实验四-肠杆菌科细菌鉴定(一)..

肠杆菌科鉴定报告模板1. 引言肠杆菌科是一类常见的革兰氏阴性细菌，广泛存在于土壤、水体、动植物体内以及人体肠道等环境中。

由于肠杆菌科中存在大量的致病菌和污染指示菌，对其进行准确鉴定十分重要。

本报告对所鉴定菌株进行了详细的特征描述和分析，以期为疾病防控和食品安全提供科学依据。

2. 材料与方法本次实验使用的样本为来自XX地区的食品样品，性状检测采用以下常规方法：1. 培养基选择：用花红素琼脂糖平板培养基(XLD) 和大肠杆菌培养基(EC) 进行肠杆菌属的培养。

2. 培养条件：接种菌株后，在37恒温培养箱中培养24-48小时。

3. 病原细菌鉴定：通过病原细菌常见特征进行初步鉴定，包括菌落形态观察、革兰染色、氧需求情况、氧化酶试验、产气试验等。

4. 进一步确认：通过生化试验和分子生物学方法进一步确认菌株种属，包括典型的碳水化合物利用试验、酸碱产物检测、16S rRNA序列测定等。

3. 结果及讨论经过上述步骤，我们成功鉴定出了本次食品样品中的菌株，并对其进行了分析和评估。

菌落特征描述观察菌落形态，本菌株与典型的肠杆菌科细菌相似，呈圆形、灰白色、整齐的菌落，直径约为2-3毫米。

在花红素琼脂糖平板上，菌落中心呈深红色，周围部分为透明带，边缘锐利，与大肠杆菌相符合。

生理生化特征首先，我们对菌株的革兰染色结果进行了观察，显示菌株呈现典型的革兰氏阴性菌形态，即细胞不保持染色，但在碘溶液中可保持染色。

进一步进行了氧需求试验，结果显示该菌株为好氧菌，即需氧生长。

另外，通过进行氧化酶试验，观察到菌株中有明显的氧化酶酶活性表现。

在加入氧化酶试剂后，观察到菌株变色，出现深紫色反应，符合肠杆菌科细菌的特征。

分子生物学鉴定利用PCR技术对该菌株进行了16S rRNA序列测定，得到了一段约1500碱基的序列。

通过序列比对和系统发育树构建，与肠杆菌科细菌高度同源，与典型的大肠杆菌(Escherichia coli) 的相似度在99%以上。

肠杆菌科的鉴定1、标本要求：1.1 尽量用药前采集标本。

1.2 痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。

1.3 尿液：病人留取12h尿液，送检。

1.4 粪便：病人留取粪便5 10g，送检。

1.5 脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。

血标本不要冷冻。

1.6 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。

2、仪器35℃孵箱、普通光学显微镜3、试剂羊血平皿、麦康凯平皿、硝酸盐培养管、葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖酸盐培养管、苯丙氨酸脱氨培养管、氨基酸脱羧培养管、拘橼酸盐培养管、尿素培养管、糖醇发酵管、湖南长沙天地人肠杆菌鉴定板。

4、试验方法及原理：4.1 硝酸盐还原试验：方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。

结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。

注意点：（1）．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。

（2）．某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。

所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。

若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。

4.2 甲基红试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。

结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。

4.3 尿素培养基方法：将待检菌穿刺接种于尿素培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：培养基变红为尿素阳性，不变色为阴性。

4.4 拘橼酸盐试验(Simmons法)方法：将待检菌接种于拘橼酸盐培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。

4.5 氨基酸脱羧试验方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。

结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。

一、实验目的1. 掌握肠道条件致病菌与肠道致病菌的菌落特点。

2. 掌握肠道杆菌的主要生化反应。

3. 掌握肠道杆菌的分离鉴定方法。

4. 掌握粪便标本细菌学检测流程。

二、实验原理肠道杆菌科细菌为革兰氏阴性菌，大多数有鞭毛，能运动。

少数无鞭毛不能运动，不产生芽孢，需氧或兼性厌氧，在普通培养基上，一般都生长良好，均能发酵葡萄糖产酸或产气，触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，还原硝酸盐。

这类细菌是人类和动物肠道中的细菌，有的引起腹泻、肠炎、肠热症和痢疾等。

有的为条件致病菌，有时也可引起身体各个部位的感染。

三、实验材料与仪器材料：1. 粪便标本2. CB培养基3. SS培养基4. 基础培养基5. 双糖铁发酵培养管6. 鉴别培养基7. 血清学反应试剂8. 药敏试剂仪器：1. 高压灭菌锅2. 试管3. 锥形瓶4. 接种环5. 酒精灯6. 无菌玻片7. 显微镜、载玻片8. 镊子四、实验步骤1. 粪便标本的处理- 将粪便标本用无菌生理盐水进行稀释，制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4四个浓度的悬液。

- 取各浓度悬液适量，分别接种于CB培养基、SS培养基、基础培养基和双糖铁发酵培养管。

2. 培养与观察- 将接种后的培养基放入37℃恒温培养箱中培养24小时。

- 观察并记录各培养基上的菌落特征，包括菌落大小、形状、颜色、边缘、表面等。

3. 生化反应- 取纯培养的菌落，进行糖发酵试验、氧化酶试验、触酶试验、硝酸盐还原试验等。

- 根据试验结果，初步鉴定菌种。

4. 血清学反应- 取纯培养的菌落，进行血清学反应，进一步鉴定菌种。

5. 药敏试验- 取纯培养的菌落，进行药敏试验，了解菌株的耐药性。

五、实验结果与分析1. 菌落特征- 在CB培养基上，观察到典型的肠道杆菌菌落，菌落呈圆形、光滑、湿润、乳白色。

- 在SS培养基上，观察到菌落呈红色，并有金属光泽。

- 在基础培养基上，观察到菌落呈黄色。

- 在双糖铁发酵培养管中，观察到斜面和底层均呈红色，并产生气泡。

肠杆菌科细菌的鉴定小结
●肠杆菌科细菌的生化反应及结果分析●玻片凝集的操作及注意事项
●G染色法操作方法及注意点
观察记录生化反应
●IMViC、KIA、U，所有菌种已接种37℃培养24h以上。

●观察生化反应、作出记录及分析
血清学鉴定－直接玻片凝集
●沙门菌：
用A～F多价O抗确定沙门菌属 用O因子血清分群
用H因子I相血清型定型
伤寒沙门菌：O9Hd
乙型副伤寒沙门菌：O4Hb
●福氏志贺菌：
A、B、C、D多价血清定志贺菌属
按流程分型
不同肠道菌在SS与CB的菌落特征
SS CB
大肠红色中心混浊S型菌落大而混浊蓝色S型菌落产气红色中心混浊M型菌落大而混浊蓝色M型菌落肺炎红色中心混浊M型菌落大而混浊蓝色M型菌落伤寒透明微黄中心黑色S型菌落透明红色S型菌落
副乙透明微黄中心黑色S型菌落透明红色S型菌落
福氏透明微黄S型菌落透明红色S型菌落
变形透明微黄中心黑色S型菌落透明红色S型菌落
不同肠道菌的生化特征
I M V C动力U产气乳糖硫化氢
大肠杆菌++--+-++-产气肠杆菌--+++-++-肺炎克雷伯菌--++-+++-伤寒沙门菌-+--+---+乙型副伤寒-+-++-+-+福氏志贺菌-+-------变形杆菌
+/-+-/V-/++++-+（普通/奇异）。

实验三：肠杆菌科的检验一、接种细菌：MAC培养基接种大肠埃希菌和变形杆菌，SS培养基接种福氏志贺菌和乙型副伤寒沙门菌，采用分区划线法，放在35℃温箱中培养18—24h。

二、观察肠道杆菌在MAC和SS平板上的菌落形态。

1、SS平板：1）福氏志贺菌形成无色、半透明、光滑、湿润、突起、直径为1—2mm大小的菌落；2）乙型副伤寒沙门菌为中心带黑褐色，其余部分为半透明、光滑、湿润、突起的小菌落2、MAC平板：1）大肠埃希菌形成红色、圆形、凸起、边缘整齐、多数为光滑型的菌落。

中等大小。

2）变形杆菌为圆形、扁平、无色、半透明的菌落。

三、涂片、革兰染色将玻片分为四个区域，并分别标记，将四种肠道杆菌分别在四个区域内的生理盐水中研磨，待其自然干燥后固定，采用“改良快速法”进行染色，结果如图所示：福氏志贺菌乙型副伤寒沙门菌变形杆菌大肠埃希菌G-杆菌G-直杆菌，较细长G- 杆菌G-直短杆状显微镜检查特征为革兰阴性杆菌，肠杆菌科多数细菌的形态及染色性相似，根据形态及染色性难以相互鉴别。

四、生化试验：1、氧化酶试验（纸片法）：在滤纸条上滴一滴氧化酶试剂，用无菌接种环挑取待测菌落在滤纸条上滴了试剂的部位研磨，；滤纸变为红色则为阳性，不变色为阴性，结果表明，以上四种肠道杆菌的氧化酶试验均为阴性。

2、接种KIA、MIU上。

五、2、微量生化：六、沙门菌、志贺菌的血清学鉴定：1、在洁净载玻片上两端分别滴加一滴志贺菌四种多价血清和福氏四价血清，各取一环志贺菌在两种血清上研磨10S，观察两组结果均出现肉眼可见的凝集物，提示该菌为福氏志贺菌。

2、采用同上方法，在洁净玻片上分别在其两端滴加一滴沙门菌多价O（A—F）和Hd血清，各取一环待测菌与之混合，研磨10S，几分钟后观察两组结果，出现肉眼可见的颗粒状凝聚物表示该菌为乙型副伤寒沙门菌。

七、讨论：1、做生化试验时，有些细菌为致病菌，故实验时要保护好自己，且实验废弃物要妥善处理，以免发生有害菌的感染。

肠杆菌科及检验肠杆菌科及检验（一）●考点﹥概述概念；命名与分类原则；共同特点；自然与人体内的分布；微生物学检查方法；临床意义。

﹥埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属及其他肠杆菌科细菌。

生物学性状；微生物学检验；临床意义。

[讲义编号NODE70103300140100000101：针对本讲义提问]【内容讲解】一、概述（共性）肠杆菌科是由多个菌属组成，G-杆菌，生物学性状相似。

大多数肠道杆菌属于正常菌群。

当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时成为条件致病菌而引起疾病。

部分为致病性细菌。

[讲义编号NODE70103300140100000102：针对本讲义提问]（一）分类肠杆菌科细菌的种类繁多。

主要根据细菌的形态、生化反应、抗原性质以及核酸相关性进行分类。

根据《伯杰系统细菌学手属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威属等。

[讲义编号NODE70103300140100000103：针对本讲义提问]（二）生物学特性1.形态与染色G-，杆菌，大小为（1.0～6.0）μm×（0.3～1.0）μm。

多数有周鞭毛（除志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC），无芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。

[讲义编号NODE70103300140100000104：针对本讲义提问]2.培养需氧或兼性厌氧；营养要求不高；普皿和麦康凯培养基：中等大小、表面光滑的菌落；液体培养基：混浊生长。

3.生化反应发酵葡萄糖产酸、或产酸产气；乳糖发酵试验：非致病菌 +，致病菌 -（除外变形杆菌）。

触酶阳性；氧化酶阴性；硝酸盐还原为亚硝酸盐。

[讲义编号NODE70103300140100000105：针对本讲义提问]4.抗原构造﹥﹥表面抗原（如Vi抗原、K抗原）：包绕在O抗原外的不耐热的多糖抗原，可阻断O抗原与相应抗体之间的反应，加热处5.变异﹥菌落S～R变异﹥鞭毛H～O变异﹥耐药性变异﹥生化反应性质的改变6.抵抗力不强。