大肠杆菌的培养和分离

《大肠杆菌的培养和分离》实验设计实验目的：1. 掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。

3. 培养和分离大肠杆菌是许多生物技术实验的基础，通过本实验的学习，同学们可以更好地开展相关生物技术实验工作。

实验原理：大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，在微生物学及相关学科的研究中具有重要意义。

为了能够更好地开展生物技术实验，需要掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。

在培养大肠杆菌时，我们一般选用LB培养基（Luria-Bertani培养基），它是一种营养丰富的培养基，可以满足大肠杆菌的营养需求。

在制备LB培养基时，需将适量的蛋白胨、酵母提取液和纯化水混合均匀后加热至沸腾约1分钟，然后加入适量琼脂糖，搅拌均匀后装入烧瓶中。

分离纯化大肠杆菌时，需要将样品（如肠道内容物、污水等）进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围，然后在LB培养基上进行平板培养。

在培养过程中，需要控制培养温度、时间和氧气浓度等因素，以促进大肠杆菌的生长和繁殖。

随着时间的推移，大肠杆菌会在平板上生长成大量的细菌菌落，此时，我们可以将单个细菌菌落挑选出来进行分离纯化，以得到单一纯化的大肠杆菌。

实验材料与仪器：材料：LB培养基、螺旋细胞均一器、平板培养基、霉菌试验纸、吸管、医用酒精、胶体金离子分离剂等仪器：高压灭菌器、移液管、显微镜、细胞计数板实验步骤：1. 制备LB培养基。

2. 取样和稀释。

取样品（如肠道内容物、污水等），取适量于吸管中，并将其进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围。

3. 平板培养。

将LB培养基倒入平板中，恰好覆盖平板的整个表面。

待培养基凝固后，使用螺旋细胞均一器将取样液均匀滴在培养基表面上。

将平板置于37℃恒温箱中，控制温度和氧气浓度等因素，待大肠杆菌细菌菌落生长到足够数量时，进入下一步。

4. 分离纯化。

将平板上的大肠杆菌细菌菌落挑选出来，使用吸管将细菌菌落转移到新的平板中进行分离纯化。

一般建议选择较小的细菌菌落进行挑选，这样可以减少细菌间的竞争，提高挑选单一菌株的成功率。

大肠杆菌培养和分离超净台实验准备工作2灭菌和消毒无菌操作目的：为了避免被杂菌污染。

1对实验操作空间：超净台：紫外线灭菌，过滤风桌面：酒精擦拭，酒精灯外焰附近操作2.操作者衣服和手进行：清洁和消毒，70%酒精3.避免已灭菌处理的材料用具和周围物品的接触消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气、高锰酸钾消毒……（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。

消毒与灭菌的区别（2）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。

以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。

实验1大肠杆菌的培养和分离超净台上紫外灯和过滤风实验过程：准备阶段：1培养基的配制，2灭菌和消毒操作阶段：1倒平板：分装固体培养基倒平板：将已灭菌的固体培养基倒入培养皿的过程。

分装培养基：1倒平板：将灭菌后的固体培养基倒入培养皿培养基冷却到60度时倒入2培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）倒入三角瓶和试管（漏斗法）1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。

你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

朊病毒就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。

1997年诺贝尔医学/生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳(S.B.Prusiner)就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。

细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它使得这层壁坚韧并富有弹性。

一旦失去细胞壁，所有的细菌都将变成球形。

细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。

实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。

2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。

3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。

实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。

2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。

实验步骤1. 培养基灭菌。

在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。

既可以通气，又不使细菌进入。

)。

将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。

同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。

2. 倒平板，倒斜面。

灭菌后。

待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。

超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。

将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。

待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。

倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。

倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。

.实验1：大肠杆菌的培养和分离一、教学要求二、基本内容1．培养基的种类和化学成份培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基（加入琼脂多少）。

液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。

培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。

按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。

2．常见微生物类群原核生物（如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等）、原生生物（草履虫、变形虫等）、真菌（酵母菌――出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。

细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。

以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。

用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。

大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。

3．无菌技术对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。

灭菌方法：。

灼烧灭菌法①接种环、接种针、试管口等使用..②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱。

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。

4．培养基的配制原则目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。

营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。

pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。

《大肠杆菌的培养和分离》学历案一、学习目标1、了解大肠杆菌的生物学特性和在生物技术中的重要性。

2、掌握大肠杆菌培养的基本原理和操作方法。

3、学会大肠杆菌分离的技术和方法。

4、培养无菌操作的意识和实验技能。

二、学习重难点1、重点（1）大肠杆菌培养的条件和培养基的制备。

（2）无菌操作技术在大肠杆菌培养和分离中的应用。

2、难点（1）大肠杆菌的分离和纯化方法。

（2）如何确保实验操作的无菌环境。

三、知识准备1、微生物的基本概念微生物是指肉眼难以看清，需要借助显微镜才能观察到的微小生物，包括细菌、真菌、病毒等。

2、细菌的结构和生理特点细菌通常具有细胞壁、细胞膜、细胞质和核质等结构。

其生理活动包括营养摄取、代谢、生长和繁殖等。

3、培养基的类型和作用培养基是人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。

常见的培养基类型有固体培养基、液体培养基和半固体培养基等，它们分别适用于不同的实验目的。

四、学习过程1、大肠杆菌的培养（1）培养基的制备首先，准备LB培养基（LuriaBertani培养基）的成分，包括胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等。

按照一定的比例将这些成分溶解在蒸馏水中，调节pH值至适当范围。

然后，将培养基进行高压蒸汽灭菌，以杀灭其中的微生物和芽孢。

（2）接种在无菌环境下，使用无菌接种环或移液器，从保存的大肠杆菌菌种中吸取少量菌液，接入已灭菌的液体培养基中。

接种过程要迅速，避免杂菌污染。

（3）培养条件将接种后的培养基置于恒温培养箱中，在37℃下进行振荡培养。

振荡培养可以增加培养基中的氧气含量，促进大肠杆菌的生长。

2、大肠杆菌的分离（1）平板划线法在无菌操作台上，将已灭菌的固体培养基倒入培养皿中，待其冷却凝固。

用接种环蘸取少量大肠杆菌培养液，在固体培养基表面进行连续划线。

通过多次划线，将细菌逐步稀释，最终在培养基表面形成单个菌落。

（2）稀释涂布平板法首先，将大肠杆菌培养液进行一系列梯度稀释。

然后，取适量不同稀释度的菌液，分别涂布在固体培养基表面。