实验一 大肠杆菌的分离和培养

实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。

2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。

3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。

实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。

2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。

实验步骤1. 培养基灭菌。

在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。

既可以通气，又不使细菌进入。

)。

将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。

同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。

2. 倒平板，倒斜面。

灭菌后。

待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。

超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。

将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。

待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。

倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。

倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。

高中生物选修一《生物技术实践》必背知识点实验一大肠杆菌的培养和分离【考点一】培养基1、培养基配置①微生物的生命活动需要五大营养要素：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子；②有的物质既是碳源又是氮源（为微生物生长提供碳元素和氮元素），如：蛋白质、蛋白胨；③有的既是碳源又是生长因子（是微生物生长不可缺少的微量有机物），如：酵母提取物；④“细菌喜荤，霉菌喜素”；细菌喜37℃的温度；霉菌喜25-30℃的温度；⑤细菌的培养基：蛋白胨、酵母提取物、一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压；通常在中性偏碱的环境中生长；⑥霉菌的培养基：一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可；通常在中性偏酸的环境中生长；⑦在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要适宜的pH、温度以及特殊营养物质，以满足微生物生长对的要求。

2、培养基的种类及用途：①液体培养基：呈现液态，用于扩大培养和工业生产；②固体培养基：配制时需加入琼脂（凝固剂），呈固态，用于菌种分离、鉴定、计数等；③我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，用LB固体培养基来分离大肠杆菌。

【考点二】灭菌和消毒1、无菌技术：人们利用微生物完成一定的反应，必须要求某种微生物是没有被其他微生物污染的，因此，在培养微生物时必须进行无菌操作；2、灭菌是用物理或化学的方法，杀死或除去环境中的一切微生物的方法。

杀死病原菌的方法叫消毒。

如：实验室要对使用前和使用后的培养基、各种容器进行灭菌；要对实验服、对病人的排泄物和衣物进行消毒。

3、干热灭菌法：是利用火焰将接种环和试管上的微生物烧死（又称灼烧灭菌法），或在140-160℃的烘箱中加热2-3h，将微生物的营养体和芽孢杀死。

4、加压蒸气灭菌法（高压蒸气灭菌法）：这是生产和实验室常用的灭菌法，将灭菌锅内通入压力达到1000g/cm2的高压蒸气，锅内温度达121℃，持续15-30min，即可达到灭菌目的；注意：当培养基内有葡萄糖时，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力（90℃以上）灭菌30min。

实验1 微生物的分离、培养及计数实验原理纯化分离：人为提供适宜的菌落生长的条件（包括营养、温度、Ph 等）。

用平板划线法，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞菌落。

筛选：转基因大肠杆菌有抗氨苄青霉素基因，所以在含有氨苄青霉素的LB 培养基中可以正常繁殖长成菌落。

而普通的大肠杆菌没有抗氨苄青霉素基因，咋含有氨苄青霉素的LB 培养基中不能繁殖。

由此可进行大肠杆菌的筛选。

梯度稀释并计数：通过浓度梯度稀释把液体培养基培养的大肠杆菌稀释到一定浓度，用稀释涂布平板法，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

由此可计数计算大肠杆菌的数量。

实验目的1. 通过制备LB 固体培养基，对平板进行划线等，学会使用固体LB 平板。

2. 通过用液体培养基，学会对微生物进行扩大培养。

3. 通过稀释，学会用计数器对微生物进行计数。

实验材料和药品待分离的大肠杆菌菌液、高压蒸汽灭菌锅、LB 固体培养基、LB 液体培养基、接种环、玻璃涂布器、培养皿、恒温培养箱、摇床、酒精灯、无菌水、移液枪、EP 管实验步骤（用简单的流程图表示）实验数据的记录与分析（如照片、表格等）实验结果与讨论结果：稀释了105计算出来的结果约为1.726×107ml/cm^3稀释了104计算出来的结果约为0.274×107ml/cm^3全组数据计算出来结果为2.233×107ml/cm^3讨论：在稀释倍数为104的试验中大肠杆菌菌落较少，原因可能是在稀释过程操作中，震荡不够，而且由于不小心洒了半管104稀释液，所以取液接种的时候底层的大肠杆菌数量偏少了。

也有可能是靠近酒精灯附近使得温度升高杀死了一部分细菌或者降低了活性。