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肠杆菌科的鉴定1、标本要求：1.1 尽量用药前采集标本。
1.2 痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。
1.3 尿液：病人留取12h尿液，送检。
1.4 粪便：病人留取粪便5 10g，送检。
1.5 脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。
血标本不要冷冻。
1.6 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。
2、仪器35℃孵箱、普通光学显微镜3、试剂羊血平皿、麦康凯平皿、硝酸盐培养管、葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖酸盐培养管、苯丙氨酸脱氨培养管、氨基酸脱羧培养管、拘橼酸盐培养管、尿素培养管、糖醇发酵管、湖南长沙天地人肠杆菌鉴定板。
4、试验方法及原理：4.1 硝酸盐还原试验：方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。
结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。
注意点：（1）．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。
（2）．某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。
所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。
若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。
4.2 甲基红试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。
结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。
4.3 尿素培养基方法：将待检菌穿刺接种于尿素培养基中，孵育过夜，观察结果。
结果：培养基变红为尿素阳性，不变色为阴性。
4.4 拘橼酸盐试验(Simmons法)方法：将待检菌接种于拘橼酸盐培养基中，孵育过夜，观察结果。
结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。
4.5 氨基酸脱羧试验方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。
结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。
微生物检验肠杆菌科及检验第十九章肠杆菌科及检验本章考点：1.概述（1）概念（2）命名与分类原则（3）共同特点（4）自然与人体内的分布（5）微生物学检查方法（6）临床意义2.埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属（1）生物学性状（2）微生物学检查法（3）临床意义一、概述和通性（一）概念肠杆菌科是由多个菌属组成，其生物学性状相似，均为革兰阴性杆菌。
大多数肠道杆菌属于正常菌群，作为条件致病菌而引起疾病。
其中包括常引起腹泻和肠道感染的细菌（埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌属）和常导致院内感染的细菌（枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属和摩根菌属），以及一些在一定条件下偶可引起临床感染的细菌。
（二）分类根据《伯杰系统细菌学手册》（1984年）将肠杆菌科的细菌分为20个属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威登斯菌属、变形杆菌属、摩根菌屑、耶尔森菌属等。
（三）生物学特性1.形态与染色革兰阴性杆菌，其菌体大小为（ 1.0～6.0）μm×（0.3～1.0）μm。
多数有周鞭毛，除外志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC无鞭毛。
均不形成芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。
2.培养：需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上均能生长并形成中等大小的S型菌落，液体培养基中呈混浊生长。
3.生化反应：发酵葡萄糖产酸、产气，乳糖发酵试验: 肠道非致病菌（＋），肠道致病菌（－）（除外变形杆菌）。
肠杆菌科定科试验主要项目是革兰阴性杆菌、触酶阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原试验阳性。
4.抗原构造：包括菌体（O）抗原，鞭毛（H）抗原和表面抗原（如Vi抗原、K抗原）3种。
5.变异：包括菌落S～R变异，鞭毛H～O变异和耐药性或生化反应性质的改变。
6。
抵抗力：不强。
加热60℃，30分钟即被杀死。
实验六肠杆菌科细菌的微生物学鉴定课程名称:兽医微生物学实验学时:6学时一、目的要求1.熟悉大肠杆菌和沙门氏菌形态与染色特性以及主要培养特性;2.熟悉大肠杆菌和沙门氏菌常规微生物学诊断法;3.掌握大肠杆菌和沙门氏菌生化试验的方法和原理;4.熟悉大肠杆菌和沙门氏菌在选择性和鉴别培养基上的生长表现;5.熟悉沙门氏菌血清分群、定型的方法和步骤。
二、知识背景肠杆菌科的细菌为革兰氏阴性、中等大小的杆菌,运动者周身鞭毛;在普通培养基上生长好;发酵葡萄糖和碳水化合物者产酸或产酸产气;在麦康凯琼脂上生长;细胞色素氧化酶阴性;还原硝酸盐为亚硝酸盐等。
碳水化合物的利用和其它生化试验是肠杆菌科细菌鉴定的重要试验。
大肠埃希氏菌(E.coli简称大肠杆菌,作为原发和继发病原可引起多种动物疾病:犊牛的肠道感染和水泻;幼猪的水泻和腹泻,二月龄以上猪的出血性肠炎和水肿病;狗的尿道感染;鸡的气囊炎和大肠杆菌肉芽肿(Coligranuloma。
沙门氏菌(Salmonella,虽然沙门氏菌血清型超过2200个,但承认的种为数不多,在O抗原的基础上,沙门氏菌血清组(群用字母A、B、C…表示,然后根据它的H抗原(鞭毛抗原再分,用阿拉伯数字1、2、3…等表示,沙门氏菌可引起多种动物和人的疾病,是肠杆菌科重要的致病菌,如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium可引起动物流产,胃肠炎和败血症。
其它肠杆菌科成员:肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae可引起牛乳房炎、肺炎、母马的宫颈炎和子宫炎,这个菌常形成厚的荚膜。
变形杆菌(proteus引起动物的尿道和胃肠道疾病。
耶尔森氏菌(yersinia引起鼠疫、胃肠炎等。
生化试验和血清群的鉴定和定型在肠杆菌科细菌的鉴定中占很重要的位置。
三、实验材料每6人一组,每组所需材料:1.普通琼脂斜面培养物2管:分别为大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(提供实验用菌种;2.普通肉汤2管:分别用来接种大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌;3.普通琼脂平板2个分别用来划线接种大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌;4.生化试验用培养基2套,包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵试验管、靛基质,M.R、V.P试验、柠檬酸盐利用,硝酸盐还原试验等;5.三糖铁琼脂斜面培养基2管;6.选择性培养基2个,如:麦康凯琼脂平板或远滕氏琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板;7.各种生化试验试剂:靛基质试剂,M.R试剂,V.P试剂,硝酸盐还原试剂;8.沙门氏菌因子血清。
肠杆菌科其他菌属的微生物学检验肠杆菌科除上述主要对人致病的菌属外，还有克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属等，为条件致病菌，在临床上感染性疾病中较常见。
1 克雷伯菌属克雷伯菌属主要包括肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌等，为条件致病菌，临床上感染性疾病中以肺炎克雷伯菌多见。
肺炎克雷伯菌包括肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种。
1.1微生物学检验：克雷伯菌检验程序可按肠杆菌科细菌进行检验。
据不同疾病采集不同标本，如血液、痰、脓汁、尿液、脑脊液、胸水和腹水等。
取痰、脓汁、尿液、脑脊液、胸水、腹水标本，离心后将沉淀物涂片做革兰染色镜检，可见革兰阴性球杆菌，有明显的荚膜。
血液标本或穿刺液标本接种于肉汤培养基增菌培养，其他标本接种于血平板和MAC平板。
35℃孵育18～24 h，取血平板上灰白色大而黏稠的菌落和 MAC上乳糖不发酵型黏液菌落，作进一步鉴定。
菌落性状、形态染色特性符合克雷伯菌的特点，氧化酶阴性、硝酸盐还原阳性，在KIA试验斜面产酸、底层产酸产气、H2S阴性，MIU试验为－－+／－，V－P试验为阳性，可初步鉴定为克雷伯菌。
然后可进一步进行生化反应鉴定到种和亚种，并结合荚膜肿胀试验进行鉴别。
1.2生物学性状：形态与染色：克雷伯菌为革兰阴性杆菌，卵圆形或球杆状，常成双排列，有菌毛；无芽胞，无鞭毛。
有明显的荚膜，荚膜肿胀试验是本属菌与其他类似菌的主要鉴别方法；培养特性：克雷伯菌兼性厌氧，营养要求不高，在血平板上形成较大凸起、灰白色、不透明、不溶血、黏液型菌落，用接种环挑起时可出现拉丝现象。
在肠道选择培养基上，可发酵乳糖产酸，形成较大的有色黏稠菌落。
在液体培养基中呈混浊型生长，可见菌膜和黏性沉淀物。
生化反应：克雷伯菌IMViC试验结果为－－++，脲酶、ONPG、丙二酸盐、黏质酸盐试验呈阳性。
1.3临床意义克雷伯菌是医院感染中常见的条件致病菌，以肺炎克雷伯菌感染较多见。
肺炎克雷伯菌可引起典型的原发性肺炎，也可引起肺外感染，如肠炎、婴儿脑膜炎、菌血症、泌尿系统感染等。
实验六肠杆菌科细菌的微生物学鉴定
课程名称：兽医微生物学实验学时：6学时
一、目的要求
1．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌形态与染色特性以及主要培养特性；
2．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌常规微生物学诊断法；
3．掌握大肠杆菌和沙门氏菌生化试验的方法和原理；
4．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌在选择性和鉴别培养基上的生长表现；
5．熟悉沙门氏菌血清分群、定型的方法和步骤。
二、知识背景
肠杆菌科的细菌为革兰氏阴性、中等大小的杆菌，运动者周身鞭毛；在普通培养基上生长好；发酵葡萄糖和碳水化合物者产酸或产酸产气；在麦康凯琼脂上生长；细胞色素氧化酶阴性；还原硝酸盐为亚硝酸盐等。
碳水化合物的利用和其它生化试验是肠杆菌科细菌鉴定的重要试验。
大肠埃希氏菌（E.coli）简称大肠杆菌，作为原发和继发病原可引起多种动物疾病：犊牛的肠道感染和水泻；幼猪的水泻和腹泻，二月龄以上猪的出血性肠炎和水肿病；狗的尿道感染；鸡的气囊炎和大肠杆菌肉芽肿（Coligranuloma）。
沙门氏菌（Salmonella），虽然沙门氏菌血清型超过2200个，但承认的种为数不多，在O抗原的基础上，沙门氏菌血清组（群）用字母A、B、C…表示，然后根据它的H抗原（鞭毛抗原）再分，用阿拉伯数字1、2、3…等表示，沙门氏菌可引起多种动物和人的疾病，是肠杆菌科重要的致病菌，如鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）可引起动物流产，胃肠炎和败血症。
其它肠杆菌科成员：肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）可引起牛乳房炎、肺炎、母马的宫颈炎和子宫炎，这个菌常形成厚的荚膜。
变形杆菌（proteus）引起动物的尿道和胃肠道疾病。
耶尔森氏菌（yersinia）引起鼠疫、胃肠炎等。
生化试验和血清群的鉴定和定型在肠杆菌科细菌的鉴定中占很重要的位置。
三、实验材料
每6人一组，每组所需材料：
1．普通琼脂斜面培养物2管：分别为大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌（提供实验用菌种）；
2．普通肉汤2管：分别用来接种大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌；
3．普通琼脂平板2个分别用来划线接种大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌；
4．生化试验用培养基2套，包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵试验管、靛基质，M．R、V．P试验、柠檬酸盐利用，硝酸盐还原试验等；
5．三糖铁琼脂斜面培养基2管；
6．选择性培养基2个，如：麦康凯琼脂平板或远滕氏琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板；
7．各种生化试验试剂：靛基质试剂，M．R试剂，V．P试剂，硝酸盐还原试剂；
8．沙门氏菌因子血清。
四、操作程序
1．观察大肠杆菌和沙门氏菌在琼脂平板上的菌落特征并作描述；
2．观察大肠杆菌和沙门氏菌肉汤培养物，注意生长表现；
3．从两种菌琼脂平板上挑取菌落涂片作革兰氏染色，注意菌体形态特征和染色特性；
4．用两种菌琼脂斜面培养物分别接种生化试验用的各种培养基以及三糖铁琼脂斜面（先斜面划线再穿刺接种）；
5．用两种菌肉汤培养物在鉴别性培养基平板划线，分别用其1/2面积；
6．将接种的试管和平板以组为单位放人37℃培养箱中培养24-48小时，观察结果；
7．检查并记录大肠杆菌和沙门氏菌糖发酵试验结果及在三糖铁琼脂斜面/底部的生长表现；
8．观察大肠杆菌和沙门氏菌在麦康凯琼脂平板上的菌落表现；
9．沙门氏菌血清群和型的鉴定。
（1）分群：取一张洁净玻片，取2满环沙门氏菌多价O血清（A—E群）至玻片上，再用接种环挑取疑为沙门氏菌的纯培养物少许，与玻片上的多价O血清混匀，再稍动玻片，若在2min内出现凝集现象，即可初步确定该菌为沙门氏菌：同样用生理盐水代替多价血清作一对照，以免由于细菌的自凝而判断错误。
再用代表A群（O2）、B群（O4）、C1群（O7）、C2群（O8）、D群（O9）与E群（O3）的O因子血清作同样的玻片凝集反应，视其被哪一群O因子血清所凝集，则确定被检沙门氏菌为该群。
（2）定型：菌群决定后，用该群所含的各种O因子血清和被检菌作玻片凝集反应，以确定其含哪些O抗原。
同样，用该群H因子血清与被检菌作玻片凝集反应、以确定其H抗原。
根据检出的O抗原和H 抗原列出被检菌的抗原式，查对沙门氏菌的抗原表即可知被检菌为哪种沙门氏菌，譬如某一菌的O 抗原为O1、4、5、12，而H抗原为i：1,2，其抗原结构式为1,4,5,12:i:1,2，查知这个菌为鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimuium）。
一般情况下，如不要求定型，只做到定群这一步即可。
在实际工作中，判定被检菌是否为沙门氏菌，应根据被检菌的生化反应和血清学诊断结果结合起来考虑。
凡两者均符合沙门氏菌特性，即确认为沙门氏菌，凡两者中有一项符合沙门氏菌特性者，则可认为是沙门氏菌。
本实验中大肠杆菌与沙门氏菌的区别
肠杆菌科细菌检验程序示意图
五、细菌特性描述 菌种
描述其主要生物学特性与生化特性 菌 落：
革兰氏染色：
菌体形态：
运 动 性：
葡萄糖 乳糖 蔗糖 麦芽糖
糖发酵
靛基质 M.R V .P 枸橼酸盐利用 生化试验
大肠杆菌 （E.coli ） 三糖铁琼脂斜面（斜面/底部）的变化：
菌 落：。
革兰氏染色：。
菌体形态：
运 动 性：。
葡萄糖 乳糖 蔗糖 麦芽糖 糖发酵
靛基质 M.R V .P 枸橼酸盐利用 生化试验
沙门氏菌 （S.typhimurium ）
三糖铁琼脂斜面（斜面/底部）的变化：
六、问题分析
1、比较大肠杆菌与沙门氏菌形态、染色特征以及在普通肉汤和普通琼脂培养基上的生长表现。
2、大肠杆菌与沙门氏菌主要生化性质有哪些不同？
3、对本试验中的几种生化实验的原理？
4、血清型的分群和定型在肠杆菌科细菌鉴定上有何重要性？
5、大肠杆菌与沙门氏菌在三糖铁琼脂斜面与底部生长表现有何不同？简述原理。
七、成绩评定
1．能认真预习实验内容，教师提问优秀者占总成绩20%。
2．动手能力好、能独立操作且操作正确占总成绩40%。
3．报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩 30%。
4．讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10%。
