送检的花生油中黄曲霉毒素B1残留量超出标准限量值的情况屡见不鲜。

目前，检测黄曲霉毒素的国家标准方法主要有薄层色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱法和液质联用法，前两种方法灵敏度低，定量和定性能力较差，高效液相色谱法和液质联用法又成本高。

本文以各种食用油为研究对象，建立了黄曲霉毒素的高效液相色谱一柱前衍生法，前处理不需要固相萃取柱净化，为检测机构节约了大量成本。

２ ０ ４． ５ ｘ ６ｍｍ ， ｍ 。 ５
密 度好 。
关键词 ： 黄曲霉毒素 ； 高效液相 色谱 ； 坚） 干（ 果
Ｄｅ ｅ ｍ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｌａ ｏ ｉ ｉ ｔ ｙＨ ｉｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｃ ｑ ｄ Ｃｈ ｏ ａ ｏ ｒ ｐ ｔｒ ｎ ｔｏ ｆＡｆ ｔ ｘｎ Ｎｕ ｓｂ ｇ Ｐｅ ｆ ｒ ｎ ｅＬｉ ｕｉ ｒ ｍ ｔ ｇ ａ ｈ ｎ Ｗ ＡＮＧ ｈ — ｏ Ｓ ｕ ｍａ
性 食品如肝 、 咸鱼 中 以及在奶 和奶 制品 中也 曾发现过
１１ 仪器 ．
高效液相色谱仪 ： ｇ ｅｔ ２０高效液相色谱 工作 Ａ ｉ ｎ １０ ｌ
站 ； 光检测 器 ： ｇ ｅｔ １２ Ａ荧 光检测器 ； ｃｓｐ 荧 Ａ ｉｎＧ ３ １ ｌ Ｍｙｏｅ ２ ６净化 柱 （ ｏ ｅ ａｓ ；柱 后衍 生仪 ：ＩＫ Ｒ Ｎ ２ Ｒｍｒ ｂ） Ｌ ＰＣ Ｅ Ｉ Ｇ
ｃ ｎ ｅ ｔ ｒ ｅ ａ ａｅ ｙ ｇａ ｉｎ ｌ ｔ ｎｗｉｈａ ｅｏ ｉ ｉｅｗａｅ ｆ ｉ ｅｅ ｔ ｏ ｃ ｎｒ ｔｏ ｒ ｍ ｉ ｎ ｒ ａ ｏ ｔｎ ｓｗｅ ｅｓ ｐ ｒ ｔｄ ｂ ｒ ｄｅ ｔ ｕ ｉ ｔ ｃ ｔ ｎｔ ｌ／ ｔｒｏ ｆ ｒ ｎ ｎ ｅ ｔａｉｎｆｏ Ａｇｌ ｔ ｅ ｏ ｒ ｄｆ ｃ ｅ Ｚｏｂ ｘ Ｓ Ｂ—Ｃ１ｃ ｌ ｍｎ ａ ｄ ｔｅｒｃ ｎ ｅ ｔ ｒ ｅｅ ｔｄ ｂ ｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｅｅ ｔｒ Ｔｈ ｉｅ ｒｒ ｌｔ ｎ ｈ ｐｗａ ｏ ｄ Ｔｈ ８ ｏｕ ， ｎ ｉ ｏ ｔｎ ｓｗｅ ｅｄ ｔ ｃｅ ｙｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅｄ ｔｃｏ ． ｅｌ ａ ｅａ ｉ ｓ ｉ ｓｇ ｏ ． ｅ ｈ ｌ ｎ ｏ ｒ ｃ ｖ ｒｅ ｆ ｏ ｒａｌｔｘｎ ｒ ｎｔ ｅｒ ｎ ｅ ｏ ２ ％ －１ ０ ％ ， ｎ ｈ ｏ ｓ ｅｅ ｔｄ ｃ ｎ ｅ ｔａｉｎ ｏ ， ｅ ｏ ｅ ｓｏ ｕ ｆ ｏ ｉｓｗｅ ｅｉ ｈ ａ ｇ ｆ８ ｉ ｆ ａ ０ ａ ｄｔ ｅｌｗｅ ｔ ｔｃｅ ｏ ｃ ｎｒ ｔｏ ｆＢ１ Ｇ１ ｄ ｗｅ ｅ ０２ ． ／ ｇ ｈ ｏ ｃ ｎｒ ｔｏ ｆＢ２， ｒ ．０ Ｉｇｋ ．Ｔ ｅ ｏ ｅ ａｉ ｎ ｏ ｅｅｍ ｉａｉｎ ｏ ｆａｏ ｉ ｎ ｒ ．３ Ｉｇｋ 。ｔｅ ｃ ｎ ｅ ｔａｉｎ ｏ ￣ Ｇ２ ｗｅ ｅ ０ １ ｘ ／ｇ ｈ ｐ ｒｔｏ ｆｄ ｔｒ ｎ ｔｏ ｆａ ｔｘｎ ｉ ｌ ｎ ｔ ｙｔｉ ｔｏ ｓｓ ｆ ｑ ｉｋ， ｃ ｕ ａｅａ ｄｐ ｅ ｉｅ ｕ ｓｂ ｓｍｅｈ ｄｉ ａｅ， ｕ ｃ ａ ｃ ｒ ｔ ｎ ｒ ｃｓ ． ｈ Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｓ：ｆａｏ ｉ ｄ ａ ｔｘ ｎ；ＨＰＬ ｌ Ｃ；ｎ ｔ ｕ

食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。

本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。

样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。

2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。

用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。

2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。

2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。

2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。

关键词：食用油；黄曲霉毒素 B1；柱后衍生；荧光检测
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Determination of aflatoxin B1 in edible oil by post column derivatization with post column derivatization,. The results showed that the aflatoxin B1 has good linear correlation in the concentration range of 0.5 ～ 55 ng/mL, the correlation coefficient was 0.999; The results of six parallel analysis of the concentration of 0.4, 2, 20 ng/mL of aflatoxin B1 standard was good, recovery rate was 85.8% to 106.2%. The detection limit was 0.050 μg/kg.
１．３ 样品处理
１．３．１ 黄曲霉毒素 Ｂ１ 标准溶液的配制 取不同体积的黄曲霉毒素 Ｂ１ 储备液，用乙腈和苯
（ｖ／ｖ，２ ∶ ９８）稀释，配制成浓度为 ０．４、０．８、１．６、３．２、 ６．４、１２．８、２５．６ ｎｇ／ｍＬ 和 ５１．２ ｎｇ／ｍＬ 的标准系列溶液， 储存于棕色小瓶中，于 ４ ℃冰箱中存放。 １．３．２ 试样的制备 参考国家标准 ＧＢ／Ｔ １８９７９－２００３《食品中黄曲
ｍＬ／ｍｉｎ。
色谱柱：Ｃ－１８（４．６ ｍｍ×２５０．０ ｍｍ，５ μｍ）；柱 ２．１ 黄曲霉毒素 Ｂ１ 标准谱图及标准曲线
温：４０ ℃。
黄曲霉毒素 Ｂ１ 标样色谱图如图 １ 所示。由图 ２ 可

柱后衍生—HPLC测定与分析沉香中黄曲霉毒素目的：对沉香中黄曲霉毒素进行测定。

方法：采用柱后衍生-HPLC联用技术，测定沉香中黄曲霉毒素的含量，了解所获沉香中黄曲霉毒素污染情况。

结果：按照《中国药典》2015版的要求与指导原则，69批次沉香样品均未检出黄曲霉毒素。

结论：柱后衍生-HPLC联用技术测定沉香中黄曲霉毒素方法可行，我国沉香黄曲霉毒素未受到黄曲霉毒素污染。

标签：沉香；黄曲霉；柱后衍生-HPLC黄曲霉毒素是真菌毒素中毒性最强的一种真菌毒素，具有极强的毒性和致癌性。

在自然界中，无论是土壤、腐烂有机质物品与植物纤维、农产品或者其他食品上都有黄曲霉毒素存在。

黄曲霉最适宜生存在相对湿度85%左右的热带、亚热带地区并产生黄曲霉毒素。

我国地域十分辽阔以及气候的多样性和复杂性导致我国中药材和中药饮片在加工、贮藏、运输的过程中，很容易发生霉变而导致被黄曲霉毒素污染。

因此，检测中药材中黄曲霉毒素具有极其重要的意义[1-4]。

目前2015版《中国药典》仅仅对少数几种中药材规定有关黄曲霉毒素含量的限度标准，如陈皮，胖大海等。

沉香是我国的名贵中药材之一，2016年广东省通过立法保护广东八种道地中药材，沉香为其中之一。

由于沉香主产越南、海南和广东等热带和亚热带地区，该地区的环境条件极易被黄曲霉等真菌类污染而产生黄曲霉毒素。

因此，笔者拟采用柱后衍生与高效液相色谱联用技术[5-8]，通过对沉香进行黄曲霉毒素测定，建立沉香中黄曲霉毒素含量测定的方法，为监管部门提供技术支持。

1仪器与材料11仪器Waters 2695/2475高效液相色谱仪及柱后衍生系统；色谱柱：Shim-pack CLC-ODS C18（150mm×6mm，5μm）、phenomenex gemini C18（250mm×46mm，5μm）、Thermo ODS-2 HYERSIL（200mm×46mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250mm×46mm，5μm）；离心机：Thermo Scientific Multifuge X1R 12材料黄曲霉素混合对照品（批号：46304-U LB8422，B1、B2、G1、G2纯度分别为990%、990%、997%、995% ，Supelco Analitical）。

2010版药典黄曲霉毒素检验法（文字版）附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法(附录ⅥD)侧定药材饮片剂制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(10：18：42)为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测。

衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加人甲醇100ml使溶解，用谁稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每挣钟0.3ml衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm(或365nm），发射波长λem=450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混和标准品（黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。

即得。

测定法分别精密吸取上述混和对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，诸如液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，另精密吸取上述供试品溶液20-25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。

0.02.55.07.510.012.5min0510152025303540mVDetector A:Ex:365nm,Em:425nmHPLC 柱前衍生法分析黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素（AFT ）对有机体具有致突、致癌、致畸性，被列为可能的人体致癌物质。

黄曲霉毒素在多种人类食物中被发现，如玉米、坚果、花生等等，以B1、B2、G1、G2的形式存在。

AFTB1在动物体内可转变成两种主要代谢产物- AFTM1和AFTQ , 前者的毒性和致癌性与AFTB1相近, 主要存在于动物的尿和乳汁中。

黄曲霉毒素可使用正相和反相液相色谱法分离，反相色谱法操作较容易、流动相毒性也较低，被广泛采用。

使用反相液相色谱检测时，可通过柱前衍生法或柱后衍生法，提高AFTB1、AFTG1的检测灵敏度，使之与AFTB2、AFTG2在相近水平下检测。

柱前衍生法无需专用柱后衍生反应系统，方法简单。

本方法通过三氟乙酸（TFA ）柱前衍生，HPLC 检测黄曲霉毒素B1。

该方法可用于4种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2同时检测，也可用于AFTM1检测。

■ 样品前处理取50μL 黄曲霉毒素B1标样溶液 (10ng/mL ，溶剂苯-乙腈溶液(98:2 v/v))，用氮气吹干，加入200μL 正己烷和100μL 三氟乙酸，混匀1min ，室温下放置10min ，氮气吹干，用乙腈水溶液(乙腈/水 85：15 v/v) 50μL 重新溶解，混匀30s ，经0.45μm 滤膜过滤，供液相色谱仪检测用。

■ LC 分析条件仪器Shimadzu LC-20A 液相色谱系统（含LC-20AT 二元泵、CTO-20A 柱温箱，RF-10AXL 荧光检测器，LCsolution 色谱工作站）色谱分析条件流动相：甲醇:乙腈:水=1:3:6 流速：1.0mL/min色谱柱：Shim-pack GVP-ODS (4.6mm*10mm)；Shim-pack VP-ODS (4.6mm*150mm,5μm) 激发波长 365nm 发射波长 425nm 柱温：40 ℃进样量：10μL ■ 分析结果黄曲霉毒素B1（AFTB1）标样色谱图及分析结果图1 衍生后AFB1标样色谱图 图2 未衍生AFTB1标样色谱图AFTB1AFTB0.02.5 5.07.510.012.515.0min-0.10.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1mVDetector A:Ex:365nm,Em:425nm表1黄曲霉毒素B1分析结果化合物标样浓度(ng/mL)保留时间(min)峰面积峰高AFTB1 衍生10 3.36832924637098 AFTB1 未衍生10 6.721126851024 ■结论三氟乙酸柱前衍生法可用于AFTB1检测，增强其荧光强度，提高检测灵敏度。

高效液相色谱-柱后衍生法检测大米中黄曲霉毒素B1方法分析作者：陈强胜来源：《现代食品》 2018年第15期黄曲霉毒素B1 是黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的二次代谢产物，毒性强，分布范围广，在很多食品中普遍存在，对人类健康的危害性极大。

采用高效液相色谱- 柱后衍生法对黄曲霉毒素B1 有很好的检测效果。

高效液相色谱法是近年来发展起来的一种检测方法，其原理是在高效液相色谱仪上添加柱后衍生系统分离，再用荧光检测器测定。

与其配套的柱后衍生系统有碘衍生化法、溴衍生化法及较为先进的电化学衍生化法和光化学衍生化法。

当前，该方法大多用免疫亲和柱来净化、分离，其净化效果优异。

本文主要采用高效液相色谱- 柱后衍生法检测大米样品中的黄曲霉毒素B1，用乙腈- 水溶液的混合溶液提取，提取液经免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离，柱后（碘试剂衍生），经荧光检测器检测，外标法定量。

１试剂和材料甲醇（CH3OH），色谱纯；乙腈（CH3CN），色谱纯；氯化钠（NaCI）；磷酸氢二钠（Na2HPO4）；磷酸二氢钾（KH2PO4）；氯化钾（KCI）；盐酸（HCI）；TritonX-100；碘衍生使用试剂，碘（I2）；AFT B1 标准品（C17H12O6，CAS 号：1162-65-8），纯度≥ 98%，经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

2 仪器高效液相色谱仪，日本岛津LC-20A，配有柱后衍生系统和荧光检测器。

3 测定条件流动相：A 相，水；B 相，乙腈- 甲醇（50+50）。

低压梯度洗脱条件：A，55%；B，45%。

色谱柱，C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流速，1.0 mL/min；柱温，40 ℃；进样量，40 μL；衍生溶液，0.05% 碘溶液；衍生溶液流速，0.2 mL/min；衍生反应管温度，70 ℃；激发波长，360 nm；发射波长，440 nm[1]。

4 分析步骤按照国标GB 5009.22-2016 方法和黄曲霉毒素B1免疫亲和柱说明书处理大米样品。

食品中黄曲酶毒素的检测方法研究进展∗钱天元;单海峰;饶桂维【摘要】Aflatoxins are the carcinogens of typeⅠ. They are dangerous to human and animal’s health and safety through food or feed chains. The most effective method to control its negative impact is to fully understand their characteristics for conducting accurate and rapid detection. With the development of science and technology, great progress has been made in the detection of aflatoxin. The detection methods, such as thin layer chromatography ( TLC) , enzyme-linked immunoassay( ELISA) , HPLC, micro column screening( MS) , immunosensor, laser induced fluorescence method( LIF) , quick measure car and hyperspectral optimum wavelengths method, were reviewed. The prospect of the detection methods was also discussed.%黄曲霉毒素是Ⅰ类致癌物，通过食品或者饲料危害人类及动物的健康安全。

充分认识该毒素的性质，准确快速的检测食品中黄曲酶毒素是控制其危害的最有效手段。

免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生-高效液相色谱荧光法测定保和系列制剂中黄曲霉毒素刘亚蓉;逯雯洁;刘海青;金红宇;刘丽娜【期刊名称】《中成药》【年(卷),期】2012(034)004【摘要】目的研究建立光化学柱后衍生-高效液相色谱( HPLC) -荧光检测器测定保和系列制剂中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的方法.方法 70％甲醇提取样品,免疫亲和柱净化后,经高效液相色谱分离,由光化学柱后衍生,通过荧光检测器测定.结果在优化条件下,黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1分别在0.064 6～3.230 ng、0.1992 ～9.960 ng、0.0684～3.420ng、0.1954～9.770 ng的范围内有良好的线性关系,r＞0.9996,回收率在85.5％～ 114.6％之间,RSD＞8.结论该方法快速简便,灵敏度高、重现性好,对68个生产企业生产的3个剂型148批保和制剂进行了检测,结果表明该方法可作为保和系列制剂中黄曲霉毒素的检测,保和制剂黄曲霉毒素状况较好.【总页数】4页(P678-681)【作者】刘亚蓉;逯雯洁;刘海青;金红宇;刘丽娜【作者单位】中国食品药品检定研究院,北京100050【正文语种】中文【中图分类】R965.3【相关文献】1.免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生高效液相色谱法检测粮油中黄曲霉毒素 [J], 王江蓉2.免疫亲和柱净化一柱后光化学衍生-高效液相色谱法检测粮油中黄曲霉毒素 [J], 王江蓉;林华;刘纯友3.免疫亲和柱净化-光化学衍生高效液相色谱荧光法测定植物油中黄曲霉毒素B1的含量 [J], 周贻兵;刘利亚;李磊;林野;李雪春4.免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生-高效液相色谱法同时检测粮谷中的黄曲霉素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A [J], 李军;于一茫;田苗;王宏伟;卫锋;李莉;王雄5.免疫亲和柱净化-光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定粮食中黄曲霉毒素 [J], 方芳; 张旭; 郑睿行因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定本标准参考GB/T 5009.23-2006《食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》制定，适用于三河汇福生科技有限公司化验室测定原料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。

高效液相色谱法1 原理试样经乙腈-水提取，提取液过滤后，经装有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。

净化液中的黄曲霉毒素以三氟乙酸衍生，用带有荧光检测器的液相色谱系统分析，外标法定量。

2 试剂和材料2.1 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准品，纯度>99%。

2.2 乙腈，色谱纯、分析纯。

2.3 三氟乙酸，分析纯。

2.4 正己烷，分析纯。

2.5 水，电导率（25℃）≤0.01mS/m。

2.6 乙腈-水（84+16）提取液：量取乙腈（分析纯）840mL，加水160mL，混匀。

2.7 水-乙腈（85+15）溶液：量取乙腈（色谱纯）150mL，加三蒸水850mL，混匀。

2.8 标准储备液：分别准确称取黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 0.2000g、0.0500g、0.2000g、0.0500g（精确至0.001g），置10mL容量瓶中，加乙腈（分析纯）溶解，并稀释至刻度。

此溶液密封后避光-30℃保存，两年有效。

2.9 标准工作液：准确移取标准储备液1.00μL，至10mL容量瓶中，加乙腈（分析纯）稀释至刻度。

此溶液密封后避光4℃保存，三个月有效。

2.10 标准系列溶液：准确移取标准工作液适量，至10mL容量瓶中，加乙腈（分析纯）稀释至刻度（含黄曲霉毒素B1、G1的浓度为0.00μg/L、0.5000μg/L、1.000μg/L、2.000μg/L、5.000μg/L、10.00μg/L、25.00μg/L、50.00μg/L、100.0μg/L；黄曲霉毒素B2、G2的浓度为0.00μg/L、0.1250μg/L、0.2500μg/L、0.5000μg/L、1.250μg/L、2.500μg/L、6.250μg/L、12.50μg/L、25.00μg/L的系列标准溶液），注意避光。

食品中黄曲霉毒素的测定
食品中黄曲霉毒素的测定方法主要有以下几种：
1. 同位素稀释液相色谱-串联质谱法（ID-LC-MS/MS法）：该方法是目前测定食品中黄曲霉毒素的主要方法之一，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。

该方法使用同位素稀释液对样品进行稀释，然后通过液相色谱-串联质谱法进行分离和检测。

2. 高效液相色谱-柱前衍生法（HPLC-FLD法）：该方法是一种传统的测定方法，具有操作简便、成本低等优点。

该方法使用高效液相色谱进行分离，然后通过柱前衍生法进行检测。

3. 气相色谱-质谱法（GC-MS法）：该方法也是一种常用的测定方法，具有灵敏度高、准确性高等优点。

该方法使用气相色谱进行分离，然后通过质谱法进行检测。

4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）法：该方法是一种快速、简便、经济的测定方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点。

该方法使用特异性抗体进行检测。

以上是常见的几种食品中黄曲霉毒素的测定方法，具体选择哪种方法需要根据实际情况进行考虑。

多功能柱净化高效液相色谱法1．原理试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2用乙腈一水(84+16)提取，提取液经过滤、稀释后，用多功能柱净化。

净化液吹干后加入流淌相定容以液相色谱法荧光检测器测定各种黄曲霉毒素的含量，外标法定量。

2．试剂和材料甲醇(液相色谱纯)、乙腈(色谱纯)、硝酸(65％)、溴化钾、多功能净化柱(My-coseP226)。

黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标准品。

黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素Gl 2.0μg／L，黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2 0.5μg／L溶于乙腈中。

标准储备溶液：精确移取1．0mL上述黄曲霉毒素标准品溶液，以乙腈稀释至10．0mL作为标准储备溶液。

标准工作液：精确移取1.0mL 上述黄曲霉毒素标准储备溶液，以乙腈稀释至10．0mL作为标准工作液。

3．仪器称量天平、高速均质器、高效液相色谱仪(配荧光检测器)、柱后衍生扮装置、真菌毒素蒸发器、均质器、色谱柱(C18柱，柱长150mm，内径4．6mm，填料直径5μm)。

4．测定步骤 (1)提取称取试样约25g(精确至0.1g)于500mL具塞锥形瓶中，加入100mL乙腈一水(84+16，体积)提取液，以均质器高速搅拌提取3min，过滤。

(2)多功能柱净化吸取约55mL滤液加人多功能柱的试管中，将MFC柱套管套入试管内。

缓慢将套管推至试管底部，使提取液通过MFC柱进入套管中。

从套管内精确移取1．0mL净化液至5mL棕色小瓶中。

于50℃下吹干。

加人流淌相定容至0.5mL，过0.45μm滤膜供HPLC分析用。

(3)测定①色谱条件色谱柱：15cm×4．6mm(内径)，5μm，LiChroCART C18柱。

流淌相甲醇-乙腈-水(215+215+570，体积)，每升中加入120mg 溴化钾及200μL硝酸，流速1．0mL／min。

检测条件：激发波长365nm，放射波长440nm。

黄曲霉毒素检测方法介绍黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。

黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(aspergillus flavus) 寄生曲霉(a.parasiticus)产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。

B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到。

它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。

AFT目前已发现20余种。

AFT主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。

其中以花生和玉米污染最严重。

家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种捡出率更高。

主要的几种检验检疫方法:1,薄层层析法薄层层析(Thin-Layer Chromatography,TLC)是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术.自1990年,它被列为AOAC(Association of Official Agricultural Chemists)标准方法,该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能.2,液相色谱法液相色谱(LiquidChromatography,LC)与薄层层析在许多方面具有相似性,二者互相补充.通常用TLC进行前期的条件设定,选择适宜的分离条件后,再用LC进行黄曲霉毒素的定量测定.3,免疫化学分析方法利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法,也是最常用的黄曲霉毒素检测方法.这类方法通常包括放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA),酶联免疫法(Enzyme-linked of Immunosorbent Assay,ELISA)和免疫层析法(Immunoaflinity Column Assay,ICA).它们均可以对黄曲霉毒素进行定量测定.(1) 免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和术-HPLC法免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到速简便效果,但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素(如黄曲霉毒素B1)含量,而且易出现假阳性结果,难以控制.免疫亲和柱法(包括荧光光度法和HPLC法)却能达到既定量准确又快速简便的要求.免疫亲和柱的使用可以避免传统TLC和HPLC的缺点,同时免疫亲和柱与TLC和HPLC法结合可以大大提高工作效率,提高灵敏度和准确度.黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法是以单克隆免疫亲和柱为分离手段,用荧光计,紫外灯作为检测工具的快速分析方法.它克服了TLC和HPLC法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒,异味的有机溶剂,毒害操作人员和污染环境的缺点.同时黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法分析速度快,一个样品只需10-15min,比传统方法快几个小时甚至几天时间;仪器设备轻便容易携带,自动化程度高,操作简单,直接读出测试结果,可以在小型实验或现场使用.可以进行黄曲霉毒素总量(B1B2G1G2)的测定,检测限可达到1ug/kg,达到黄曲霉毒素标准限量值以下测定范围为1-300ug/kg.黄曲霉毒素免疫亲和柱-高效液相色谱法比传统的HPLC法更加安全,可靠,灵敏度和准确度高.它采用单克隆抗体免疫技术,可以特效性地将黄曲霉毒素或其他真菌毒素分离出来,分离效率和回收率高.分析原理试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液经过过滤,稀释后,用免疫亲和柱净化,以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来,在淋洗液中加入溴溶液衍生,以提高测定灵敏度,然后用荧光分光光度计进行定量.也可以将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中,对黄曲霉毒素B1,B2,G1,B2分别进行定量分析.免疫亲和柱是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上,然后装柱而成.该方法的测定范围0-300ug/kg.(2) 酶联免疫吸附法:1996年,Nakane建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术.由于该方法简便,敏感,特异,可作为多种抗原或抗体的测定,20世纪70年代后期,该方法引入真菌毒素的检测中,下面介绍的是竞争性酶联免疫吸附间接法检测黄曲霉毒素B1.原理:将已知抗原吸附在固态载体表面,洗除末吸附抗原,加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争培养后,在固相载体表面形成抗原抗体复合物.洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合,再加入酶底物.在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色物质,通过酶标检测仪测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量.(3) 微柱筛选法可以用来半定量测定各种食品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的总量.原理:样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管风硅镁型吸附层吸附后,在波长365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环,其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的光密度范围内成正比例关系.若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光,则样品为阴性(方法灵敏度为5-10ug/kg).由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量.(4) 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法.由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5-10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定.借助黄曲霉毒素标准样品,这种方法能估算黄曲霉毒素的含量,非常适用于现场测试和进行大量样品的初选.一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法.由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5-10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定.借助黄曲霉毒素标准样品,这种方法能估算黄曲霉毒素的含量,非常适用于现场测试和进行大量样品的初选.检测方法分析薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法,由于其检测周期长,程序复杂,所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求.随着现代科学技术的不断发展,特别是免疫学,生物化学,分子生物学的不断发展,人们已创建了不少快速,简便,特异,敏感,低耗且适用的黄曲霉毒素检测方法.而且以金标试纸为代表的这些方法已经被先进国家所广泛使用,引进和消化这些先进的方法是我们检测领域的当务之急.免疫亲和柱法优点很多,但由于检测费用过高,而无法普及.而一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法似乎更适用于我国,值得推广.。

食品中黄曲霉毒素B1柱后光化学衍生-高效液相色谱检测法
研究
黄轩
【期刊名称】《食品安全导刊》
【年(卷),期】2018(0)33
【摘要】在自然界中,由黄曲霉菌和寄生曲霉菌所分泌出的次级代谢产物中的一种就是黄曲霉素。

如果在粮食以及粮食为原料的食品中存在黄曲霉素,会导致这些粮食作物以及食品出现发霉现象。

黄曲霉素的致癌性以及毒性都非常强,在现如今人们所知道的致癌物质中属于最强的一种天然致癌物,对人们的日常生活安全产生了非常严重的威胁。

【总页数】1页(P103-103)
【关键词】食品安全;黄曲霉毒素B1;柱后光化学衍生
【作者】黄轩
【作者单位】铜川市产品质量监督检验所
【正文语种】中文
【中图分类】R735.7
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