新版动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法作业指导书
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作业指导书O P E R A T I N G I N S T R U C T I O N S动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法编号：XZJY081-00-2019版本：第一版第0次修改编制：审核：批准：实施日期：一、编制目的为规范动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量的检验方法，编制本指导书。
二、适用范围本指导书适用于动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量的测定。
三、编制依据GB/T 21311-2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量的检验方法高效液相色谱/串联质谱法》四、实验原理样品经盐酸水解，邻硝基苯甲醛过夜衍生，调pH值7.4后，用乙酸乙酯提取，正乙烷净化。
分析物采用高效液相色谱/串联质谱定性检测，采用稳定同位素内标法进行定量测定。
五、试剂和材料除非另有说明,所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
5.1 试剂5.1.1 甲醇：高效液相色谱级。
5.1.2 乙腈：高效液相色谱级。
5.1.3 乙酸乙酯：高效液相色谱纯。
5.1.4 正乙烷：高效液相色谱级。
5.1.5 浓盐酸。
5.1.6 氢氧化钠。
5.1.7 甲酸：高效液相色谱级。
5.1.8 邻硝基苯甲醛 5.1.9 三水磷酸钾 5.1.10 乙酸铵 5.2 试剂配制5.2.1 0.2 mol/L 盐酸溶液：准确量取17ml 浓酸盐（5.1.5），用水定容至1L 。
5.2.2 2.0 mol/L 氢氧化钠溶液：准确称取80g 氢氧化钠（5.1.6），用甲醇溶解并定容至1L 。
5.2.3 0.1 mol/L 邻硝基苯甲醛溶液：准确称取1.5g 邻硝基苯甲醛（5.1.8),用甲醇溶解并定容至100ml 。
5.2.4 0.3 mol/L 磷酸钾溶液：准确称取79.893g 三水磷酸钾（5.1.9），用水溶解并定容至1L 。
5.2.5 乙腈饱和的正乙烷：量取正乙烷80ml 于100ml 分液漏斗中，加入适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层既得。
5.2.6 0.1%甲酸水溶液（含0.0005mol/L 乙酸铵）：准确称取1ml 甲酸和称取0.0386g 乙酸铵于1L 容量瓶中，用水定容至1L 。
5.2.7 标准物质：3-氨基-2-恶唑酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮、1-氨基-乙内酰脲、氨基脲，纯度≥99%。
5.2.8 内标物质：3-氨基-2-恶唑酮的内标物，D 4-AOZ;5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮的内标物，D 5-AMOZ;-氨基-乙内酰脲的内标物,13C-AHD;氨基脲的内标物，13C 15N-SEM ，纯度≥99%。
5.2.9 标准储备液：分别准确称取适量标准品（精确至0.0001g ），用乙腈 溶解，配置成浓度为100ml/L 的标准储备液，-18℃冷冻避光保存，有效期3个月。
5.2.10 混合中间标准溶液：准确移取标准储备液各1ml于100ml容量瓶中，用以乙腈定容至刻度，配置成浓度为1ml/L的混合中间标准液，4℃冷藏避光保存，有效期1个月。
5.2.11 混合标准工作溶液：准确移取0.1ml混合标准储备液各于10ml容量瓶中，用以乙腈定容至刻度，配置成浓度为0.01ml/L的混合标准工作溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1周。
5.2.12 内标储备液：准确移取内标物质（精确至0.0001g），用乙腈溶解，配置成浓度为100ml/L的标准储备溶液，-18℃冷藏避光保存，有效期3个月。
5.2.13 中间内标标准溶液：准确移取1ml内标储备液于100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成浓度为1mg/L的中间内标标准溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1个月。
5.2.14 混合内标标准溶液：准确移取中间内标标准溶液各0.1ml于10ml 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成浓度为0.01ml/L的混合内标标准溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1周。
5.2.15 微孔滤膜：0.20um，有机用。
5.2.16 氮气：纯度≥99.999%。
5.2.17 氩气：纯度≥99.999%。
六、仪器和设备6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
6.2 组织捣碎机。
6.3 均质器：10000r/min。
6.4 振荡器。
6.5 分析天平:感量0.0001g，0.01g。
6.6 氮吹仪。
6.7 恒温箱。
6.8 pH计：测量精度±0.02pH单位。
6.9 离心机：10000r/min。
6.10 旋涡混合器。
6.11 移液枪：100μL、1mL、5ml。
6.12 容量瓶：1L、100ml、10ml。
6.13 具塞塑料离心管：50ml。
6.14 刻度管：10ml七、分析步骤7.1 试样制备7.1.1 肌肉、内脏、鱼和虾从原始样品中取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分捣碎成混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。
将试样置于-18℃冷冻避光保存。
7.1.2 肠衣从原始样品中取出有代表性样品约100g，用剪刀剪成边长＜5mm的方块，混匀后均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。
将试样置于4℃冷藏避光保存。
7.1.3 蛋从原始样品中取出有代表性样品约500g，去壳后用组织捣碎机充分捣碎成混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。
将试样置于4℃冷藏避光保存。
7.1.4 奶和蜂蜜从原始样品中取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。
将试样置于4℃冷藏避光保存。
注：在制样的操作过程中，应防止样品污染或残留含量发生变化。
7.2 样品处理7.2.1 水解和衍生化7.2.1.1 肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣称取约2g试样(精确至0.01g)于50ml塑料离心管中，加入10ml甲醇-水混合溶液（1+1，体积比），振荡10min后，以4000r/min离心5min，弃去液体，残留物中加入10ml 0.2mol/L盐酸，用均质器以10000r/min均质1min后，再依次加入混合内标标准溶液100ul，邻硝基苯甲醛溶液100ul，涡动混合30s后，在振荡30min，置37℃恒温箱中过夜（16h）反应。
7.2.1.2 蛋、奶和蜂蜜称取约2g试样(精确至0.01g)于50ml塑料离心管中，加入10ml~20ml 0.2mol/L盐酸（以样品完全浸润为准），用均质器以10000r/min均质1min 后，再依次加入混合内标标准溶液100ul，邻硝基苯甲醛溶液100ul，涡动混合30s后，在振荡30s，置37℃恒温箱中过夜（16h）反应。
7.2.2 提取和净化取出样品，冷却至室温，加入1ml~2ml0.3mol/L磷酸钾（1ml磷酸钾溶液），用2.0mol/L氢氧化钠调pH7.4（±0.2）后，再加入10ml~20ml乙酸乙酯（乙酸乙酯加入体积与盐酸溶液体积一致），振荡提取10min后，以10000r/min离心10min，收集乙酸乙酯层。
残留物用10ml~20ml乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯层，收集液在40℃以下用N2吹干，残渣用1ml0.1%甲酸水溶液溶解。
再用3ml 乙腈饱和的正乙烷分两次液液分配,取出脂肪，下层水相过0.20um 微孔滤膜后，取10ul 供仪器测定。
7.2.3混合基质标准溶液的制备 7.2.3.1 肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣称取5份约2g 的隐形试样（精确至0.01g ）于50ml 塑料离心管中，加入10ml 甲醇-水混合溶液（1+1，体积比）。
振荡10min 后，以4000r/min 离心5min ，弃去液体。
残留物中加入10ml 0.2mol/L 盐酸，用均质器以10000r/min 均质1min 后，按照最终定容浓度：1、5、10、50、100ng/ml ，分别加入混合中间标准溶液或混合标准工作溶液，再加入混合内标标准溶液100ul ，余下操作同上。
7.2.3.2 蛋、奶和蜂蜜称取5份约2g 的隐形试样（精确至0.01g ）于50ml 塑料离心管中，加入10ml ~20ml 0.2mol/L 盐酸，用均质器以10000r/min 均质1min 后，按照最终定容浓度：1、5、10、50、100ng/ml ，分别加入混合中间标准溶液或混合标准工作溶液，再加入混合内标标准溶液100ul ，余下操作同上。
八、测定 8.1 液相色谱条件⑴色谱柱：XTcrra MS C 18,150mm ×2.1mm （内径），3.5um ，或相当者； ⑵柱温：30℃； ⑶流速：0.2ml/min ； ⑷进样量：10ul ；⑸流动相及洗脱条件见表1.表1 流动相及梯度洗脱条件8.2 串联质谱条件毛细管电压：3.5kv ； 离子源温度：120℃； 去溶剂温度：350℃；锥孔气流：氮气，流速100L/h ； 去溶剂气流：氮气，流速600l/h ； 碰撞气：氩气，碰撞气压2.60×10-4Pa ； 扫面方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM ），监测条件见表A.1表A.1 多反应监测（MRM）的条件8.3 液相色谱/串联质谱测定8.3.1 定性测定按照上述条件测定样品和混合机制标准溶液，如果样品的质量色谱峰保留时间与混合基质标准溶液一致，相对丰度偏差不超过表2 的规定，则可判断样品中存在的被测物。
混合基质标准溶液的液相色谱/串联质谱色谱图参见图B.1。
()1..............................................................m⨯⨯⨯=sR Vc R X 表2 定性测定时相对例子风度的最大允许偏差8.3.2 定量测定按照内标法进行定量计算。
8.4 平行试验按照以上步骤对同一试验进行平行试验测定。
8.5 空白试验除不称取试样外，均按照以上步骤进行。
九、分析结果的计算及检出限 9.1按式⑴进行计算； 式中：X ----试样中分析物的含量，单位为微克每千克（μg/kg ）； R ----样液中分析物与内标物峰面积比值；c ----混合基质标准溶液中分析物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL ）；V ----样液最终定容体积，单位为毫升（mL ）;R s ----混合基质标准溶液中分析物与内标物峰面积比值; m ----样液的质量，单位为克（g ）; 注：计算结果需将空白值扣除。
9.2 测定低限（LOQ ）本方法的测定低限（LOQ ）:AOZ 、AMOZ 、SEM 、AHD,均为0.5ug/kg 。
