实验四 肠杆菌科细菌鉴定(一)..

一、实验目的1. 了解大肠杆菌的生化特性，掌握大肠杆菌的鉴定方法。

2. 掌握微生物生化实验的基本操作技术，提高实验技能。

3. 通过实验，加深对微生物生化反应原理的理解。

二、实验原理大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，属于肠杆菌科。

在微生物学中，生化实验是鉴定细菌的重要手段之一。

通过观察细菌对特定底物的代谢能力，可以判断细菌的种类和特性。

本实验主要采用糖发酵实验、吲哚试验、甲基红试验等方法对大肠杆菌进行鉴定。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌菌种、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、吲哚试剂、甲基红试剂、卢戈氏碘液、乙醚、蒸馏水等。

2. 实验仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管、电子天平、纱布、脱脂棉、灭菌锅、PH计或PH试纸、电炉、石棉网、铁架台、100ml量筒、橡皮手套、超净台等。

四、实验步骤1. 糖发酵实验（1）将大肠杆菌接种于葡萄糖发酵培养基中，37℃培养24小时。

（2）观察培养基中是否产生气泡，若有气泡产生，则说明大肠杆菌能够利用葡萄糖。

2. 吲哚试验（1）将大肠杆菌接种于蛋白胨水培养基中，37℃培养24小时。

（2）取少量培养液加入吲哚试剂，观察是否产生红色沉淀。

3. 甲基红试验（1）将大肠杆菌接种于乳糖发酵培养基中，37℃培养24小时。

（2）加入甲基红试剂，观察培养基颜色变化。

五、实验结果与分析1. 糖发酵实验：大肠杆菌在葡萄糖发酵培养基中产生气泡，说明其能够利用葡萄糖。

2. 吲哚试验：大肠杆菌在蛋白胨水培养基中产生红色沉淀，说明其具有吲哚酶活性。

3. 甲基红试验：大肠杆菌在乳糖发酵培养基中不产生红色沉淀，说明其不能发酵乳糖。

根据实验结果，可以判断该菌株为大肠杆菌。

六、实验总结通过本次实验，我们掌握了微生物生化实验的基本操作技术，加深了对微生物生化反应原理的理解。

在实验过程中，我们学会了如何观察细菌对特定底物的代谢能力，从而对大肠杆菌进行鉴定。

肠杆菌科的鉴定1、标本要求：1.1 尽量用药前采集标本。

1.2 痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。

1.3 尿液：病人留取12h尿液，送检。

1.4 粪便：病人留取粪便5 10g，送检。

1.5 脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。

血标本不要冷冻。

1.6 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。

2、仪器35℃孵箱、普通光学显微镜3、试剂羊血平皿、麦康凯平皿、硝酸盐培养管、葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖酸盐培养管、苯丙氨酸脱氨培养管、氨基酸脱羧培养管、拘橼酸盐培养管、尿素培养管、糖醇发酵管、湖南长沙天地人肠杆菌鉴定板。

4、试验方法及原理：4.1 硝酸盐还原试验：方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。

结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。

注意点：（1）．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。

（2）．某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。

所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。

若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。

4.2 甲基红试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。

结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。

4.3 尿素培养基方法：将待检菌穿刺接种于尿素培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：培养基变红为尿素阳性，不变色为阴性。

4.4 拘橼酸盐试验(Simmons法)方法：将待检菌接种于拘橼酸盐培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。

4.5 氨基酸脱羧试验方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。

结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。

一、实验目的1. 掌握肠道杆菌的生理生化特性。

2. 熟悉并掌握肠杆菌科细菌的鉴定方法，如IMViC试验等。

3. 通过实验，提高对微生物学实验技能的运用和操作能力。

二、实验原理肠杆菌科细菌是一类革兰氏阴性、无芽孢、无荚膜的杆菌，广泛分布于自然界、人和动物的肠道中。

本实验通过对肠杆菌进行一系列生理生化试验，包括吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、V.P试验（V）、柠檬酸盐利用试验（C）等，以鉴定和区分不同肠杆菌科细菌。

三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌等。

2. 培养基：蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、柠檬酸盐培养基、双糖铁培养基等。

3. 试剂：吲哚试剂、甲基红试剂、V.P试剂、40%KOH、-茶酚、溴麝香草酚蓝、苯酚红等。

4. 仪器：酒精灯、试管、试管架、烧杯、量筒、接种环、接种针、无菌玻片、显微镜等。

四、实验方法1. 吲哚试验（I）（1）将试验菌接种于蛋白胨水培养基，37℃培养24小时。

（2）取1 mL培养液，加入1 mL乙醚，充分振荡，使乙醚层浮于培养液表面。

（3）沿管壁加入吲哚试剂10滴，静置片刻。

（4）观察培养液颜色变化，呈玫瑰红色为阳性，不变色为阴性。

2. 甲基红试验（M）（1）将试验菌接种于葡萄糖蛋白胨培养基，37℃培养24小时。

（2）沿管壁加入甲基红试剂3-4滴。

（3）观察培养液颜色变化，呈红色为阳性，黄色为阴性。

3. V.P试验（V）（1）将试验菌接种于葡萄糖蛋白胨培养基，37℃培养24小时。

（2）加入40%KOH 10-20滴，再加入等量-茶酚，用力振荡。

（3）37℃培养4小时后观察，仍无色产生为阴性。

4. 柠檬酸盐利用试验（C）（1）将试验菌接种于柠檬酸盐培养基斜面上，37℃培养24-28小时。

（2）观察培养基颜色变化，若含有溴麝香草酚蓝的斜面呈现蓝色为阳性，呈绿色为阴性；含苯酚红的斜面呈现红色为阳性，呈黄色为阴性。

五、实验结果1. 吲哚试验：大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

实验三：肠杆菌科的检验一、接种细菌：MAC培养基接种大肠埃希菌和变形杆菌，SS培养基接种福氏志贺菌和乙型副伤寒沙门菌，采用分区划线法，放在35℃温箱中培养18—24h。

二、观察肠道杆菌在MAC和SS平板上的菌落形态。

1、SS平板：1）福氏志贺菌形成无色、半透明、光滑、湿润、突起、直径为1—2mm大小的菌落；2）乙型副伤寒沙门菌为中心带黑褐色，其余部分为半透明、光滑、湿润、突起的小菌落2、MAC平板：1）大肠埃希菌形成红色、圆形、凸起、边缘整齐、多数为光滑型的菌落。

中等大小。

2）变形杆菌为圆形、扁平、无色、半透明的菌落。

三、涂片、革兰染色将玻片分为四个区域，并分别标记，将四种肠道杆菌分别在四个区域内的生理盐水中研磨，待其自然干燥后固定，采用“改良快速法”进行染色，结果如图所示：福氏志贺菌乙型副伤寒沙门菌变形杆菌大肠埃希菌G-杆菌G-直杆菌，较细长G- 杆菌G-直短杆状显微镜检查特征为革兰阴性杆菌，肠杆菌科多数细菌的形态及染色性相似，根据形态及染色性难以相互鉴别。

四、生化试验：1、氧化酶试验（纸片法）：在滤纸条上滴一滴氧化酶试剂，用无菌接种环挑取待测菌落在滤纸条上滴了试剂的部位研磨，；滤纸变为红色则为阳性，不变色为阴性，结果表明，以上四种肠道杆菌的氧化酶试验均为阴性。

2、接种KIA、MIU上。

五、2、微量生化：六、沙门菌、志贺菌的血清学鉴定：1、在洁净载玻片上两端分别滴加一滴志贺菌四种多价血清和福氏四价血清，各取一环志贺菌在两种血清上研磨10S，观察两组结果均出现肉眼可见的凝集物，提示该菌为福氏志贺菌。

2、采用同上方法，在洁净玻片上分别在其两端滴加一滴沙门菌多价O（A—F）和Hd血清，各取一环待测菌与之混合，研磨10S，几分钟后观察两组结果，出现肉眼可见的颗粒状凝聚物表示该菌为乙型副伤寒沙门菌。

七、讨论：1、做生化试验时，有些细菌为致病菌，故实验时要保护好自己，且实验废弃物要妥善处理，以免发生有害菌的感染。

实验九肠杆菌的分离鉴定（一）实验目的：1. 学习肠杆菌的培养、分离、鉴定方法2. 了解肠杆菌的形态、生理特性，加深对细菌的认识实验器材：肠杆菌荚膜培养基、烧杯、细菌遥控器、菌液吸管、匀菌棒、沸腾培养基、灭菌棉球、显微镜实验步骤：1. 培养肠杆菌：从冷冻的肠杆菌混合菌液中取1毫升，加入10毫升的肠杆菌荚膜培养基中，摇晃培养16-24小时，在恒温箱温度为37℃的情况下进行培养。

2. 分离肠杆菌：取一个烧杯，加入30毫升以上的无菌蒸馏水，用消毒后的菌液吸管将前一步培养的肠杆菌分别取3-5根细菌遥控器，分别在不同的位置进行分别分散。

然后用消毒后的匀菌棒在肠杆菌荚膜培养基上轻轻抹匀，保持平坦。

用约42℃左右的芒果棒将烧杯底部加温，倾斜烧杯，使肠杆菌菌落相互之间不相互交汇。

然后把烧杯放在恒温箱中，37℃条件下培养16-24小时。

3. 检查肠杆菌的生长情况：将肠杆菌荚膜培养基的菌落取下，加入含有小量酒精的沸腾培养基，然后用灭菌棉球将瓶口封住，使其长时间在37℃恒温箱中悬浮，观察生长情况。

4. 鉴定肠杆菌：将菌落挑取到玻璃载玻片上，在显微镜下观察菌落的形态及背景。

根据观察到的菌落形态、染色结果、生物化学反应结果等来确认肠杆菌。

实验结果与分析：观察到的肠杆菌菌落形态为灰白色，微凸起，边缘清晰，整齐规则排列。

在显微镜下观察到它的形态为细长的杆状，一般长度0.5-5微米，直径为0.3-0.8微米。

根据菌样特性及实验室检测结果，鉴定为肠杆菌属。

本次实验通过对肠杆菌的培养、分离、鉴定，加深了对肠杆菌在形态、生理特性上的认识。

通过实验过程实践，我们进一步认识到实验室操作的注意事项，体验到了科学实验的美妙过程。

肠杆菌科及检验肠杆菌科及检验（一）●考点﹥概述概念；命名与分类原则；共同特点；自然与人体内的分布；微生物学检查方法；临床意义。

﹥埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属及其他肠杆菌科细菌。

生物学性状；微生物学检验；临床意义。

[讲义编号NODE70103300140100000101：针对本讲义提问]【内容讲解】一、概述（共性）肠杆菌科是由多个菌属组成，G-杆菌，生物学性状相似。

大多数肠道杆菌属于正常菌群。

当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时成为条件致病菌而引起疾病。

部分为致病性细菌。

[讲义编号NODE70103300140100000102：针对本讲义提问]（一）分类肠杆菌科细菌的种类繁多。

主要根据细菌的形态、生化反应、抗原性质以及核酸相关性进行分类。

根据《伯杰系统细菌学手属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威属等。

[讲义编号NODE70103300140100000103：针对本讲义提问]（二）生物学特性1.形态与染色G-，杆菌，大小为（1.0～6.0）μm×（0.3～1.0）μm。

多数有周鞭毛（除志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC），无芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。

[讲义编号NODE70103300140100000104：针对本讲义提问]2.培养需氧或兼性厌氧；营养要求不高；普皿和麦康凯培养基：中等大小、表面光滑的菌落；液体培养基：混浊生长。

3.生化反应发酵葡萄糖产酸、或产酸产气；乳糖发酵试验：非致病菌 +，致病菌 -（除外变形杆菌）。

触酶阳性；氧化酶阴性；硝酸盐还原为亚硝酸盐。

[讲义编号NODE70103300140100000105：针对本讲义提问]4.抗原构造﹥﹥表面抗原（如Vi抗原、K抗原）：包绕在O抗原外的不耐热的多糖抗原，可阻断O抗原与相应抗体之间的反应，加热处5.变异﹥菌落S～R变异﹥鞭毛H～O变异﹥耐药性变异﹥生化反应性质的改变6.抵抗力不强。