网基实验08b

《计算机网络基础知识》教案一、教学目标1. 让学生了解计算机网络的定义、功能和分类。

2. 使学生掌握计算机网络的基本组成原理和常见的网络设备。

3. 培养学生理解网络协议和网络分层模型的概念。

4. 让学生了解互联网的基本结构和发展历程。

5. 使学生掌握局域网和广域网的组建、维护和管理方法。

二、教学内容1. 计算机网络的定义与功能1.1 计算机网络的定义1.2 计算机网络的功能2. 计算机网络的分类2.1 局域网（LAN）2.2 城域网（MAN）2.3 广域网（WAN）3. 计算机网络的基本组成原理3.1 网络设备3.2 通信协议3.3 网络拓扑结构4. 常见的网络设备4.1 交换机4.2 路由器4.3 网卡4.4 集线器4.5 网桥5. 网络协议与分层模型5.1 网络协议5.2 网络分层模型（OSI七层模型）三、教学方法1. 采用讲授法，讲解计算机网络的基本概念、原理和设备。

2. 运用案例分析法，分析实际网络应用场景，加深学生对网络知识的理解。

3. 利用实验教学法，让学生动手搭建简单网络，培养实际操作能力。

4. 开展小组讨论法，引导学生探讨网络技术的发展趋势。

四、教学资源1. 教材：《计算机网络基础知识》2. 课件：PowerPoint3. 网络设备：交换机、路由器、网卡、集线器、网桥等4. 实验工具：计算机、网线、水晶头、测速仪等五、教学评价1. 平时成绩：课堂表现、作业完成情况、小组讨论参与度等。

2. 考试成绩：理论知识考试、实验操作考试等。

3. 综合评价：学生对计算机网络知识的掌握程度、实际应用能力等。

六、教学重点与难点教学重点：1. 计算机网络的基本组成原理及常见网络设备的功能与作用。

2. 网络协议和分层模型的概念及其在网络通信中的应用。

3. 互联网的基本结构和发展历程。

4. 局域网和广域网的组建、维护与管理方法。

教学难点：1. 网络协议的复杂性和分层模型的理解。

2. 网络设备的工作原理和配置方法。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(3): 423 430 /zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家自然科学基金项目(30871471), 河北省自然科学基金项目(C2011205085), 河北省自然科学基金基地项目(08B019)和河北师范大学博士基金(L2005B20)资助。

*通讯作者(Corresponding author): 赵宝存, E-mail: baocunzh@, Tel: 0311-********第一作者联系方式: E-mail: linfangfang1227@Received(收稿日期): 2012-07-09; Accepted(接受日期): 2012-11-16; Published online(网络出版日期): 2013-01-04. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20130104.1734.013.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00423利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC 互作蛋白质蔺芳芳 杨 旭 武小翠 刘晓梅 葛荣朝 赵宝存*河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄 050024摘 要: TaSC (Triticum asetivum L. salt-tolerance related gene, GenBank 登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。

以该基因编码的蛋白质TaSC 为诱饵, 运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA 表达文库中钓取互作蛋白质, 筛选到一个编码小麦未知功能蛋白质的基因(GenBank 登录号为AK336035), 命名为TaSCIP1 (TaSC interaction protein 1)。

双分子荧光互补(BiFC)实验证实TaSCIP1与TaSC 存在互作。

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(５):８~１４ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０５.００２收稿日期:２０２２－０７－１０基金项目:湖南省重点研发计划项目(２０２１ＮＫ２０３０)ꎻ湖南省科技创新人才计划大学生科技创新创业项目(２０２１ＲＣ１０１６)ꎻ湖南省自然科学基金面上项目(２０２１ＪＪ３０３７６)ꎻ湖南省教育厅重点项目(２１Ａ０５５２)ꎻ湖南省区域联合基金项目(２０２３ＪＪ５００８４)ꎻ杂交水稻国家重点实验室(武汉大学)开放基金项目(ＫＦ２０２２０７)作者简介:马银花(１９８８ )ꎬ女ꎬ安徽亳州人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事水稻基因功能方面的研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｍａｙｉｎｈｕａ１９８８＠１２６.ｃｏｍ通信作者:段仁燕(１９７８ )ꎬ男ꎬ安徽安庆人ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事生态修复方面研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｄｕａｎｒｅｎｙａｎ７８＠１６３.ｃｏｍ水稻ＯｓＲＬＣＫ１６７基因的组织表达模式和生物信息学分析马银花１ꎬ刘桃梅１ꎬ万天雪１ꎬ肖新波１ꎬ胡琼１ꎬ李萍芳１ꎬ段仁燕１ꎬ张斌１ꎬ金晨钟１ꎬ杜波２(１.湖南人文科技学院农业与生物技术学院ꎬ湖南娄底㊀４１７０００ꎻ２.武汉大学生命科学学院/杂交水稻国家重点实验室ꎬ湖北武汉㊀４３００７２)㊀㊀摘要:类受体胞质激酶(ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｋｉｎａｓｅｓꎬＲＬＣＫｓ)家族是一类特殊蛋白激酶ꎬ在植物生长和病原菌防御中发挥着重要的生物学功能ꎮ在对水稻ＲＬＣＫⅥ家族成员ＯｓＲＲＫ１基因的研究中发现水稻４号染色体上存在一个与其同源性特别高的基因ꎬ即ＯｓＲＬＣＫ１６７(ＬＯＣ＿Ｏｓ０４ｇ５６０６０)ꎮ为了丰富类受体胞质激酶家族并探究水稻胞质受体激酶基因的作用ꎬ本研究利用ＥｘＰＡＳｙ－Ｐｒｏｔｐａｒａｍ㊁Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ㊁ＣＤ－ｓｅａｒｃｈ等在线工具和ＤＮＡＭＡＮ软件对ＯｓＲＬＣＫ１６７基因进行生物信息学分析ꎻ采用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术对ＯｓＲＬＣＫ１６７基因做组织表达模式分析ꎮ结果显示:ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的分子量为４３.７７７７６ｋＤꎬ为疏水性㊁不稳定的酸性蛋白ꎻ对该蛋白的二级结构进行预测ꎬ显示其主要由无规则卷曲(４１.９４％)㊁α－螺旋(３５.２９％)㊁延伸链(１５.３５％)和β－转角(７.４２％)组成ꎻ该基因在水稻不同组织均有表达ꎬ且在叶鞘中的表达量最高ꎮ结果表明ꎬＯｓＲＬＣＫ１６７基因在进化过程中具有高度的保守性ꎬ在水稻中具有功能多样性ꎮ关键词:水稻ꎻＯｓＲＬＣＫ１６７基因ꎻ组织表达模式ꎻ生物信息学分析中图分类号:Ｓ５１１.０１:Ｑ７８㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０５－０００８－０７ＴｉｓｓｕｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰａｔｔｅｒｎａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｓＲＬＣＫ１６７ＧｅｎｅｉｎＲｉｃｅＭａＹｉｎｈｕａ１ꎬＬｉｕＴａｏｍｅｉ１ꎬＷａｎＴｉａｎｘｕｅ１ꎬＸｉａｏＸｉｎｂｏ１ꎬＨｕＱｉｏｎｇ１ꎬＬｉＰｉｎｇｆａｎｇ１ꎬＤｕａｎＲｅｎｙａｎ１ꎬＺｈａｎｇＢｉｎ１ꎬＪｉｎＣｈｅｎｚｈｏｎｇ１ꎬＤｕＢｏ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＨｕｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｕｍａｎｉｔｉｅｓꎬＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＬｏｕｄｉ４１７０００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ/ＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｙｂｒｉｄＲｉｃｅꎬＷｕｈａｎ４３００７２ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｋｉｎａｓｅｓ(ＲＬＣＫｓ)ａｒｅａｓｐｅｃｉａｌｃｌａｓｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓｗｈｉｃｈｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｄｅｆｅｎｓｅ.ＩｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｈｅＯｓＲＲＫ１ｇｅｎｅꎬａｍｅｍ￣ｂｅｒｏｆｔｈｅｒｉｃｅＲＬＣＫⅥｆａｍｉｌｙꎬａｇｅｎｅｏｎｒｉｃｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ４ｗａｓｆｏｕｎｄｗｉｔｈｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｔｏｉｔꎬｎａｍｅｌｙＯｓＲＬＣＫ１６７(ＬＯＣ＿Ｏｓ０４ｇ５６０６０).ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｎｒｉｃｈｔｈｅｒｅｃｅｐｔｏｒｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｋｉｎａｓｅｆａｍｉｌｙａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｒｉｃｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｇｅｎｅꎬｔｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｓＲＬＣＫ１６７ｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｗｉｔｈｏｎｌｉｎｅｔｏｏｌｓｓｕｃｈａｓＥｘＰＡＳｙ￣ＰｒｏｔｐａｒａｍꎬＰｒｏｔｓｃａｌｅꎬＣＤ￣ｓｅａｒｃｈａｎｄＤＮＡＭＡＮｓｏｆｔｗａｒｅꎬａｎｄｉｔｓｔｉｓｓｕｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆＯｓＲＬＣＫ１６７ｐｒｏ￣ｔｅｉｎｗａｓ４３.７７７７６ｋＤꎬａｎｄｉｔｗａｓａｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｎｄｕｎｓｔａｂｌｅａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ.Ｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｉｔｓｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｔｗａｓｍａｉｎｌｙｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆｒａｎｄｏｍｃｕｒｌ(４１.９４％)ꎬα￣ｈｅｌｉｘ(３５.２９％)ꎬｅｘｔｅｎｄｅｄｃｈａｉｎ(１５.３５％)ａｎｄβ￣ｔｕｒｎ(７.４２％).Ｔｈｅｇｅｎｅｃｏｕｌｄｅｘｐｒｅｓｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｒｉｃｅꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｌｅａｆｓｈｅａｔｈｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ.ＡｌｌｔｈｅｓｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅＯｓＲＬＣＫ１６７ｇｅｎｅｗａｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅｅｖｏｌｕ￣ｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓａｎｄｈａｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｒｉｃｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｒｉｃｅ(ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.)ꎻＯｓＲＬＣＫ１６７ｇｅｎｅꎻＴｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎꎻＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀类受体胞质激酶(ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｋｉｎａｓｅｓꎬＲＬＣＫｓ)是一类只含有胞内激酶结构域㊁无胞外信号肽结构域和跨膜结构域的特殊蛋白激酶家族ꎬ在植物的生长发育㊁病原菌防御㊁胁迫等过程中发挥着重要的生物学功能[１－４]ꎮ研究表明这类蛋白在拟南芥中有２００个成员ꎬ水稻中有３７９个成员ꎬ根据氨基酸序列的系统发育分支ꎬＲＬＣＫｓ在拟南芥中被分为１３个亚家族ꎬ在水稻中被划分为１７个亚家族[３－６]ꎬ其在植物中通过磷酸化下游靶蛋白发挥功能ꎬ主要参与了植物的生长㊁信号转导㊁非生物胁迫和生物胁迫应答等生理过程[７]ꎮ其中研究最多的为ＲＬＣＫⅦ亚家族在植物免疫中的作用ꎬ有关ＲＬＣＫⅥ亚家族基因的研究很少ꎮ对ＯｓＲＬＣＫ５７㊁ＯｓＲＬＣＫ１０７㊁ＯｓＲＬＣＫ１１８和ＯｓＲＬＣＫ１７６功能特性进行的研究表明ꎬ其参与了ＸＡ２１介导的水稻先天免疫和ＢＲ信号介导的水稻发育[８]ꎻＯｓＲＬＣＫ１０２是ＲＬＣＫⅦ亚族蛋白基因ꎬ同时受生物与非生物胁迫的诱导表达ꎬ参与了水稻的生长发育与免疫反应的调控[９ꎬ１０]ꎮ近些年ꎬ拟南芥中ＲＬＣＫⅥ亚家族蛋白参与植物生长与病原体防御相继被报道ꎬ如Ｒｏｐ结合蛋白激酶１和２(ＲＢＫ１和２)直接结合ＡｔＲｏｐ４ＧＴＰａｓｅꎬ是植物生长和病原体防御中多种信号传导途径的重要调节子[１１]ꎻＲｏｐ相互作用类受体激酶１和２(ＡｔＲＲＫ１和２)可以在体外被ＧＴＰ结合的ＲｏｐＧＴＰ酶特异性激活[１２]ꎻ属于ＲＬＣＫⅦ亚家族的ＢＩＫ１和ＰＢＬ１与细胞膜上的受体激酶ＦＬＳ２和ＢＡＫ１相互作用ꎬ并且ＢＩＫ１和ＰＢＬ１在ＦＬＳ２被其配体ｆｌｇ２２激活时迅速磷酸化ꎬｂｉｋ１和ｐｂｌ１突变体在其ＦＬＳ２介导的免疫应答中表现出表型缺陷ꎬ表明ＢＩＫ１和ＰＢＬ１在ＦＬＳ２和ＢＡＫ１的相互作用介导的ＰＴＩ信号传导过程中具有重要作用[１３ꎬ１４]ꎮ与拟南芥ＲＬＣＫⅥ亚家族相比ꎬ对于水稻中ＲＬＣＫⅥ亚家族基因的研究报道更为稀少ꎮＯｓ￣ＲＲＫ１(对应编号为ＯｓＲＬＣＫ２１６)是一个与ＯｓＬｅｃ￣ＲＫ相互作用的蛋白ꎬ也是少有被报道过的水稻ＲＬＣＫⅥ亚家族成员ꎬ研究发现ＯｓＲＲＫ１在叶片发育与稻飞虱抗性等方面发挥着重要作用ꎻＯｓ￣ＲＲＫ１基因的过表达能使得水稻叶片卷曲ꎬ表明ＲＬＣＫⅥ亚家族可能在水稻发育和免疫方面发挥作用[４ꎬ１５－１７]ꎮ前期课题组在对ＯｓＲＲＫ１基因与其他ＲＬＣＫⅥ亚家族成员同源蛋白的系统发育分析研究中发现ＯｓＲＬＣＫ１６７与其同源性很高ꎬ同属于ＲＬＣＫⅥ家族成员ꎮ利用生物信息学分析可以研究蛋白质序列㊁结构以及功能ꎬ并对蛋白质进行同源分析ꎬ研究蛋白质之间的进化关系ꎬ揭示蛋白质家族间的关系[１８－２０]ꎮ因此对ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的理化性质㊁蛋白结构等方面进行生物学信息学分析ꎬ可为深入研究其生物学特征提供一定理论基础ꎻ通过荧光定量ＰＣＲ对ＯｓＲＬＣＫ１６７进行组织表达模式分析ꎬ推测其在水稻叶片生长发育过程中可能发挥的作用能进一步丰富对水稻ＲＬＣＫⅥ亚家族基因功能的研究ꎬ深化对该家族基因的认识ꎬ以期为深入探究水稻ＲＬＣＫⅥ亚家族蛋白在水稻中的生物学功能和挖掘水稻抗性新基因提供一定的理论基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料粳稻品种Ｈｅｊｉａｎｇ１９(Ｈ１４９３)购自国家种质资源库ꎬ用于提取水稻ＲＮＡꎻＯｓＲＲＫ１和ＯｓＲＬ￣ＣＫ１６７的ＯＲＦ序列ꎻＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ菌株ＴＯＰ１０为武汉大学杂交水稻国家重点实验室何光存教授课题组提供ꎮ１.２㊀生物学信息分析运用ＥｘＰＡＳｙ－Ｐｒｏｔｐａｒａｍ㊁Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ㊁ＮＣＢＩ网站的ＣＤ－ｓｅａｒｃｈ㊁ＳＯＰＭＡ㊁Ｐｈｙｒｅ和Ｐｓｏｒｔ等在线工具对ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的理化性质㊁二级结构㊁三级结构和亚细胞定位进行生物信息学预测与分析ꎮ９㊀第５期㊀㊀㊀㊀马银花ꎬ等:水稻ＯｓＲＬＣＫ１６７基因的组织表达模式和生物信息学分析１.３㊀同源基因序列比对与进化树分析通过ＤＮＡＭＡＮ软件将ＯｓＲＬＣＫ１６７基因与ＯｓＲＲＫ１基因进行序列比对ꎬ再用ＭＥＧＡ５.１０对ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白㊁水稻中与ＯｓＲＬＣＫ１６７相似性较高的５个ＲＬＣＫ和拟南芥ＲＬＣＫⅥＡ家族的７个成员构建系统发育进化树ꎮ１.４㊀组织表达模式分析采用ＴＲＩｚｏｌ试剂(ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎꎬＵＳＡ)提取粳稻品种Ｈｅｊｉａｎｇ１９(Ｈ１４９３)的幼芽㊁幼根㊁二分蘖期的根㊁二分蘖期的叶㊁成熟期的剑叶㊁倒二叶㊁茎㊁叶鞘㊁幼穗等组织ｍＲＮＡꎻＲＮＡ的反转录按Ｒｅｖｅｒ￣ｔＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ(Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ)的操作步骤进行ꎻ用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５.０软件设计特异性引物ｑＲＴ－ＯｓＲＬＣＫ１６７ｆ:５ᶄ－ＣＣＴＣＧＴＣＣＴ￣ＴＣＣＣＴＣＴＣＧＴＧ－３ᶄ和ｑＲＴ－ＯｓＲＬＣＫ１６７ｒ:５ᶄ－ＣＴ￣ＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣ－３ᶄꎻ以反转录产物为模板ꎬ以水稻Ａｃｔｉｎ基因为内参ꎬ利用实时荧光定量ＰＣＲ(ｑＲＴ－ＰＣＲ)分析ＯｓＲＬＣＫ１６７在不同组织中的表达模式ꎬ每个样品３次重复ꎮＰＣＲ反应体系:ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅｄｄＨ２Ｏ(ＴＩＡＮＧＥＮ)２.９μＬꎬ２ˑＳｕｐｅｒｍｉｘ４μＬꎬ上㊁下游引物(５ｍｍｏｌ/Ｌ)各０.３μＬꎬｃＤＮＡ模板０.５μＬꎮ反应程序:９５ħ变性２ｍｉｎꎻ９５ħ变性５ｓꎻ６０ħ退火２０ｓꎬ共４０个循环ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的生物信息学分析２.１.１㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的理化性质分析㊀ＯｓＲＬ￣ＣＫ１６７基因编码含有３９１个氨基酸的蛋白质ꎬ通过ＥｘＰＡＳｙ－Ｐｒｏｔｐａｒａｍ在线工具对ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的理化性质进行分析ꎬ结果显示该蛋白分子式为Ｃ１９２０Ｈ２９５１Ｎ５４７Ｏ６００Ｓ１５ꎻ相对分子量为４３.７７７７６ｋＤꎻ理论等电点为４.８７ꎻ富含强碱性氨基酸(Ａｒｇ㊁Ｌｙｓ共４２个)和强酸性氨基酸(Ａｓｐ㊁Ｇｌｕ共６７个)ꎬ蛋白质不稳定指数为４７.３５ꎬ为不稳定蛋白ꎬ脂肪系数为７７.８３ꎮ氨基酸组成分析结果表明ꎬ天冬氨酸(Ａｓｐ)㊁亮氨酸(Ｌｅｕ)㊁丙氨酸(Ａｌａ)㊁甘氨酸(Ｇｌｙ)㊁精氨酸(Ａｒｇ)㊁丝氨酸(Ｓｅｒ)㊁谷氨酸(Ｇｌｕ)所占比例较高ꎬ分别为１０.０％㊁９.７％㊁７.７％㊁７.７％㊁７.４％㊁７.４％㊁７.２％ꎬ甲硫氨酸(Ｍｅｔ)和谷氨酰胺(Ｇｌｎ)占比较低ꎬ分别为１.５％和１.８％(表１)ꎮＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的亲水性预测表明ꎬＯｓＲＬ￣ＣＫ１６７蛋白的氨基酸组成中大多为疏水性氨基酸ꎬ因此该蛋白为疏水性蛋白(图１)ꎮ综上ꎬＯｓＲ￣ＬＣＫ１６７蛋白是一个疏水性的㊁不稳定的酸性蛋白ꎮ㊀㊀表１㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的氨基酸含量氨基酸数量百分比(％)Ａｌａ(Ａ)３０７.７Ａｒｇ(Ｒ)２９７.４Ａｓｎ(Ｎ)１５３.８Ａｓｐ(Ｄ)３９１０.０Ｃｙｓ(Ｃ)９２.３Ｇｌｎ(Ｑ)７１.８Ｇｌｕ(Ｅ)２８７.２Ｇｌｙ(Ｇ)３０７.７Ｈｉｓ(Ｈ)１３３.３Ｉｌｅ(Ｉ)１３３.３Ｌｅｕ(Ｌ)３８９.７Ｌｙｓ(Ｋ)１３３.３Ｍｅｔ(Ｍ)６１.５Ｐｈｅ(Ｆ)１６４.１Ｐｒｏ(Ｐ)１９４.９Ｓｅｒ(Ｓ)２９７.４Ｔｈｒ(Ｔ)１３３.３Ｔｒｐ(Ｗ)８２.０Ｔｙｒ(Ｙ)１０２.６Ｖａｌ(Ｖ)２６６.６ｓｃｏｒｅ值代表氨基酸残基疏水性的分值ꎬ分值越高疏水性越强ꎬ分值越低亲水性越强ꎮ图１㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的疏水性/亲水性预测分析２.１.２㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白保守功能域的预测㊀通过ＮＣＢＩ网站的ＣＤ－ｓｅａｒｃｈ工具对ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的保守功能域进行预测ꎬＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白特定匹配(ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｉｔｓ)在ＳＰＳ１ꎬ非特定匹配(ｎｏｎ－ｓｐｅ￣ｃｉｆｉｃ)在ＳＴＫｃ＿ＩＲＡＫ(图２)ꎬ因此ꎬＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白属于ＰＫｃ＿ｌｉｋｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ(ＲＫｃ＿ｌｉｋｅ超级家族)ꎮ０１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀图２㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的保守功能域２.１.３㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的二级结构预测㊀通过在线网站ＳＯＰＭＡ预测ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的二级结构ꎬ结果表明ꎬＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的二级结构主要由无规则卷曲(ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ４１.９４％)㊁α－螺旋(ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ３５.２９％)㊁延伸链(ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ１５.３５％)和β－转角(ｂｅｔａｔｕｒｎ７.４２％)组成(图３)ꎮ因此ꎬ该蛋白晶体的空间构象可能以无规则卷曲结构为基础所构成的ꎮ蓝色表示α－螺旋ꎬ红色表示延伸链ꎬ绿色表示β－转角ꎬ紫色表示无规则卷曲ꎮ图３㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的二级结构预测２.１.４㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的三级结构预测㊀通过在线软件Ｐｈｙｒｅ对ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白三级结构模型进行预测分析表明ꎬ该蛋白由α－螺旋(ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ)㊁β－转角(ｂｅｔａｔｕｒｎ)和无规则卷曲(ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ)连接而成(图４)ꎮ图４㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的三级结构预测２.１.５㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的亚细胞定位㊀通过在线网站Ｐｓｏｒｔ进行预测分析表明ꎬ该蛋白最可能定位于细胞质ꎬ这与ＯｓＲＲＫ１蛋白的亚细胞定位在细胞质的结果一致[１６]ꎬ其次可能定位于线粒体㊁细胞核和内质网ꎬ定位于分泌系统囊泡和液泡的可能性较低(表２)ꎮ㊀㊀表２㊀㊀㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的亚细胞定位亚细胞结构可能性(％)细胞质３９.１线粒体２１.７细胞核１７.４内质网１３.０分泌系统囊泡４.３液泡４.３１１㊀第５期㊀㊀㊀㊀马银花ꎬ等:水稻ＯｓＲＬＣＫ１６７基因的组织表达模式和生物信息学分析２.２㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７同源基因序列比对与进化分析对ＯｓＲＲＫ１及同源基因ＯｓＲＬＣＫ１６７序列进行比对分析发现ꎬＯｓＲＲＫ１的ＯＲＦ序列为１１７９ｂｐꎬＯｓＲＬＣＫ１６７的ＯＲＦ序列是１１７６ｂｐꎬ两者长度接近ꎮＯｓＲＬＣＫ１６７含有６个外显子㊁５个内含子ꎮ用ＤＮＡＭＡＮ软件将两者的ＯＲＦ序列进行比对ꎬ两者的一致性达７０.０６％(图５)ꎮ图５㊀水稻ＯｓＲＲＫ１与ＯｓＲＬＣＫ１６７的序列比对㊀㊀将ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白㊁水稻中与ＯｓＲＬＣＫ１６７相似性较高的５个ＲＬＣＫ和拟南芥ＲＬＣＫⅥＡ家族的７个成员做亲缘关系分析发现ꎬＯｓＲＲＫ１与ＲＬＣＫⅥＡ亚家族亲缘关系最近ꎻ进化树分析结果表明ꎬＯｓＲＬＣＫ１６７属于ＲＬＣＫⅥＡ亚家族成员ꎬ并且与水稻中的ＯｓＲＲＫ１同源性最高(图６)ꎮ２.３㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７基因的组织表达模式分析由图７可知ꎬＯｓＲＬＣＫ１６７基因在叶鞘中的表达量最高ꎬ其次是在剑叶和倒二叶中ꎻ在幼芽㊁幼根㊁二分蘖期的根中表达量很低ꎻ二分蘖期的叶㊁茎和幼穗中表达量较低ꎮＯｓＲＲＫ１基因在所检测的组织中都有表达ꎬ是一个组成性表达基因ꎻＯｓ￣ＲＲＫ１基因在水稻生长发育的各个时期都有表达ꎬ在叶片中的表达量较高ꎬ在抽穗期的剑叶中表达量最高[１７]ꎮ通过对比分析表明ꎬＯｓＲＲＫ１和Ｏｓ￣ＲＬＣＫ１６７并非同一基因ꎬ在不同组织中表达量存在一定差异ꎻ另一方面ꎬＯｓＲＲＫ１和ＯｓＲＬＣＫ１６７是同源基因ꎬ且在水稻生长发育的各个时期都有表达ꎬ但组织表达模式完全不同ꎬ这暗示两个基因虽然结构上相似ꎬ但基因功能可能不同ꎮ㊀ＯｓＲＲＫ１:ＸＰ＿０１５６４２１７７.１ꎻＯｓＲＬＣＫ２１２:ＸＰ＿０１５６４２８７０.１ꎻ㊀ＯｓＲＬＣＫ２４９:ＸＰ＿０１５６４８９３８.１ꎻＯｓＲＬＣＫ１６７:ＸＰ＿０１５６３４２７６.１ꎻ㊀ＯｓＲＬＣＫ３４２:ＡＢＡ９５０４３.１ꎻＯｓＲＬＣＫ１８１:ＸＰ＿０１５６４０２７３.１ꎻ㊀ＡｔＲＬＣＫⅥ＿Ａ１:ＮＰ＿００１０７８７６２.１ꎻＡｔＲＬＣＫⅥ＿Ａ２:ＮＰ＿１７９４７９.１ꎻ㊀ＡｔＲＬＣＫⅥ＿Ａ３:ＮＰ＿２０１３５６.２ꎻＡｔＲＬＣＫⅥ＿Ａ４:ＮＰ＿５６８２３１.１ꎻ㊀ＡｔＲＬＣＫⅥ＿Ａ５:ＮＰ＿１９８４４５.１ꎻＡｔＲＬＣＫⅥ＿Ａ６:ＮＰ＿００１３２７８８９.１ꎻＡｔＲＬＣＫⅥ＿Ａ７:ＮＰ＿１９７３９２.２ꎮ图６㊀ＯｓＲＲＫ１与拟南芥和水稻中其他㊀㊀ＲＬＣＫ家族的进化分析２１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀图７㊀ＯｓＲＬＣＫ１６７基因在水稻不同组织中的表达量３㊀讨论与结论ＲＬＣＫ家族基因存在多种植物中ꎬ并在植物生长㊁发育㊁防御等方面起着重要作用ꎮ采用生物信息学方法进行分析ꎬ约６０％的水稻ＲＬＣＫ基因序列中含有至少５个内含子ꎬ３７９个水稻ＲＬＣＫ基因的内含子数目从０到２６个不等ꎬ约７０％左右的ＲＬＣＫ蛋白序列中只含有１个蛋白激酶结构域ꎬ且参与许多重要的生理过程[３ꎬ７ꎬ１１ꎬ２１ꎬ２２]ꎮ而ＯｓＲＬ￣ＣＫ１６７蛋白属于ＲＬＣＫⅥＡ亚家族成员ꎬ并且与水稻中的ＯｓＲＲＫ１同源性最高ꎬ从基因序列对比来看ꎬＯｓＲＬＣＫ１６７与ＯｓＲＲＫ１序列长度十分接近ꎬ一致性达到７０.０６％ꎬ且ＯｓＲＬＣＫ１６７基因在根㊁茎㊁叶㊁叶鞘等均有表达ꎬ说明ＯｓＲＬＣＫ１６７基因可能与ＯｓＲＲＫ１基因一样参与多个组织器官的发育过程ꎮ前期研究已发现ＯｓＲＲＫ１与水稻植株叶片直立有关ꎬＯｓＲＬＣＫ１６７也与水稻叶片生长发育相关ꎬ其在水稻生长发育中的功能可能与ＯｓＲＲＫ１相似ꎬ但基因功能可能不同ꎻ将ＯｓＲＲＫ１抑制表达的转基因植株与野生植株对比ꎬ没有产生显著的表型差异ꎬ且发现其同源基因ＯｓＲＬＣＫ１６７在Ｏｓ￣ＲＲＫ１抑制表达转基因植物中的表达量与野生型相比并无差异ꎮ据此我们推测ꎬ抑制ＯｓＲＲＫ１基因的表达并不影响水稻叶发育表型的原因可能是ＯｓＲＲＫ１基因与同源基因ＯｓＲＬＣＫ１６７存在功能冗余关系ꎮ本研究表明ꎬＯｓＲＬＣＫ１６７是一个具有疏水性㊁保守的㊁酸性㊁不稳定蛋白ꎬ以高水平㊁保守方式调控水稻多个生物学过程ꎬ且与同源基因Ｏｓ￣ＲＲＫ１在组织表达模式上相似ꎮ本研究进一步丰富了对ＲＬＣＫⅥ亚家族基因的研究ꎬ为后续深入研究ＯｓＲＬＣＫ１６７蛋白的不同生理功能提供了理论基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＬｉｎＦＭꎬＬｉＳꎬＷａｎｇＫꎬｅｔａｌ.Ｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅＯｓＡＳＬＲＫｒｅｇｕｌａｔｅｓｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].Ｊｏｕｒ￣ｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ２０２１ꎬ２０(７):１７３１－１７４２. [２]㊀ＬｉｕＴꎬＪｉａｎｇＧＱꎬＹａｏＸＦꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｌｅｕｃｉｎｅ￣ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｒｅ￣ｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅＯｓＥＲＬｐｌａｙｓａｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｉｎａｎｔｈｅｒｌｏｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２０２１ꎬ５６３:８５－９１.[３]㊀ＶｉｊＳꎬＧｉｒｉＪꎬＤａｎｓａｎａＰＫꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｃｙｔｏｐｌａｓ￣ｍｉｃｋｉｎａｓｅ(ＯｓＲＬＣＫ)ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｒｉｃｅ:ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎꎬｐｈｙ￣ｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐꎬａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｐｌａｎｔꎬ２００８ꎬ１(５):７３２－７５０. [４]㊀马银花ꎬ莫凯琴ꎬ刘璐ꎬ等.过量表达ＯｓＲＲＫ１对水稻叶片发育的影响[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２１ꎬ５４(５):８７７－８８６. [５]㊀ＪｕｒｃａＭＥꎬＢｏｔｔｋａＳꎬＦｅｈéｒＡ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｆａｍｉｌｙｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｋｉｎａｓｅｓ(ＲＬＣＫｃｌａｓｓⅥ)[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２００８ꎬ２７:７３９－７４８. [６]㊀ＳｈｉｕＳＨꎬＫａｒｌｏｗｓｋｉＷＭꎬＰａｎＲꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅｆａｍｉｌｙｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｎｄｒｉｃｅ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２００４ꎬ１６(５):１２２０－１２３４.[７]㊀何含杰ꎬ张党权ꎬ唐丽ꎬ等.植物ＲＬＣＫ的生物学功能与信号途径研究进展[Ｊ].植物生理学报ꎬ２０１４ꎬ５０(７):８８５－８９０. [８]㊀ＺｈｏｕＸＧꎬＷａｎｇＪꎬＰｅｎｇＣＦꎬｅｔａｌ.Ｆｏｕｒｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｃｙｔｏ￣ｐｌａｓｍｉｃｋｉｎａｓｅｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔꎬＣｅｌｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔꎬ２０１６ꎬ３９(６):１３８１－１３９２. [９]㊀ＷａｎｇＪꎬＷｕＧＷꎬＰｅｎｇＣＦꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｃｙｔｏ￣ｐｌａｓｍｉｃｋｉｎａｓｅＯｓＲＬＣＫ１０２ｒｅｇｕｌａｔｅｓＸＡ２１￣ｍｅｄｉａｔｅｄｉｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅ￣ｐｏｒｔｅｒꎬ２０１６ꎬ３４(３):６２８－６３７.[１０]吴文冠.ＯｓＲＬＣＫ１０２调控水稻生长发育及ＸＡ２１介导的免疫反应[Ｄ].雅安:四川农业大学ꎬ２０１５.[１１]ＭｏｌｅｎｄｉｊｋＡＪꎬＲｕｐｅｒｔｉＢꎬＳｉｎｇｈＭＫꎬｅｔａｌ.Ａｃｙｓｔｅｉｎｅ￣ｒｉｃｈｒｅ￣ｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅＮＣＲＫａｎｄａｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉ￣ｎａｓｅＲＢＫ１ａｒｅＲｏｐＧＴＰａｓｅｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００８ꎬ５３(６):９０９－９２３.[１２]ＤｏｒｊｇｏｔｏｖＤꎬＪｕｒｃａＭＥꎬＦｏｄｏｒ￣ＤｕｎａｉＣꎬｅｔａｌ.ＰｌａｎｔＲｈｏ￣ｔｙｐｅ(Ｒｏｐ)ＧＴＰａｓｅ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｃｙｔｏｐｌａｓ￣ｍｉｃｋｉｎａｓｅｓｉｎｖｉｔｒｏ[Ｊ].ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓꎬ２００９ꎬ５８３(７):１１７５－１１８２.[１３]ＬｕＤＰꎬＷｕＳＪꎬＧａｏＸＱꎬｅｔａｌ.Ａｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｋｉｎａｓｅꎬＢＩＫ１ꎬａｓｓｏｃｉａｔｅｓｗｉｔｈａｆｌａｇｅｌｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏｍｐｌｅｘｔｏｉｎｉｔｉａｔｅｐｌａｎｔｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１０ꎬ１０７(１):４９６－５０１.[１４]ＺｈａｎｇＪꎬＬｉＷꎬＸｉａｎｇＴＴꎬｅｔａｌ.Ｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｋｉ￣ｎａｓｅｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｆｒｏｍｍｕｌｔｉｐｌｅｐｌａｎｔｉｍｍｕｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ３１㊀第５期㊀㊀㊀㊀马银花ꎬ等:水稻ＯｓＲＬＣＫ１６７基因的组织表达模式和生物信息学分析ａｎｄａｒｅｔａｒｇｅｔｅｄｂｙａＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｅｆｆｅｃｔｏｒ[Ｊ].ＣｅｌｌＨｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅꎬ２０１０ꎬ７(４):２９０－３０１.[１５]马银花ꎬ李萍芳ꎬ董文静ꎬ等.水稻抗性蛋白ＯｓＲＲＫ１抗褐飞虱机理分析[Ｊ].中国水稻科学２０２０ꎬ３４(６):５１２－５１９. [１６]马银花ꎬ李萍芳ꎬ何雨航ꎬ等.水稻ＯｓＲＲＫ１蛋白的进化分析及其亚细胞定位[Ｊ].信阳师范学院学报(自然科学版)ꎬ２０２０ꎬ３３(３):３７１－３７６.[１７]ＭａＹＨꎬＺｈａｏＹꎬＳｈａｎｇｇｕａｎＸＸꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯｓＲＲＫ１ｃｈａｎｇｅｓｌｅａｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｄｅｆｅｎｓｅｔｏｉｎｓｅｃｔｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ８:１７８３.[１８]王荣花ꎬ王树彬ꎬ刘栓桃ꎬ等.大白菜ＬＡＣＳ家族基因鉴定与表达分析[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２２ꎬ５４(６):１－９. [１９]于秋鸿ꎬ曾黎ꎬ宋希云ꎬ等.玉米ＺｍＧｌｙ３基因的生物信息学与表达特性分析[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２２ꎬ５４(１０):１１－１６. [２０]何雨航ꎬ杜易桓ꎬ郭昊ꎬ等.水稻ＯｓＥＮＯＤ９３ｂ基因组织表达模式与生物信息学分析[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０２１ꎬ４９(７):６７－７１.[２１]ＳｈｅｎＷꎬＧóｍｅｚ￣ＣａｄｅｎａｓＡꎬＲｏｕｔｌｙＥＬꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｇｅｎｅꎬＥｓｉ４７ꎬｆｒｏｍｔｈｅｓａｌｔ￣ｔｏｌｅｒａｎｔｗｈｅａｔｇｒａｓｓＬｏｐｈｏｐｙｒｕｍｅｌｏｎｇａｔｕｍｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｌａｎｔｈｏｒｍｏｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００１ꎬ１２５(３):１４２９－１４４１. [２２]ＺｈｏｕＪＭꎬＬｏｈＹＴꎬＢｒｅｓｓａｎＲＡꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｏｍａｔｏｇｅｎｅＰｔｉ１ｅｎｃｏｄｅｓａｓｅｒｉｎｅ/ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｋｉｎａｓｅｔｈａｔｉｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｂｙＰｔｏａｎｄｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ１９９５ꎬ８３(６):９２５－９３５.４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀。

实验名称：网络安全综合实验实验时间： 2023年11月15日实验地点：北京航空航天大学计算机学院实验室实验人员： [姓名]一、实验目的1. 深入理解网络安全的基本概念和原理。

2. 掌握网络安全设备的配置与调试方法。

3. 熟悉网络安全攻防技术，提高安全意识。

4. 培养动手实践能力和团队合作精神。

二、实验内容本次实验主要包括以下内容：1. 路由器配置实验：学习路由器的基本配置，包括IP地址、子网掩码、默认网关等，并实现网络的互连互通。

2. APP欺骗攻击与防御实验：学习APP欺骗攻击的原理，并尝试防御此类攻击。

3. 源IP地址欺骗攻击防御实验：学习源IP地址欺骗攻击的原理，并尝试防御此类攻击。

4. DHCP欺骗攻击与防御实验：学习DHCP欺骗攻击的原理，并尝试防御此类攻击。

5. 密码实验：学习密码学的基本原理，并尝试破解简单的密码。

6. MD5编程实验：学习MD5算法的原理，并实现MD5加密程序。

7. 数字签名综合实验：学习数字签名的原理，并尝试实现数字签名程序。

8. RIP路由项欺骗攻击实验：学习RIP路由项欺骗攻击的原理，并尝试防御此类攻击。

9. 流量管制实验：学习流量管制的原理，并尝试实现流量控制。

10. 网络地址转换实验：学习网络地址转换的原理，并尝试实现NAT功能。

11. 防火墙实验：学习防火墙的配置与调试方法，并尝试设置防火墙规则。

12. 入侵检测实验：学习入侵检测的原理，并尝试实现入侵检测系统。

13. WEP配置实验：学习WEP加密协议的配置方法，并尝试破解WEP加密。

14. 点对点IP隧道实验：学习点对点IP隧道的配置方法，并尝试实现VPN功能。

三、实验步骤1. 路由器配置实验：- 搭建实验环境，连接路由器。

- 配置路由器的IP地址、子网掩码、默认网关等。

- 通过ping命令测试网络连通性。

2. APP欺骗攻击与防御实验：- 利用欺骗软件模拟APP欺骗攻击。

- 分析欺骗攻击的原理，并尝试防御此类攻击。

㊀㊀2023年6月第38卷第3期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY㊀Vol.38No.3Jun.2023㊀收稿日期:2022-09-13;修回日期:2022-12-16;出版日期:2023-06-15基金项目:科技部科技伙伴计划资助项目(KY202002007);河南省科技攻关项目(212102110018);河南省农业科学院自主创新项目(2022ZC59);河南省农业科学院新兴学科发展专项项目(2022XK01)作者简介:赵甜甜(1998 ),女,河南省周口市人,河南工业大学硕士研究生,主要研究方向为食品资源开发与利用㊂E-mail :1428572510@ ㊂通信作者:张国治(1964 ),男,河南省开封市人,河南工业大学教授,主要研究方向为食品资源开发与利用㊂E-mail :zgzhi11@㊂赵甜甜,张国治,王赵改,等.两种市售香椿茶主要活性成分㊁抗氧化活性及挥发性成分的对比分析[J].轻工学报,2023,38(3):35-45.ZHAO T T,ZHANG G Z,WANG Z G,et parative analysis of main active components,antioxidant activity and volatile compounds of two commercial Toona sinensis tea[J].Journal of Light Industry,2023,38(3):35-45.DOI:10.12187/2023.03.005两种市售香椿茶主要活性成分、抗氧化活性及挥发性成分的对比分析赵甜甜1,2,张国治1,王赵改2,蒋鹏飞21.河南工业大学粮油食品学院,河南郑州450001;2.河南省农业科学院农副产品加工研究中心,河南郑州450002摘要:以两种市售香椿茶(三一香椿茶和安徽香椿茶)为研究对象,采用对比实验,借助紫外分光光度法㊁气相色谱-质谱(GC-MS )联用技术和气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS )联用技术检测并对比分析其主要活性成分㊁抗氧化活性及挥发性成分的差异㊂结果表明:三一香椿茶的酚氨比和咖啡碱含量均比安徽香椿茶高,而其他活性成分(如水浸出物㊁游离氨基酸㊁茶多酚等)含量与此相反㊂三一香椿茶的DPPH 自由基清除能力和总还原能力均略低于安徽香椿茶,但㊃OH 清除能力高于安徽香椿茶㊂在两种市售香椿茶中分别检出90种和75种挥发性成分,主要为碳氢类㊁醇类和醛类化合物,其中GC-MS 联用技术分析结果显示,三一香椿茶中主要挥发性成分为香叶醇㊁苯甲醛㊁水杨酸甲酯等,安徽香椿茶中主要挥发性成分为β-石竹烯㊁α-石竹烯㊁金合欢烯等;GC-IMS 联用技术分析结果显示,三一香椿茶中主要挥发性成分为醛类㊁醇类和酮类,安徽香椿茶中醛类化合物的种类和相对含量最高,通过GC-IMS 指纹谱图和PCA 分析可以很好地区分两种香椿茶中的挥发性成分㊂利用这两种联用技术进行协同分析,能更全面地获得香椿茶的风味信息,为改善香椿茶风味提供参考㊂关键词:香椿茶;活性成分;抗氧化活性;挥发性成分;GC-MS 技术;GC-IMS 技术中图分类号:TS272.5㊀㊀文献标识码:A㊀㊀文章编号:2096-1553(2023)03-0035-110　引言香椿(Toona sinensis )属于楝科香椿属植物,是我国特有的集菜㊁药于一体的珍贵木本植物,在全国22个省市均有规模化种植,其中以安徽㊁河南㊁河北和山东栽培最多[1-2]㊂香椿富含多种营养物质和植物次生代谢物质,包括氨基酸㊁蛋白质㊁可溶性糖㊁VC ㊁多酚类㊁黄酮类㊁皂苷㊁萜类㊁生物碱㊁苯丙素类㊁含硫及含氮化合物等,具有抗氧化㊁抑菌㊁抗癌㊁降血糖㊁降血压㊁减肥等功效[3-5]㊂目前香椿加工制品多以腌制为主,存在营养损失大㊁产品单一㊁附加值低㊁产业链短等诸多问题,严重阻碍了香椿产业的健康㊃53㊃㊀2023年6月第38卷第3期㊀发展[6]㊂近年来,人们以新鲜香椿为原料,采用红茶制备工艺,经过萎凋㊁揉捻㊁发酵㊁干燥等流程制成香椿茶,丰富了香椿加工制品的种类,延长了香椿产业链条㊂李平等[7]研究发现,将嫩绿香椿叶利用微波杀青后,造形为颗粒状,并于90ħ条件下烘干3h制成的香椿茶,气味清香,口感鲜醇,汤色明亮㊂李湘利等[8]研究发现,香椿茶富含多种生物活性成分,具有抗癌㊁降血压等作用㊂蒋鹏飞等[6]通过研究以4月㊁5月和6月份香椿嫩芽为原料制成的香椿发酵茶发现,与香椿相比,香椿发酵茶中总黄酮㊁多糖㊁茶多酚和游离氨基酸的含量更高,且总黄酮㊁多糖㊁茶多酚和茶色素的含量随采收期的延长而逐渐增加;不同采收期香椿发酵茶中共检出90种挥发性成分,其中萜烯类化合物的相对含量最高㊁种类最多㊂然而,目前关于香椿茶主要活性成分及挥发性风味物质方面尚缺乏系统的研究㊂气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术和气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)联用技术因具有样品前处理简单㊁用量少㊁分析速度快㊁分辨率高等特点,均在茶叶风味成分研究中得到广泛应用㊂基于此,本研究拟选用两种市售香椿茶为研究对象,测定其主要活性成分和抗氧化活性,并利用GC-MS联用技术和GC-IMS联用技术对香椿茶的挥发性成分进行检测分析,旨在填补香椿茶的研究空白,为市售香椿茶的食用价值㊁功能品质和质量控制提供理论支撑,同时为香椿茶产品的开发及其产业化生产提供参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀主要材料与试剂主要材料:香椿茶,分别购于郑州市三一香椿食品有限公司(以下简称 三一香椿茶 )和华夏谌世生态农业科技有限公司(以下简称 安徽香椿茶 )㊂香椿茶经研磨后过40目筛,储存于4ħ冰箱,备用㊂主要试剂:福林酚㊁咖啡碱㊁谷氨酸㊁芦丁㊁1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),均为分析优级纯,北京索莱宝生物科技有限公司;没食子酸标准品(分析纯),天津市光复精细化工研究所;2-甲基-3-庚酮(色谱纯),德国DR公司;C7-C30正构烷烃(色谱纯),美国Supelco公司;正酮C4-C9试剂(色谱纯),国药集团化学试剂有限公司㊂其他试剂均为分析纯㊂1.2㊀主要仪器ME204E型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;H1850R型高速冷冻离心机,湖南湘仪实验仪器开发有限公司;FW-80型高速万能粉碎机,北京市永光明医疗仪器有限公司;GENESYS10S 型紫外分光光度计,美国Thermo公司产;SB-5200DTD型超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;8890A-5977B型GC-MS联用仪㊁HP-5 MS型石英毛细管色谱柱(30mˑ0.25mmˑ0.25μm)㊁顶空固相微萃取装置(包括手持式手柄㊁50/30μmDVB/CAR/PDMS和20mL带硅胶垫棕色顶空瓶),美国安捷伦公司;Flavour Spec型GC-IMS 联用仪,德国G.A.S公司;MXT-5型色谱柱(15mˑ0.53mmˑ0.53μm),美国Restek公司㊂1.3㊀实验方法1.3.1㊀主要活性成分测定㊀水浸出物含量测定参照文献[9];茶多酚含量测定参照文献[10];咖啡碱含量测定参照文献[11];游离氨基酸总量测定参照文献[12]中的分光光度法;可溶性糖及总黄酮含量分别采用蒽酮-硫酸比色法和三氯化铝法测定;茶黄素㊁茶红素和茶褐素含量采用系统比色法[13]测定㊂1.3.2㊀抗氧化能力测定㊀DPPH自由基清除能力的测定:参考蒋鹏飞等[6]的方法,并稍作修改㊂配制2mL不同稀释质量浓度的香椿茶提取液,加入2mL0.1mmol/L的DPPH溶液(无水乙醇溶解),充分摇匀后,置于暗室中静置反应30min,于517nm波长处测定吸光度㊂DPPH自由基清除率=1-A1-A2A()ˑ100%式中:A1为样品提取液的吸光度;A2为无水乙醇代替DPPH溶液的吸光度;A0为无水乙醇代替样品提取液的吸光度,并同时计算每个样品清除DPPH自由基的IC50值㊂㊃OH清除能力的测定:根据孟洋等[14]的方法,并稍作修改㊂取不同稀释质量浓度的香椿茶提取液㊃63㊃㊀赵甜甜,等:两种市售香椿茶主要活性成分㊁抗氧化活性及挥发性成分的对比分析各1mL于试管中,依次加入1mL9mmol/L的FeSO4溶液㊁1mL9mmol/L的水杨酸溶液㊁1mL 8.8mmol/L的H2O2,在37ħ水浴条件下加热30min后,于510nm波长处测定吸光度㊂㊃OH清除率=1-B1-B2B()ˑ100%式中:B0为蒸馏水代替样品提取液的吸光度;B1为样品提取液的吸光度;B2为蒸馏水代替H2O2的吸光度,并同时计算每个样品清除㊃OH的IC50值㊂总还原力的测定:取不同稀释质量浓度的香椿茶提取液各1mL于试管中,分别加入0.2mmol/L 的磷酸盐缓冲液(pH值为6.6)2.5mL和1g/ 100mL的铁氰化钾溶液2.5mL,混合均匀后,置于50ħ水浴锅中反应20min;加入10g/100mL的三氯乙酸溶液2.5mL,停止反应,混匀后在3500r/min 条件下离心10min;准确吸取2.5mL上清液,加入2.5mL蒸馏水和质量分数为0.1%的FeCl3溶液0.5mL,混合均匀后,在室温下静置反应10min,于700nm处测定吸光度[14]㊂总还原力(以吸光度表示)=P1-P0式中:P1为样品提取液的吸光度,P0为蒸馏水代替样品提取液的吸光度㊂1.3.3㊀挥发性成分分析㊀1)GC-MS检测㊂GC-MS 样品处理过程参考文献[15]的方法并适当调整㊂称取(0.5ʃ0.001)g香椿茶样品和0.2g NaCl于20mL顶空瓶中,立即加入5mL沸水和124mg/L 的2-甲基-3-庚酮溶液5μL作为内标物,密封后于60ħ水浴中平衡10min,插入经250ħ老化的50/ 30μm DVB/CAR/PDMS萃取头,萃取40min后取出萃取头,插入GC-MS联用仪,于250ħ条件下解析5min㊂GC条件:HP-5MS石英毛细管柱;载气He;进样口温度250ħ,无分流比,柱流速1mL/min;程序升温为初温40ħ,保持3min,以3ħ/min的速率升温至80ħ,保持2min,以5ħ/min的速率升温至150ħ,保持2min,以8ħ/min的速率升温至240ħ,保持3min后结束[16]㊂MS条件:电子轰击电离(EI),四极杆150ħ;离子源温度230ħ;辅助加热器250ħ;全扫描方式,扫描范围40~800amu㊂化合物的定性与定量:阈值设为16,利用GC-MS联用仪内置的NIST17.LIB标准质谱库进行检索匹配,利用C7~C30正构烷烃混合标准品保留时间计算样品中挥发性成分的保留指数(RI);记录相似度大于70%的挥发性成分;利用内标2-甲基-3-庚酮计算各成分的相对含量㊂2)GC-IMS检测㊂参考文献[17]的方法,稍作修改㊂称取0.200g香椿茶样品于20mL顶空瓶中,立即加入2mL沸水,密封后置于500r/min的振荡器(80ħ)中加热孵化10min,顶空进样口温度为80ħ,不分流顶空进样0.3mL㊂GC条件:MXT-5型色谱柱;色谱柱温度为60ħ;载气为N2(ȡ99.999%);载气流速程序为初始2.0mL/min,保持2min,在2~10min内线性增至5.0mL/min,在10~20min内线性增至50.0mL/ min,在20~30min内线性增至100.0mL/min,停止流动,总运行时间为30min[18]㊂IMS条件:漂移管长度98mm;漂移管温度45ħ;漂移气为N2(纯度ȡ99.999%);漂移气流速150mL/min;管内线性电压500V/cm;放射源为β射线(氚,3H);正离子模式;光谱平均扫描次数12次㊂化合物的定性与定量:利用GC-IMS联用仪自带的LAV(Laboratory Analytical Viewer)分析软件和插件(Reporter㊁Gallery Plot㊁Dynamic PCA)及内置的2014NIST数据库和IMS数据库对香椿茶的挥发性成分进行采集和分析㊂1.4㊀数据处理实验均重复3次,结果表示为(平均数ʃ标准差);采用DPS软件进行方差分析,P<0.05表示差异显著;使用Origin8.6绘图㊂2㊀结果与分析2.1㊀两种市售香椿茶的主要活性成分比较分析㊀㊀表1为两种市售香椿茶的主要活性成分含量㊂由表1可知,两种市售香椿茶的主要活性成分含量均差异显著:安徽香椿茶的水浸出物含量㊁游离氨基酸总量㊁茶多酚㊁总黄酮㊁可溶性糖㊁茶黄素㊁茶红素及茶褐素含量均明显高于三一香椿茶(P<0.05),但㊃73㊃㊀2023年6月第38卷第3期㊀㊀㊀㊀表1㊀两种市售香椿茶的主要活性成分含量Table1㊀Contents of main active components intwo commercial T.sinensis tea%活性成分三一香椿茶安徽香椿茶水浸出物35.21ʃ0.25b39.99ʃ0.28a酚氨比 2.07a 1.29b游离氨基酸总量 4.30ʃ0.08b8.56ʃ0.16a茶多酚8.89ʃ0.14b11.01ʃ0.01a咖啡碱 2.75ʃ0.12a 2.32ʃ0.12b总黄酮 5.20ʃ0.10b 6.03ʃ0.22a可溶性糖 5.89ʃ0.14b9.91ʃ0.17a茶黄素0.28ʃ0.01b0.64ʃ0.02a茶红素 4.83ʃ0.17b15.12ʃ0.75a茶褐素9.79ʃ0.05b13.64ʃ0.42a㊀注:同行不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05),下同㊂其酚氨比和咖啡碱含量正好相反㊂游离氨基酸是茶叶中的主要成分之一,其含量会直接影响茶叶的鲜爽度㊁香气成分和营养价值[19]㊂安徽香椿茶游离氨基酸总量约是三一香椿茶的1.99倍㊂茶多酚是决定茶叶品质的一个重要指标之一,具有调节免疫力㊁抗氧化㊁降血糖等多种作用[19],安徽香椿茶的茶多酚含量明显高于三一香椿茶㊂可溶性糖与茶汤的甜醇度有关,对茶汤甜味和茶叶香气有一定影响[20],安徽香椿茶中可溶性糖含量约是三一香椿茶中的2倍㊂茶色素主要包括茶黄素㊁茶红素和茶褐素,是构成茶汤 亮㊁红㊁褐 的主要成分,也是决定茶叶色泽和滋味的关键因素,安徽香椿茶中茶黄素㊁茶红素和茶褐素的含量分别约是三一香椿茶的2.29倍㊁3.13倍和1.39倍㊂酚氨比即为茶多酚与氨基酸的比值,反映了茶叶两个主要品质成分的配比情况,是衡量茶汤滋味协调性的一项重要指标㊂一般来说酚氨比低,鲜爽度高;酚氨比高,鲜爽度低[21]㊂三一香椿茶的酚氨比(2.07)明显高于安徽香椿茶(1.29)㊂2.2㊀两种市售香椿茶抗氧化活性分析表2为两种市售香椿茶的抗氧化活性㊂由表2可知,三一香椿茶对DPPH自由基的清除能力略低于安徽香椿茶,而对㊃OH的清除率能力略高于安徽香椿茶㊂图1为两种市售香椿茶的总还原能力㊂由图1可知,安徽香椿茶的总还原能力高于三一香椿茶,且随着样品质量浓度的增大,总还原能力逐渐㊀㊀㊀表2㊀两种市售香椿茶的抗氧化活性Table2㊀Antioxidant scavenging activity oftwo commercial T.sinensis tea mg㊃mL-1样品DPPH自由基的IC50㊃OH的IC50三一香椿茶0.17ʃ0.01a40.74ʃ1.88a安徽香椿茶0.15ʃ0.01a42.34ʃ3.04a图1㊀两种市售香椿茶的总还原能力Fig.1㊀The total reducing capacity oftwo commercial T.sinensis tea增强㊂相关研究[22-23]表明,茶叶中的酚类化合物或黄酮类化合物对茶叶抗氧化能力具有显著影响㊂B.S.Ma等[24]采用高效液相色谱测定普洱茶中酚类化合物和生物碱的含量及其体外抗氧化活性,发现儿茶素㊁黄酮等活性成分能够提高普洱茶的抗氧化能力㊂杨眷俪等[25]通过对文冠果芽茶与叶茶的营养功能成分及抗氧化活性进行比较,发现芽茶㊁叶茶中多酚和黄酮的含量与DPPH自由基㊁ABTS自由基等均呈极显著正相关关系㊂本研究结果与上述研究结果基本一致㊂2.3㊀两种市售香椿茶GC-MS结果分析表3为两种市售香椿茶的GC-MS定性定量分析结果㊂由表3可知,两种市售香椿茶共检测出90种挥发性成分,其中三一香椿茶和安徽香椿茶分别检测出63种和57种,主要包括含硫类(5种)㊁醇类(11种)㊁醛类(12种)㊁酯类(5种)㊁酮类(9种)㊁碳氢类(36种)㊁酸类(3种)㊁杂氧类(6种)和含氮类(3种)化合物,其中共有成分29种㊂两种市售香椿茶挥发性成分相对含量如图2所示㊂由图2可知,三一香椿茶中醛类化合物相对含量最高(13.17μg/g),其次是醇类(7.7μg/g)㊁碳氢类(7.62μg/g)㊁酮类(6.24μg/g)和酯类(5.62μg/g)化合物;安徽㊃83㊃㊀赵甜甜,等:两种市售香椿茶主要活性成分㊁抗氧化活性及挥发性成分的对比分析㊀㊀表3㊀两种市售香椿茶的GC-MS定性定量分析结果香椿茶中碳氢类化合物相对含量最高(30.02μg/g),其次为醛类(2.57μg/g)㊁杂氧类(2.55μg/g)和含硫类(2.25μg/g)化合物㊂碳氢类化合物是两种市售香椿茶中的主体挥发性成分,三一香椿茶和安徽香椿茶挥发性成分种类最多的均为碳氢类化合物,分别为21种和30种㊂其中β-石竹烯是碳氢类化合物中的主要挥发性成分,具有香甜的丁香香料味㊂三一香椿茶中β-石竹烯的相对含量(12.6μg/g)约是安徽香椿茶(1.9μg/g)的6.6倍㊂醇类和酯类化合物也是构成两种市售香椿茶香气特征的重要成分,醇类化合物在两种市售香椿茶㊃93㊃㊀2023年6月第38卷第3期㊀图2㊀两种市售香椿茶挥发性成分相对含量Fig.2㊀Relative contents of volatile compounds oftwo commercial T.sinensis tea中占比为4%~18%,酯类化合物为0.8%~13%㊂醇类化合物多呈花香㊁甜味和青草味,芳香阈值低,并常与其他成分作用产生倍增效应[26]㊂其中相对含量最高的香叶醇(4μg/g)仅在三一香椿茶中检出,它具有甜花香及水果和桃子的香味㊂酯类挥发性成分主要与茶叶发酵和脂肪酸代谢相关,大多呈持久强烈的果香[27]㊂水杨酸甲酯具有冬青油香㊁薄荷香气味,是茶叶中重要的化合物[28],在三一香椿茶中相对含量最高(4.54μg/g),安徽香椿茶中未检出㊂醛类和酮类化合物也是香椿茶挥发性成分的重要组成部分,其含量和种类在三一香椿茶中都比安徽香椿茶高㊂醛类化合物中苯甲醛相对含量最高(7.44μg/g),仅在三一香椿茶中检出,具有强烈的杏仁香和坚果味[29-30],其次是苯乙醛㊁(E,E)-2,4-庚二烯醛和(E)-2-己烯醛㊂三一香椿茶中苯乙醛相对含量约是安徽香椿茶的2.1倍,它具有甜香㊁花香和巧克力蜂蜜味;(E,E)-2,4-庚二烯醛仅出现在三一香椿茶中;(E)-2-己烯醛在三一香椿茶中的相对含量约是安徽香椿茶的3.4倍,它具有青香和新鲜的植物香味㊂X.T.Zhai等[31]采用分子感官技术发现,双(1-丙烯基)二硫化物㊁己醛㊁(E)-2-己烯醛等是构成新鲜香椿独特气味的主要贡献化合物㊂酮类化合物β-紫罗酮在三一香椿茶中的相对含量最高(2.04μg/g),约是安徽香椿茶(0.87μg/g)的2倍,具有木香㊁水果香和紫罗兰香气,是乌龙茶香气的特征性成分,由茶叶中的类胡萝卜素在发酵过程中形成的,延长茶发酵时间可能会提高其相对含量,因此可通过调节发酵时间来控制其相对含量[28]㊂含硫类化合物一般具有较低阈值和较强气味,呈现类似大蒜㊁韭菜㊁洋葱等刺激性气味,是目前公认的新鲜香椿中重要挥发性成分[27]㊂三一香椿茶和安徽香椿茶中相对含量最高的含硫类化合物均为1-乙硫基-2-甲基-1-丙烯(相对含量分别为0.18μg/g和0.97μg/g),其在安徽香椿茶中的相对含量比三一香椿茶约高4倍㊂二甲基硫醚仅在安徽香椿茶中检出,具有洋葱㊁蔬菜风味和少许薄荷味,对香椿茶特殊风味的形成起着重要作用[32]㊂除此之外,酸类(庚酸㊁辛酸㊁己酸)仅出现在三一香椿茶中,在安徽香椿茶中未检出,而杂氧类和含氮类化合物均在两种市售香椿茶中检出㊂综上可知,两种市售香椿茶挥发性成分差异明显,三一香椿茶中挥发性成分较丰富,以苯甲醛㊁香叶醇㊁水杨酸甲酯㊁β-紫罗酮㊁β-石竹烯㊁苯乙醇等为主,而安徽香椿茶中碳氢类化合物(β-石竹烯㊁α-石竹烯㊁金合欢烯和右旋-大根香叶烯)及含硫类化合物(1-乙硫基-2-甲基-1-丙烯㊁3,4-二甲基-噻吩和二甲基硫醚)的相对含量较高,更接近香椿的特征风味㊂2.4㊀两种市售香椿茶GC-IMS结果分析2.4.1㊀GC-IMS定性定量分析㊀表4为两种市售香椿茶的GC-IMS定性定量分析结果㊂由表4可知,两种市售样品中共检测出75种挥发性成分,包括醛类(13种)㊁醇类(10种)㊁酮类(7种)㊁酯类(5种)㊁碳氢类(4种)㊁酸类(4种)㊁含氮类(2种)㊁杂氧类(2种)和其他类(1种)化合物,其中定性48种(单体㊁二聚体和三聚体仅统计1次)㊂两种市售香椿茶中鉴定出的主要挥发性成分相对含量由高到低依次是醛类㊁醇类和酮类化合物㊂其中,反式-2-己烯醛在两种市售香椿茶中的相对含量均为20.00%左右,且在三一香椿茶中相对含量高于安徽香椿茶,这与GC-MS结果基本一致;2-甲基丁醛的相对含量均超过10.00%,它具有独特的可可味和杏仁味[33],但在两种市售香椿茶中的相对含量相差不大㊂2.4.2㊀指纹图谱分析㊀为了更深入且直观地比较两种市售香椿茶样品中挥发性成分的差异,采用GC-IMS自带的Gallery Plot插件对样品进行GC-IMS指纹图谱分析,结果见图3,其中纵列代表㊃04㊃㊀赵甜甜,等:两种市售香椿茶主要活性成分㊁抗氧化活性及挥发性成分的对比分析㊀㊀㊀表4㊀两种市售香椿茶的GC-IMS 定性定量分析结果Table 4㊀Qualitative and quantitative analysis of two commercial T.sinensis tea by GC-IMS种类化合物名称RI 保留时间/s 迁移时间/min 相对含量/%三一香椿茶安徽香椿茶酮类醛类醇类酯类2-丁酮580.2134.295 1.250 4.63ʃ0.07 5.98ʃ0.09羟基丙酮673.5183.540 1.2380.23ʃ0.020.45ʃ0.032-己酮789.3304.290 1.5090.50ʃ0.010.48ʃ0.016-甲基-5-庚烯-2-酮991.1708.015 1.180 5.12ʃ0.05 3.19ʃ0.104-羟基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮1063.2846.510 1.6170.06ʃ0.010.33ʃ0.04苯乙酮1064.2848.820 1.1880.20ʃ0.010.12ʃ0.02双乙酰604.6145.320 1.1770.04ʃ0.000.16ʃ0.012-甲基丁醛-M 661.9176.715 1.1640.33ʃ0.000.22ʃ0.01正戊醛685.8191.730 1.427 1.31ʃ0.02 1.47ʃ0.07反式-2-戊烯醛-D748.8253.785 1.365 3.95ʃ0.068.64ʃ0.292-甲基丁醛-D 647.5168.315 1.40710.75ʃ0.1911.73ʃ0.44呋喃甲醛831.8367.710 1.0840.22ʃ0.000.22ʃ0.01正庚醛-M898.8494.970 1.332 1.02ʃ0.040.6ʃ0.01正庚醛-D 898.8495.075 1.701 1.33ʃ0.030.25ʃ0.003-甲硫基丙醛911.7520.065 1.4000.04ʃ0.010.20ʃ0.005-甲基呋喃醛-M961.4628.530 1.1220.35ʃ0.020.76ʃ0.03苯甲醛972.0655.095 1.151 1.73ʃ0.02 1.22ʃ0.02正辛醛1002.1729.855 1.4060.73ʃ0.010.25ʃ0.00反式-2,4-庚二烯醛-D 1013.7751.380 1.625 1.81ʃ0.110.94ʃ0.10反式-2,4-庚二烯醛-M1015.2755.265 1.195 1.66ʃ0.01 1.18ʃ0.05苯乙醛-D1041.2802.725 1.541 2.04ʃ0.05 2.12ʃ0.09苯乙醛-M 1042.0805.245 1.256 2.76ʃ0.05 2.82ʃ0.10正己醛798.2319.515 1.261 1.94ʃ0.02 1.02ʃ0.03反式-2-戊烯醛-M 750.4262.185 1.107 1.41ʃ0.02 2.07ʃ0.025-甲基呋喃醛-D 964.6637.140 1.478 1.12ʃ0.05 4.42ʃ0.04反式-2-己烯醛853.4405.510 1.18520.59ʃ0.0517.9ʃ0.522-甲基-1-丁醇-D 739.0242.025 1.472 1.08ʃ0.010.05ʃ0.012-甲基-1-丁醇-M 754.0259.245 1.2330.22ʃ0.010.06ʃ0.011-戊醇-M 770.0279.405 1.255 1.23ʃ0.040.25ʃ0.031-戊醇-D767.8276.150 1.514 1.05ʃ0.020.11ʃ0.021-庚醇966.2641.235 1.7520.28ʃ0.020.08ʃ0.011-辛烯-3-醇987.2694.680 1.1590.44ʃ0.010.11ʃ0.012-乙基-1-己醇1030.5781.095 1.8040.24ʃ0.010.15ʃ0.01芳樟醇-D1099.0924.420 1.7550.76ʃ0.110.16ʃ0.022-己醇789.7307.650 1.5627.62ʃ0.07 3.75ʃ0.092,3-丁二醇780.5292.110 1.3660.37ʃ0.00 1.97ʃ0.06芳樟醇-M 1103.7934.605 1.219 6.22ʃ0.15 4.96ʃ0.442-甲基丙醇618.1152.250 1.1730.25ʃ0.010.11ʃ0.001-丙醇554.6123.375 1.117 1.16ʃ0.130.51ʃ0.12乙酸丙酯701.4205.065 1.1630.18ʃ0.000.33ʃ0.01丁酸丙酯888.5474.600 1.265 1.11ʃ0.020.41ʃ0.03乙酸戊酯916.5529.725 1.3150.13ʃ0.010.04ʃ0.00丁酸丁酯994.4714.3151.3370.17ʃ0.010.08ʃ0.01水杨酸甲酯1189.61141.9801.2014.04ʃ0.48 4.17ʃ0.49㊃14㊃㊀2023年6月第38卷第3期㊀表4(续)种类化合物名称RI保留时间/s迁移时间/min相对含量/%三一香椿茶安徽香椿茶酸类碳氢类含氮类杂氧类其他类丁酸810.6334.215 1.1610.42ʃ0.010.25ʃ0.012-甲基丁酸848.2396.585 1.4680.3ʃ0.020.77ʃ0.043-甲基丁酸860.7418.950 1.4840.07ʃ0.000.53ʃ0.02己酸993.9709.905 1.3010.52ʃ0.02 1.17ʃ0.04α-蒎烯-D929.3556.395 1.2890.60ʃ0.010.09ʃ0.01α-蒎烯-T929.2556.185 1.6830.29ʃ0.010.04ʃ0.00α-蒎烯-M937.6574.140 1.2250.93ʃ0.070.44ʃ0.02α-水芹烯1017.6757.785 1.6910.15ʃ0.010.34ʃ0.02十氢化萘1058.9839.055 1.3360.53ʃ0.030.22ʃ0.01β-罗勒烯1045.8811.965 1.2170.16ʃ0.010.39ʃ0.052,5-二甲基吡嗪911.0518.490 1.1180.59ʃ0.020.96ʃ0.052-乙基-6-甲基吡嗪999.1724.605 1.2020.53ʃ0.01 1.12ʃ0.022-乙基呋喃711.1213.675 1.3040.45ʃ0.04 3.49ʃ0.052-乙酰基呋喃-D911.2518.910 1.4420.07ʃ0.000.98ʃ0.042-乙酰基呋喃-M922.6539.070 1.119 1.83ʃ0.05 2.46ʃ0.06二乙二醇二甲醚954.2611.625 1.1630.15ʃ0.020.71ʃ0.03㊀注:D表示二聚体;M表示单聚体;T表示三聚体㊂图3㊀两种市售香椿茶的GC-IMS指纹谱图Fig.3㊀GC-IMS fingerprints of two commercial T.sinensis tea样品中检测出的挥发性成分,没有被准确定性的挥发性成分用阿拉伯数字进行顺序编号;横行代表香椿茶样品㊂由图3可知,两种市售香椿茶的指纹图谱具有明显差异㊂A框中的物质为两种市售香椿茶中共有且含量差别不大的挥发性成分特征峰区域,共有10种化合物,其中有7种定性物质,主要为醛类化合物,包括2-丁酮㊁正戊醛㊁2-甲基丁醛-M/D㊁反式-2-己烯醛㊁苯乙醛-M/D㊁呋喃甲醛㊁水杨酸甲酯㊂醛类化合物主要来源于脂肪的氧化分解反应,是香椿的重要风味化合物,其挥发性较强,相对含量较高且阈值较低[34]㊂B框是三一香椿茶中信号强度明显高于安徽香椿茶的挥发性成分,共有34种化合物,其中有7种未被准确定性,准确定性的物质(如2-甲基-1-丁醇-M/D㊁乙酸戊酯㊁1-庚醇㊁正庚醛-D㊁1-戊醇-M/D㊁1-辛烯-3-醇㊁芳樟醇-D㊁α-蒎烯-D/T等)在两种香椿茶中能够明显区分㊂C框为安徽香椿茶中相对含量明显高于三一香椿茶的挥发性成分,主要包含2,3-丁二醇㊁双乙酰㊁4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮㊁二乙二醇二甲醚㊁3-甲硫基丙醛㊁2-乙酰基呋喃-D㊁3-甲基丁酸㊁2-乙基呋喃等㊂上述研究结果与表4所示分析结果基本一致㊂2.4.3㊀主成分分析㊀PCA可直观显示不同样本间的差异,是一种多元数据分析工具,可用于分析具有定量变量的多维数据集[35];通过计算和比较欧式距离分析挥发性成分指纹的相似性,图中样本的距离越大,表示样本的差异越明显㊂图4为两种市售香椿茶的PCA分析结果㊂由图4可知,主成分1和主成分2累计方差贡献率达99%,能够较好地反映两㊃24㊃㊀赵甜甜,等:两种市售香椿茶主要活性成分㊁抗氧化活性及挥发性成分的对比分析㊀㊀图4㊀两种市售香椿茶的PCA 分析结果Fig.4㊀Principal component analysis of twocommercial T.sinensistea图5㊀两种市售香椿茶GC-MS 和GC-IMS分析结果的韦恩图Fig.5㊀Flavor venn diagram of GC-MS and GC-IMS for two commercial T.sinensis tea种市售香椿茶中挥发性成分含量间的差异,且两种样品间距离较大,说明PCA 能够较好地区分这两种市售香椿茶样品㊂2.5㊀两种市售香椿茶挥发性成分GC-MS 与GC-IMS 结果差异分析㊀㊀图5为两种市售香椿茶GC-MS 和GC-IMS 分析结果的韦恩图㊂由图5可知,采用两种联用技术在三一香椿茶中共检测出10种挥发性成分,分别为反式-2-己烯醛㊁苯乙醛㊁1-辛烯-3-醇㊁芳樟醇㊁正己醛㊁苯甲醛㊁(E ,E )-2,4-庚二烯醛㊁水杨酸甲酯㊁6-甲基-5-庚烯-2-酮和己酸;而在安徽香椿茶中仅检测出反式-2-己烯醛和苯乙醛2种挥发性成分㊂两种联用技术检测出的挥发性成分种类和相对含量有所不同,其中GC-MS 技术鉴定出的碳氢类化合物种类相对更丰富,而GC-IMS 技术鉴定出的醇类和醛类化合物更多㊂这可能是由于两种联用技术对物质检出的灵敏度不同,GC-MS 联用技术检出的大多是大分子挥发性成分,而GC-IMS 联用技术检出的多为小分子挥发性成分[36]㊂两种联用技术各有优缺点,协同使用两种联用技术能够更全面地分析两种市售香椿茶中的挥发性成分㊂3㊀结论本文以三一香椿茶和安徽香椿茶为研究对象,采用对比实验,借助紫外分光光度法㊁GC-MS 联用技术和GC-IMS 联用技术对其主要活性成分㊁抗氧化活性及挥发性成分进行测定,结果表明:1)安徽香椿茶中游离氨基酸总量及茶多酚㊁总黄酮㊁可溶性糖㊁茶黄素㊁茶红素和茶褐素含量均比三一香椿茶高,而酚氨比及咖啡碱含量则相反㊂2)安徽香椿茶的DPPH 自由基清除能力及总还原力高于三一香椿茶,而㊃OH 清除能力低于三一香椿茶㊂3)利用GC-MS 联用技术共检测出90种挥发性成分,三一香椿茶中检出63种,主要挥发性成分为苯甲醛㊁香叶醇㊁水杨酸甲酯等;安徽香椿茶中检出57种,主要挥发性成分为β-石竹烯㊁α-石竹烯㊁右旋-大根香叶烯等㊂4)利用GC-IMS 联用技术共检测出75种化合物,定性48种,在两种市售香椿茶中均以醛类化合物相对含量较高,其次为醇类和酮类化合物;通过构建GC-IMS 指纹图谱和PCA 分析可直观地观察两种市售香椿茶挥发性成分的差异㊂5)采用GC-MS 和GC-IMS 两种联用技术协同分析,在安徽香椿茶中共检测出2种挥发性成分,而在三一香椿茶中共检测出10种挥发性成分,丰富了香椿茶挥发性风味物质的组成发现㊂综上所述,两种市售香椿茶的主要活性成分㊁抗氧化能力及挥发性成分均存在明显差异㊂后续研究可着重开展不同加工工艺㊁加工过程对香椿茶品质的影响,深入了解香椿茶风味形成机理,为香椿茶的开发㊁质量控制及后期产品加工提供理论支撑㊂参考文献:[1]㊀MU R ,WANG X ,LIU S ,et al.Rapid determination of vol-atile compounds in Toona sinensis (A.Juss.)Roem.by MAE-HS-SPME followed by GC-MS [J ].Chromatograph-ic ,2007,65(7-8):463-467.[2]㊀王晓敏,史冠莹,王赵改,等.不同产地香椿抗氧化活性及挥发性成分的差异分析[J ].现代食品科技,2020,36(7):271-281.[3]㊀LIU C ,JIE Z ,ZHOU Z ,et al.Analysis of volatile com-㊃34㊃。

本文为2008年国家社科基金课题：我国社会转型中的公共安全及其保障机制研究（08BSH009）阶段成果之一。

煤矿安全生产管理我们还缺什么？——谈美国煤矿安全管理的特点和启示Safety management of cool mining production: what we still lack? 湖南省社会科学院政治与公共管理研究所刘助仁近些年来，在中央政府的正确领导下，经过各方面的努力，全国煤矿安全生产状况呈现出总体平稳、趋于好转的态势，但事故总量仍然过大，重特大事故仍然时有发生，煤矿业安全形势依然十分严峻。

美国的煤矿业也曾经历了一个从事故多发到加强安全管理、最终进入安全生产时期的漫长过程。

在19世纪后期和20世纪初期，美国每年有数千人死于煤矿事故。

1907年，西弗吉尼亚州的一起煤矿事故，死亡362人，创美国历史之最。

这次煤矿事故促使美国采取坚决措施加强安全管理。

经过长期不懈的努力，如今美国煤矿安全生产处于世界领先水平，近年来每百万吨煤死亡率一直在0.03%以下。

在这方面，美国的经验很有借鉴意义，可以作为我国开展此项工作的重要参考。

美国煤矿安全生产管理的特点管理机构比较健全1910年，作为美国第一个为煤矿安全而设立的联邦机构——矿业局的基本任务是研究安全生产问题、制定安全标准、监督生产、加强检查、调查处理事故等。

1913 年，美国成立劳工部，安全生产管理也是其主要职能之一。

1977年，作为美国国会立法的结果，建立了独立的安全监察部门——矿山安全与健康管理局（简称MSHA），这一机构类似于我国的安全生产总局。

MSHA 的主要权利和职责是经常执行矿厂检查；执行事故调查；制定安全与健康标准；执行安全与健康条例，对没有符合标准的进行制裁；要求和提供采矿安全和健康教育与训练；提供技术帮助与开展研究等。

法律体系比较完善围绕煤矿安全生产，美国已先后制定了十多部法律，安全标准越来越高，而且具有很强的操作性。

CCK8实验1、在96孔板中配置100卩l的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养24 小时(37C, 5% CO2)。

2、向培养板加入10卩l不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如：6、12、24或48 小时)。

4、向每孔加入10卩l CCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10卩l 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

24 小时内测定，吸光度不会发生变化。

PS: 1% w/v SDS溶液配制方法：组份浓度：10% (W/V)SDS配制量：100ml配制方法：1•称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中，加入约80ml的去离子水，68 C加入溶解2. 滴加浓盐酸调节pH值至7.23. 将溶液定容至100ml后，室温保存。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。

当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

活力计算：细胞活力* （%）=[A（加药）-A （空白）]/[A （0加药）-A （空白）]X 100A （加药）：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度A （空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度A （0加药）：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力CCK-8可以用于细胞增殖和毒性分析。

其基本原理为：该试剂中含有WST-8，它在电子载体（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

北航计算机网络实验实验8网络管理2024秋网络管理是计算机网络中非常重要的一个环节。

网络管理的目标是保证网络的可靠性、安全性和高效性，实现网络资源的合理分配和管理。

本文将介绍北航计算机网络实验实验8的内容，主要包括网络管理的基本概念、网络管理技术和实验操作流程。

首先，网络管理是指对计算机网络进行有效管理和控制。

在网络管理中，我们需要对网络设备、网络拓扑结构、网络服务等进行全面管理和监控，以保证网络的正常运行。

网络管理包括以下几个方面的内容：1.设备管理：对网络设备进行管理和监控，包括网络交换机、路由器、防火墙等。

通过设备管理，可以及时发现设备故障，并进行修复和调整。

2.配置管理：对网络设备的配置信息进行管理，包括IP地址、子网掩码、网关等。

配置管理可以帮助我们实现网络的合理规划和资源分配。

3.性能管理：对网络性能进行实时监控和分析，包括网络流量、带宽利用率、延迟等。

通过性能管理，可以及时发现网络瓶颈，并进行相应的调整。

4.安全管理：对网络的安全性进行管理和控制，包括入侵检测、防火墙配置、访问控制等。

安全管理可以帮助我们保护网络资源，防止黑客攻击和数据泄露。

以上是网络管理的基本概念，下面将介绍一些常用的网络管理技术。

1. Simple Network Management Protocol（SNMP）：是一种网络管理协议，可以实现对网络设备的监控和管理。

SNMP通过发送和接收管理信息，实现对网络设备的远程控制和配置。

2. Remote monitoring（RMON）：是一种用于监控网络流量和性能的技术。

RMON可以实时收集和分析网络的各种参数，包括接收和发送的数据包数量、错误率、丢包率等，帮助我们及时发现和解决网络问题。

3. Traffic analysis（流量分析）：通过对网络流量进行分析，可以了解网络的使用情况和瓶颈，从而进行合理的网络优化和管理。

4. Network management system（NMS）：是一个用于管理和控制网络的软件系统。