美国药典细菌内毒素法27版中文

生物检测实验<85> 细菌内毒素检测♦本文中部分内容与欧洲药典和/或日本药典的相应的内容是一致的，那些不一致的内容则用符号（♦♦）标明。

♦本文提供一种检测或定量可能出现在样品中的细菌内毒素的实验，它使用从鲎（美洲鲎或东方鲎）的循环阿米巴细胞的抽提液中制备的鲎试剂。

♦1细菌内毒素实验有两种技术：基于凝胶形成的凝胶法和光度测定法。

后一种方法包括浊度法——基于一内源性基质断裂后的浊度变化；和显色基质法——基于一个带有生色团的合成肽断裂后颜色的变化。

除非文中另有说明，否则可用上述方法中的任何一种。

若检测结果存在争议，除非文中另有说明，以凝胶法结果为准。

在凝胶法技术中，反应的终点是将供试品稀释液与平行稀释的参考内毒素进行直接比较得到的，内毒素的量用USP内毒素单位（USP-EU）表示。

[注：1 USP-EU等于1 IU 的内毒素]由于有专门制备的浊度法或显色法鲎试剂，因此也可按照要求使用这些检测方法。

这些试验方法要求先建立一条标准回归曲线，供试品的内毒素含量通过该曲线求得。

试验过程包括将内毒素和对照溶液与鲎试剂的反应管按照预先设定的时间恒温孵育，以及在适当波长用分光光度计读取吸光度。

在终点浊度法检测中，孵育期结束时应立刻读取读数；在终点显色法检测中，在到达预先设定的反应时间时，添加酶停止反应试剂使反应停止后再读取读数。

在动态浊度和显色法中，在整个反应期间始终对光密度的进行测定，而百分比值是通过这些读数来确定的。

器械和玻璃用具所有玻璃用具和耐热材料应置于热空气烤箱中有效除热原，♦2通常使用的最少时间和最低温度为30分钟，250℃。

如果使用塑料用具，如微孔板和自动加样器配套的吸头之类的，应确认其不含可测内毒素并不会干扰试验。

[注：在这一章中，“管”这个词泛指其它任何容器，如微量孔板的孔]♦1除了内毒素，鲎试剂也与某些β-葡聚糖反应，一些经过处理而制备的鲎试剂不会与β-葡聚糖反应，对于含有葡聚糖的样品的检测应用此类试剂。

♦2关于灭活内毒素的有效性实验的过程，见灭菌和无菌验证中的干热灭菌。

使用灵敏度不小于0.15EU/ML的鲎试剂。

内毒素标准品原液和内毒素标准品溶液的制备美国药典（USP）的参考内毒素的指定效价为每瓶10,000个 USP 内毒素单位 (EU)。

每瓶内毒素参考品用5mL细菌内毒素检查用水复溶♦3，用旋涡混合器间歇混合30分钟制成原液，并用这个原液制备适当的稀释系列。

将原液置于冰箱中保存作为以后制备稀释液之用，但保存时间不得超过14天。

使用前用旋涡混合器强力混合至少3分钟。

每一步稀释至少混合30秒，然后才能用它进行下一步稀释。

不要贮存内毒素参考品的稀释液，因为没有数据证明吸附作用不会使其失去活性。

预备试验使用复核过标示灵敏度的鲎试剂。

细菌内毒素试验结果是否有效，必须从待检的产品或溶液、洗剂或抽提液中取样，并充分证明它们本身对反应没有抑制、增强作用，否则视为对实验有干扰作用。

可用指定的三种检测方法中所叙述的抑制或增强试验来进行验证。

试验应设置适当的阴性对照。

如果鲎试剂的来源、生产方法或配方发生改变时，都要重新进行验证试验。

供试品溶液的制备用细菌内毒素检查用水溶解或稀释药品或抽提医疗器械来制备供试品溶液。

某些物质或产品用其它水性溶液溶解、稀释或抽提可能更合适。

如果有必要，调节待检溶液（或稀释液）的pH值以使鲎试剂和供试品的混合物的pH值在鲎试剂生产商指定的pH值范围内。

这通常适用于pH值为6.0-8.0之间的产品。

可用酸、碱或鲎试剂生产商推荐的合适的缓冲液调节pH值，酸和碱可用原液或固体物加细菌内毒素检查用水于无内毒素的容器中进行制备。

缓冲液必须经过验证确认无可测的内毒素和干扰因子。

♦3注射用灭菌水或与所用鲎试剂在灵敏度限值内不反应的其它水。

最大有效稀释倍数(MVD)的确定最大有效稀释倍数是供试品被允许的最大稀释倍数，在此稀释倍数下可确定内毒素限值。

它适用于注射液或非经肠道的以溶解或稀释形式给药的药品溶液，或者以重量计算给药剂量的药品如果给药量与按体积计算的给药量有差异。

计算MVD的等式如下:供试品溶液的浓度和λ定义如下，当内毒素限值浓度以体积表示(EU/mL)时, 用限值除以λ来计算MVD倍数, λ是鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）；当内毒素限值浓度以重量或活性单位（EU/mg或EU/U）表示时，用限值乘以供品溶液浓度或依据标签上的说明复溶的供试品浓度（mg/mL或单位/mL），视乎哪个更合适，然后将乘积除以λ来得出MVD倍数。

由此获得的 MVD 倍数即是制备有效的供试液的最大稀释倍数。

内毒素限值的建立依据剂量来定义，非经肠道药品的内毒素限值等于K/M♦4, K 是人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，M是人每公斤体重每小时的最大注射剂量。

非经肠道药品的内毒素限值在其他文中有给出，以单位表示，如EU/mL、 EU/mg 或 EU/生物活性单位。

凝胶法技术凝胶法技术是根据鲎试剂在出现内毒素时会产生凝胶的原理来定量检测内毒素的方法。

在标准条件下,能使鲎试剂产生凝胶的内毒素的最低浓度为鲎试剂的标示灵敏度。

为确保该实验的精确性和有效性，应进行标示灵敏度的复核试验和干扰试验，在“凝胶法预备试验”中介绍了这两个试验。

♦4除了鞘内给药（K=0.2USP-EP/公斤体重）外，任何给药途径的K都等于5 USP-EU/kg。

对于非鞘内给药的放射性药品，其内毒素限值=175/V，V为每毫升的最大推荐剂量；对于鞘内给药的放射性药品，其内毒素限值=14/V。

对于按每平方米体表面积给药的药品（通常为抗癌产品），内毒素限值公式为K/M，22）/ 70kgλ供试品溶液浓度内毒素限值⨯=MVD凝胶法预备试验鲎试剂灵敏度复核试验—每批鲎试剂至少取1支样品来复核标示灵敏度。

用细菌内毒素检查用水将USP内毒素参考标准品溶解制成一个2倍稀释系列，即2λ, λ, 0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准品溶液, λ定义如上。

4个浓度的内毒素标准品溶液分别重复4管检测并设置阴性对照管。

当使用新批号的鲎试剂或当试验条件发生了可能影响试验结果的变化时，须进行鲎试剂标示灵敏度复核试验。

将一定量的鲎试剂和等量（如0.1mL）的各浓度内毒素标准溶液分别加入每支检测试管中混合，如果使用装有冻干鲎试剂的单次试管或安瓿，可将溶液直接加入试管或安瓿中，根据鲎试剂生产商的建议将反应混合物恒温孵育一段时间（通常是37±1℃，60±2分钟），避免振动。

将每支试管轮流从恒温箱中直接取出并轻轻翻转180︒观察结果，如果内容物形成坚实凝胶并在试管翻转后不从管壁滑脱，则记为阳性；如果未形成完整的凝胶，则结果为阴性。

最低浓度的标准品溶液的所有重复管都为阴性结果时，试验才为有效试验。

终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

按下式计算反应终点浓度的对数平均值然后求此平均值的反对数：终点浓度的几何平均值 = antilog (∑e/f)式中∑e 为所用稀释系列的终点浓度的对数值之和，f 为重复试管数。

终点浓度几何平均值为鲎试剂灵敏度的测定值(EU/mL)。

如果该值在0.5λ～2λ之间，则该批鲎试剂的标示灵敏度符合规定，可以用于试验。

凝胶法干扰试验—按表1制备溶液A, B, C 和 D 并用不超过MVD稀释的不含有可检测到的内毒素供试品溶液进行抑制/增强试验，操作方法同上述鲎试剂标示灵敏度的复核项下。

溶液B和 C 的终点浓度几何平均值的计算与该检测中使用的等式相同。

溶液 A: 无可测内毒素的待检供试品溶液溶液 B: 实验干扰对照溶液 C: 鲎试剂灵敏度复核对照溶液 D：阴性对照（检查用水）当任何有可能影响检测结果的条件改变时应重新进行试验。

如果该试验中溶液A和D所有重复管都为阴性结果，而且溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内，则认为此次试验有效。

如果用溶液B所测得的试剂灵敏度在0.5λ～2.0λ之间，则供试品溶液在所使用的试验条件下没有干如果供试品在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释后，再重复干扰试验。

使用高灵敏度的鲎试剂可对供试品进行更大倍数的稀释，这有助于消除干扰。

干扰可用适当的方法来排除，例如中和、透析或加热。

为了证明所选择的处理方法有效消除了干扰而不且已经过选定的方法处理制备的供试品溶液进行下述试验。

凝胶法限量试验对内毒素限值有要求时使用这种检测方法。

方法—按表2制备溶液 A, B, C 和 D，按照凝胶法预试验项下的鲎试剂标示灵敏度复核试验步骤进行试验操作。

表 2 凝胶法限量试验的溶液制备溶液* 内毒素浓度/添加了内毒素的溶液重复管数A 无/稀释的供试品溶液 2B 2λ/稀释的供试品溶液 2C 2λ/细菌内毒素检查用水 2D 无/细菌内毒素检查用水 2*用不超过最大有效稀释倍数和凝胶法预试验项下的干扰试验中所述的处理方法来制备溶液 A 和阳性产品对照溶液B，阳性对照溶液B和C中含有相当于2λ浓度的标准内毒素。

阴性对照溶液D为细菌内毒素检查用水。

结果判断—当阳性对照溶液B和C中所有重复管均为阳性结果以及阴性对照溶液D所有重复管均为阴性结果时，试验方为有效。

如果溶液A的两支重复管均为阳性时，供试品不符合规定。

如果溶液A中一管为阳性结果另一管为阴性结果，则需重复此试验，重复试验中，如果溶液A的两管均为阴性结果，则该供试品符合规定。

如果用小于MVD的倍数稀释供试品其检测结果为阳性，则该试验可重复进行，但稀释倍数不得大于MVD。

凝胶法半定量试验本方法是通过确定终点浓度来量化供试品溶液中的细菌内毒素。

方法—按表3制备溶液A、B、C和D。

按照凝胶法预试验项下的鲎试剂标示灵敏度复核试验步骤进行试验操作。

释倍数。

用细菌内毒素检查用水将已通过干扰试验的四管供试品溶液再进行1, 2, 4和 8倍稀释。

也可用其它适当的稀释倍数。

溶液 B: 含浓度为2λ的标准内毒素的溶液A(产品阳性对照)溶液C: 分别含浓度为2λ, λ, 0.5λ和 0.25λ的标准内毒素的两个细菌内毒素检查用水系列，每个系列4个浓度溶液 D: 细菌内毒素检查用水 (阴性对照)计算与说明—当试验符合以下条件时才为有效试验： (1) 阴性对照溶液D的两支重复管均为阴性结果(2) 样品阳性对照溶液B的两支重复管均为阳性结果(3) 溶液C的终点浓度的几何平均值在0.5λ～ 2λ范围内。

要计算溶液A的内毒素浓度，可将每一终点对应的稀释倍数乘以λ计算出每个稀释系列的每支重复管的终点浓度，供试品溶液的内毒素浓度即是各重复管的终点浓度的几何平均值（公式用“凝胶法预试验”项下鲎试剂灵敏度复核试验中的公式）。

如果试验中用的是稀释过的供试品溶液，计算其原始供试品溶液的内毒素浓度时，可以用原始浓度乘以各自的稀释倍数。