大肠杆菌的培养实验与分离

《大肠杆菌的培养和分离》实验设计实验目的：1. 掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。

3. 培养和分离大肠杆菌是许多生物技术实验的基础，通过本实验的学习，同学们可以更好地开展相关生物技术实验工作。

实验原理：大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，在微生物学及相关学科的研究中具有重要意义。

为了能够更好地开展生物技术实验，需要掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。

在培养大肠杆菌时，我们一般选用LB培养基（Luria-Bertani培养基），它是一种营养丰富的培养基，可以满足大肠杆菌的营养需求。

在制备LB培养基时，需将适量的蛋白胨、酵母提取液和纯化水混合均匀后加热至沸腾约1分钟，然后加入适量琼脂糖，搅拌均匀后装入烧瓶中。

分离纯化大肠杆菌时，需要将样品（如肠道内容物、污水等）进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围，然后在LB培养基上进行平板培养。

在培养过程中，需要控制培养温度、时间和氧气浓度等因素，以促进大肠杆菌的生长和繁殖。

随着时间的推移，大肠杆菌会在平板上生长成大量的细菌菌落，此时，我们可以将单个细菌菌落挑选出来进行分离纯化，以得到单一纯化的大肠杆菌。

实验材料与仪器：材料：LB培养基、螺旋细胞均一器、平板培养基、霉菌试验纸、吸管、医用酒精、胶体金离子分离剂等仪器：高压灭菌器、移液管、显微镜、细胞计数板实验步骤：1. 制备LB培养基。

2. 取样和稀释。

取样品（如肠道内容物、污水等），取适量于吸管中，并将其进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围。

3. 平板培养。

将LB培养基倒入平板中，恰好覆盖平板的整个表面。

待培养基凝固后，使用螺旋细胞均一器将取样液均匀滴在培养基表面上。

将平板置于37℃恒温箱中，控制温度和氧气浓度等因素，待大肠杆菌细菌菌落生长到足够数量时，进入下一步。

4. 分离纯化。

将平板上的大肠杆菌细菌菌落挑选出来，使用吸管将细菌菌落转移到新的平板中进行分离纯化。

一般建议选择较小的细菌菌落进行挑选，这样可以减少细菌间的竞争，提高挑选单一菌株的成功率。

大肠杆菌培养和分离超净台实验准备工作2灭菌和消毒无菌操作目的：为了避免被杂菌污染。

1对实验操作空间：超净台：紫外线灭菌，过滤风桌面：酒精擦拭，酒精灯外焰附近操作2.操作者衣服和手进行：清洁和消毒，70%酒精3.避免已灭菌处理的材料用具和周围物品的接触消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气、高锰酸钾消毒……（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。

消毒与灭菌的区别（2）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。

以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。

实验1大肠杆菌的培养和分离超净台上紫外灯和过滤风实验过程：准备阶段：1培养基的配制，2灭菌和消毒操作阶段：1倒平板：分装固体培养基倒平板：将已灭菌的固体培养基倒入培养皿的过程。

分装培养基：1倒平板：将灭菌后的固体培养基倒入培养皿培养基冷却到60度时倒入2培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）倒入三角瓶和试管（漏斗法）1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。

你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

朊病毒就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。

1997年诺贝尔医学/生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳(S.B.Prusiner)就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。

细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它使得这层壁坚韧并富有弹性。

一旦失去细胞壁，所有的细菌都将变成球形。

细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。

分离划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。

涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。

（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml（配固体培养基再加琼脂20克）2、流程计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板培养基配制(特)培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。

待灭菌。

①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。

②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。

③包扎：用_牛皮纸__或报纸④灭菌：高压蒸气灭菌法 1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _.2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。

再以__两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

待冷空气完全排尽后，关上排气阀。

4）保温保压：当锅内压力升到1_kg/cm2时，控制热源，维持压力至15 _min。

5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。

灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80 ℃_烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_污染_。

⑤倒平板、制斜面操作平台：超净台灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开__紫外线 _和_过滤风，灭菌30min.倒平板：待培养基冷却至__60_ ℃时，将每只培养皿倒入_10~12_ml未凝固的固体培养基，置于_水平_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。