下载文档原格式
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分对细菌内毒素的检验方法主要包括以下几个方面：
1. 细菌内毒素的生物学活性测定：采用小鼠、兔等动物模型，通过观察动物的反应和生存情况来评价细菌内毒素的生物学活性。
2. 免疫学方法：利用抗体与内毒素结合反应，通过免疫沉淀、凝胶免疫扩散、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析等方法来定量或定性检测细菌内毒素。
3. 生理检验：通过动物模型中的生理变化来判断细菌内毒素的存在与活性。
比如利用皮肤红斑反应、大鼠血压升高、家兔体温升高等指标。
4. 生化检验：采用染色反应、化学方法、酶活测定等手段来检测细菌内毒素的存在与活性。
比如利用抗原-抗体反应进行凝集、沉淀、免疫层析等实验。
以上这些方法都是中国药典第二部分中针对细菌内毒素的常用检验方法。
不同的方法适用于不同的细菌内毒素类型和浓度范围，综合运用可以提高检测的灵敏度和准确性。
2.6.14 细菌内毒素本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus——血细胞提取物（amoebocyte lysate）制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。
该检查包括三种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；第二种为浊度法（基于内源性底物断裂后，产生的浊度变化）；最后一种为显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
这一章阐述了下面6种方法：方法A：凝胶法：限度试验方法B：凝胶法：半定量试验方法C：动态浊度试验方法D：动态显色法方法E：终点显色法方法F：终点浊度法检测时，可用6种方法的任一种进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以专论中的方法A的测定结果为准。
试验操作过程应防止内毒素的污染。
仪器所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
注：这一章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。
内毒素储备标准溶液的制备用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如内毒素标准BRP。
内毒素以国际单位（IU）表示。
IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。
注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。
根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。
内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BET检查用内毒素标准溶液。
得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。
供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。
细菌内毒素检测方法细菌内毒素是一类由细菌产生的有毒物质，它们可以对人体和动物产生严重的危害。
因此，对细菌内毒素进行及时、准确的检测显得尤为重要。
本文将介绍几种常见的细菌内毒素检测方法，以供参考。
首先，常见的细菌内毒素检测方法之一是生物学检测法。
这种方法利用动物、细胞或其他生物体对内毒素的反应来进行检测。
例如，利用小鼠腹腔注射内毒素，观察其生理反应来判断内毒素的存在与否。
虽然这种方法具有较高的灵敏度和特异性，但由于涉及动物实验，存在一定的道德和法律问题，因此在实际应用中受到一定的限制。
其次，化学检测法也是一种常用的细菌内毒素检测方法。
该方法利用化学试剂与内毒素发生特定反应，通过观察反应产物的形成或颜色变化来判断内毒素的存在与否。
例如，内毒素在特定条件下可与Limulus试剂发生凝集反应，形成凝集物。
这种方法具有操作简便、结果快速的优点，但也存在一定的特异性和灵敏度问题。
另外，免疫学检测法也是一种常见的细菌内毒素检测方法。
该方法利用抗体与内毒素特异性结合，再通过染色、发光等方式来检测结合产物，从而判断内毒素的存在与否。
例如，ELISA法是一种常用的免疫学检测方法，它具有高度的特异性和灵敏度，且可以进行高通量检测，因此在实际应用中得到了广泛的应用。
最后，分子生物学检测法也是一种较为先进的细菌内毒素检测方法。
该方法利用PCR、基因芯片等技术，通过检测内毒素相关基因或基因产物来判断内毒素的存在与否。
这种方法具有高度的特异性和灵敏度，且可以进行多重检测，因此在临床诊断和科研领域得到了广泛的应用。
综上所述，针对细菌内毒素的检测方法有生物学检测法、化学检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法等多种选择。
在实际应用中，可以根据需要的特异性、灵敏度、操作简便性等因素来选择合适的检测方法。
希望本文所介绍的内容能够对相关人士有所帮助。
BET常见异常结果分析湛江安度斯生物有限公司2016年7月实验助手APP授权发布1BET常见异常结果分析凝胶法灵敏度复核不符合规定阳性对照阴性供试品阳性对照阴性阴性对照阳性供试品一阳一阴21.阴性对照为阳性✓实验环境-有扬尘；✓实验操作不规范-人为污染；✓配套用品（移液管、反应管、吸头污染或没有完全除热原）✓试剂性能-鲎试剂或水出问题✓设备-恒温水浴，水滴进反应混合液中32.阳性对照为阴性✓标准内毒素溶液的制备是否准确；✓试剂性能（内毒素标准品、鲎试剂和检查用水的质量和是否匹配）；✓配套用品（移液管、稀释管、反应管、吸头是否有干扰）；✓操作是否规范；✓设备-恒温孵育的温度和时间是否合适；✓实验环境；43.供试品阳性对照为阴性阳性对照为阴性，供试品阳性对照为阴性—参考实验结果出现异常的分析2） 阳性对照为阳性，供试品阳性对照为阴性✓供试品阳性对照溶液配制是否正确；✓供试品有抑制干扰作用；✓配套用品（稀释管、反应管、移液用具是否有干扰）；✓其他54.阴性对照正常，供试品为阳性供试品内毒素含量不符合规定；污染✓配套用品（稀释管、反应管、刻度吸管、吸头）；✓试验操作、环境、试剂等假阳性-增强干扰作用•凝胶法中，没有对照项可以判断供试品是否存在增强作用。
64.阴性对照正常，供试品为阳性假阳性的判断凝胶法检测配套稀释液抗增液复溶鲎试剂特异性鲎试剂光度法检测分析内毒素含量反应动力学曲线分析75.同一供试品结果有时阳性，有时阴性样品✓供试品内毒素含量在1/2L左右；✓供试品存在干扰试剂-不同试剂，抗干扰能力不同试验条件（环境、人员操作技能、恒温孵育温度和时间）86.灵敏度复核不符合规定参照案例分析（二）鲎试剂灵敏度复核不符合规定原因调查。
9BET常见异常结果分析光度法标准曲线的线性不合格变异系数大内毒素回收率不合格阴性对照不合格不正确的预设Rt或OD值，导致的异常结果101.线性不足标准内毒素•某个标准内毒素浓度制备误差•标准品旋涡混合不充分•标准品储存不当或用具干扰试剂•污染•检测能力不足仪器设置•不正确的预设Rt/OD值不正确的反应时间•终点法112.阴性对照不合格配套用品激活（污染）鲎试剂✓塑料吸头和吸管可激活或污染鲎试剂 反应试管或孔没有完全除内毒素操作污染✓细菌内毒素检查用水✓鲎试剂✓反应试管或孔受污染试剂灵敏度不足或不合适的预设Rt/OD123.变异系数偏大气泡试剂质量加样误差试管/孔受污染移液管/吸头污染样品沉淀或悬浮内毒素添加的量不准确134.回收率问题标准内毒素溶液制备或加入不准确 试剂加入不准确样品✓内毒素浓度太高✓抑制作用✓增强作用✓工艺、原辅料的改变145.不正确的预设Rt或OD值，导致的异常结果预设Rt/OD值指光度变化值，是一个参考值，一般由鲎试剂生产厂家提供。
细菌内毒素检查王文洁一、试剂及仪器注射用头孢他啶鲎试剂（λ—标示灵敏度），细菌内毒素标准品，细菌内毒素检查用水（BET水），仪器（严格消毒）质量标准：《中国药典》（2005年版）第二部p135细菌内毒素检查法：附录Ⅺ二、实训内容1.细菌内毒素标准溶液的制备150 15 1.0 0.5 0.25 0.1250.2 1.8BET 0.2 2.8BET 0.9 0.9BET 0.9 0.9BET 0.90.9BET 2λ λ 0.5λ 0.25λ2.供试品溶液的制备供试品的最大有效稀释倍数（MVD）MVD＝C×L／λC-- 为供试品的浓度（当L以EU/ml表示时，C取1.0ml/ml）L-- 为供试品的细菌内毒素限值，EU／mlλ-- 鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）3.对照PC－阳性对照－－2λ内毒素溶液PPC－供试品阳性对照－－含2λ内毒素溶液的供试品NC－阴性对照－－BET水4.检查S PC PPC NC各两支将安瓿瓶中溶液轻轻混匀后，封口膜封口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60±2分钟。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。
细菌内毒素检查－－鲎试剂法美国药典近800种药物要用细菌内毒素检查法来做为质量控制手段。
我国药典至2005年版正式收载了需“细菌内毒素检查法”品种达234种。
2005版《中国药典》二部收载的细菌内毒素检查法部分品种表药品名称限值页码甘露醇注射液 2.5 EU/g 720.5 EU/ml 91 右旋糖酐70氯化钠注射液甲硝唑注射液 0.35 EU/mg 124 注射用头孢他啶0.1 EU/mg 135 注射用苄星青霉素0.25 EU/1000单位 228 谷氨酸钾注射液0.012 EU/mg 269 维生素C注射液 2.5 EU/ml 6712005版《中国药典》三部收载的细菌内毒素检查法部分品种表药品名称限值页码乙型脑炎灭活疫苗100EU/微克34人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）100EU/每1次人用剂量95重组乙型肝炎疫苗（酵母）成品10EU/ ml 115注射用重组人干扰素γ成品10EU/每1次人用剂量225注射用重组人白介素-2 成品10EU/每1次人用剂量227鲎试剂法优点快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品。
鲎试剂法局限性对革兰阴性杆菌以外的内毒素不够灵敏。
（鲎变形细胞溶解物）凝固酶内毒素、Ca 2+原理活化的B 因子LAL 中的B 因子凝固酶原凝固原(可凝性蛋白)凝固蛋白（凝固素)凝胶细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法光度测定法:包括浊度法和显色基质法•细菌内毒素检查可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除有专门说明外，以凝胶法结果为准。
概述1.抗生素（antibiotics）在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称2.分类β–内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类)氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、依替米星)四环素类(四环素、金霉素、土霉素)大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素)多烯大环类(制霉菌素、两性霉素B)多肽类(多黏菌素、放线菌素)3.来源✓生物合成（发酵）✓化学合成或半合成4.特点✓化学纯度较低✓活性组分易发生变异✓稳定性差5.抗生素质量分析——生物学法、物理化学法鉴别：理化方法、微生物法检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等含量/效价测定：微生物法：与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大理化方法：准确度与专属性较高, 且操作简便；但与临床疗效有偏差CH 2COHNNSCH 3CH3COOH Oβ–内酰胺类CH COHN NH 2NS CH 3CH 3COOHO氨苄西林CH COHN NH 2HONS CH 3CH 3COOHO阿莫西林青霉素（苄青霉素） （penicillins ）CH COHN NH 2CH 3NOS COOH头孢氨苄CH 3NOS COOHCH COHN NH 2头孢拉定CH 3NOS COOHCH COHN NH 2HO头孢羟氨苄SCH 2CONHNSCH 2COONaCOONa头孢噻吩钠7654321N O NH S CH 2R 1COOH 母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO 7-aminocephalosporanic acid, 简称7-ACA 头孢菌素类N SCH 2R 1COOH O RCONH 12345678N S CH 3CH 3COOH OHN 1234567RCO 母核（6-氨基青霉烷酸）6-aminopenicillanic acid, 简称6-APA 青霉素类 N S CH 3CH 3COOH RCONH O 1234567氢化噻唑环 氢化噻嗪环 ＊＊ ＊ ＊ 母核：6－氨基青霉烷酸母核：7－氨基头孢菌烷酸结构与性质1.酸性（羧基）pKa2.5-2.8，酸性较强。
碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。
N SCH3CH3COOKO1234567COHN CH2N SCH3CH3COOHO1234567COHNCH2普鲁卡因2.手性C （旋光性） N S O 1234567N S O 12345678﹡ ﹡﹡ ﹡ ﹡ 3.UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构 260nm4. β–内酰胺环(四元环张力+酰胺键 )干燥条件较稳定，溶液不稳定失效降解青霉素类酸、碱、青霉素酶−−−−−−→−某些氧化剂、金属离子、温度失效降解头孢菌素类酸、碱、胺类−−−−−→−内酰胺酶-βIdentification(一)色谱法HPLC (t R)TLC (R f)(二)光谱法IR UVCHCOHN N SCH 3CH3COOHO HO NH 2(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环 β–内酰胺类NH 2OH·HCl NaOH 羟肟酸 Fe 3+ H + 显色 2）茚三酮反应——α-氨基茚三酮Δ 蓝紫色 NS O HN S C NHOH O HN SC O O NH Fe3+/3(红、棕、褐)CH 2NH 2COHN C OHO S N H COONa CH 3CH 3CH 2NH 2COHN C HO N S HCH 3CH 3COONaO Cu(OH)2CNH 2H +O O HO HO C OH O N C O O+C O 2+3H 2O α 3）双缩脲反应——β–内酰胺类碱性酒石酸铜 紫色CH 2COHNNS O CH 3CH 3COOK H 2SO 4HCHO 变色酸（缩和）显色4）变色酸-硫酸反应5）重氮苯磺酸反应——酚羟基橙黄色重氮苯磺酸−−−→−--OH H C 56（偶合） 6）铜盐反应——头孢氨苄的专属反应橄榄绿色−−−→−−−−→−−−→−NaOH 4CuSO HAc7）硫酸-甲醛反应(BP )呈暗黄色氨苄西林水浴加热甲醛硫酸水湿润−−−→−−−−−→−−−−→−-青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)焰色反应——K +、Na +Purity Test (聚合物、有关物质、异构体等)头孢他啶中聚合物测定O O O HO OHCH 2O O O HO OHCH 2OOO HO OHCH 2OOO HOOH CH 2O O HO OHCH 2OO CH 3OH OH OOOCH 2OHHO O O OHO HOO H 2C OO OO OHHO H 2COO H 2C OH HOO CH 2O OO H 2C O OH HOO OO O HO OH CH 2OO CH 2OH HO OO O O CH 2OH HO O OO CH 2OH HO OO O H 2C OH HO O O OCH 2OHHO O O O OO HOHOH 2C OOH 2COHO CH 2OH HO OOH 2C O CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH HCOHCH 2CH 2CH 2HCOH 萄聚糖凝胶 立体网状结构图 原理——“分子筛”氨基糖苷类氨基环醇+氨基糖→苷链霉素(Streptomycin)OOCH 2OHHOOHNH 2ONH 2H 2NOOH OCH 2OH HOOR 1R 2OHHOH 2N巴龙霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺 脱氧链霉胺 巴龙胺D －核糖 巴龙霉糖巴龙二糖胺OOCRR 1R 2HNONH 2OHONH 2H 2NOHNHCH 3OHCH 3庆大霉素(gentamycin )绛红糖胺(紫素胺)2-脱氧链霉胺 加洛糖胺(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺)Identification坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄 糖胺反应OONHC NH NH 2HO NH 2CNHNHOHOHOO OHCHOCH 3NH CH 3CH 2OHOHOHN-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan 反应）甲基葡萄糖胺庆大霉素链霉素水解-−−→−N 乙酰丙酮OH -吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H +红色OONHC NH NH 2HO NH 2CNHNHOHOHOO OHCHOCH 3NH CH 3CH 2OHOHOH 乙酰丙酮OH -对二甲氨基苯甲醛 H +N HCOCH 3CH 3HOCH 2(CHOH)3NH 3CH 3CCHN HCOCH 3CH 3N HCOCH 3CH 3麦芽酚反应——链霉糖特有反应紫红色麦芽酚链霉糖链霉素分子重排−−→−−−−→−−−→−+-3OH Fe H +坂口反应——链霉胍特有反应链霉素 OH - 水解 8-羟基喹啉 NaOBr或α-萘酚链霉胍 橙红色四环素类A BCD123 45678 9101112R R 1R 2R 3HN(CH 3)2OH CONH 2OOH OHOOH结构与性质1）两性： -OH →酸性 N(CH 3)2→碱性Ca 2+、Mg 2+生成不溶性盐；Fe 3+形成红色配合物；Al 3+形成黄色配合物 ；pH3 ~ 7.5 多价阳离子与酚二酮→荧光与酸、碱均可成盐； 临床多用盐酸盐；强酸或强碱中溶解度↑2）旋光性3）UV 和荧光4）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基)弱酸性（pH2-6） A 环C-4异构化 差向四环素 酸性（pH < 2） C 环脱水 脱水四环素 碱性 C 环开环，形成内酯 异四环素 5）不稳定性A.差向异构化差向金霉素差向四环素金霉素四环素～--−−→←4462pH 蓝色荧光淡黄→黑R 1R 2OHHN(CH 3)2OH CONH 2OOHOHOOHOOH CONH 2(CH 3)2NOHHOOHCONH 2N(CH 3)2HOHAApH2.0~6.0（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）B.酸性脱水降解脱水金霉素脱水四环素金霉素四环素＜−−→−2pH λmax = 445nmλmax = 435nmR OHCH 3OHOOHHRCH 3OHOOHRCH 3OHOHOH 2OD D D C BBC BCC.碱性脱水降解)(无活性异四环素四环素−−→−-OHR OHCH 3OH R'''OOH OOH CONH 2NH OH CH 3CH 3CH 3CH 3ROH R'''OO OH CONH 2NH OH O CH 3O OH-技能：掌握采用鲎试剂法—凝胶法进行细菌内毒素检查操作方法掌握根据观察阳、阴性结果判断细菌内毒素检查是否合格的方法相关理论：掌握鲎试剂法检查细菌内毒素的原理掌握细菌内毒素检查的意义熟悉抗生素类药物主要类别及性质。
