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明胶酶谱法检测步骤1、明胶酶谱溶液配制1.1.1洗脱液（1×）：1.1.2Triton X-100，2.5%（v/v）in water配法：量取Triton X-10025ml，加去离子水定容至1000ml即可。
1.1.2孵育液（1×）：50mM Tris-HCl，5mM CaCl2·2H2O，0.02%Brij-35，0.2M NaCl，pH7.6。
配法：1)称取Tris碱6.06g，CaCl2·2H2O0.74g（或CaCl20.555g），Brij-350.2g，NaCl11.7g；2)加水至800ml；3)用浓HCl调pH至7.6；4)定容至1000ml。
1.1.32×上样缓冲液（不含β巯基乙醇）0.5M Tris-HCl，pH6.8 2.5ml甘油 2.0ml10%（w/v）SDS 4.0ml0.1%溴酚蓝0.5mldH2O1mlTotal10ml1.1.45×上样缓冲液（不含β巯基乙醇）配法：1)量取下列试剂，置于15ml塑料离心管中a)1M Tris-HCl（pH6.8） 2.5mlb)SDS1gc)溴酚蓝0.05gd)甘油5ml2)加dH2O定容至10ml，Vortax振荡混匀；3)小份分装（1ml/管），-20℃保存。
1.1.50.5%（w/v）考马斯亮蓝R-250400ml配法：1)称取2g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中；2)量取100ml异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；3)加入40ml冰醋酸，搅拌均匀；4)加入260ml去离子水，搅拌溶解；5)用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。
1.1.6考马斯亮蓝脱色液（400ml）配法甲醇：乙酸：水=200：40：160=5：1：4。
1.1.7明胶储液（10mg/ml in water）配法：称取明胶（Sigma，猪皮来源）0.1g，加去离子水10ml，溶解。
配好后储存于4℃。
明胶酶检测方法研究进展陈秋凤1，周防震21．湖北民族学院附属医院（湖北恩施445000）2．湖北民族学院生物科学与技术学院（湖北恩施445000）【关键词】明胶酶；检测方法；进展【中图分类号】R739．87【文献标识码】A【文章编号】1008－8164（2012）01－0070－02明胶酶，亦称Ⅳ型胶原酶［1］、基底膜性胶原酶［2］等，属于基质金属蛋白酶（Matrix metalloprotein-ases，MMPs）范畴，包括明胶酶A（MMP－2或称72kDaⅣ型胶原酶）和明胶酶B（MMP－9或称92kDa Ⅳ型胶原酶），可降解Ⅳ型胶原、明胶和V型胶原等基底膜成分，在组织炎症［3］、纤维化［4，5］、免疫［6］与肿瘤转移［7 9］等诸多过程中发挥重要作用。
明胶酶检测方法从最初的明胶酶谱法到现在采用的ELISA 法，从粗略定性到逐渐发展为准确定量，方法稳定性、可靠性逐渐完善，操作也变得更为简单。
本文就明胶酶测定方法的研究进展进行综述。
1基于明胶酶催化活性的检测方法利用明胶酶能催化降解明胶的特点发展建立起来的检测方法主要有明胶酶谱法（Zymography）、荧光明胶酶法和DQ明胶（Dye－quenched－gelatin）原位酶谱法。
1．1明胶酶谱法Kleiner等［10］于1994建立此方法，是一种基于非还原SDS－PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法。
主要原理是：1）含明胶酶的样本首先上样进行非还原SDS－PAGE电泳，利用明胶酶与阴离子去垢剂SDS结合，形成蛋白质－SDS 复合物，使待测蛋白质带上相同的负电荷，其量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，此时蛋白质分子在凝胶中的迁移率取决于其分子质量大小；2）SDS－PAGE电泳后利用含阳离子去垢剂（Triton－x100）的洗脱液洗脱去除SDS，这一过程中引发了明胶酶酶原蛋白体外活化机制，酶原在凝胶内除掉一个约10kDa的小肽，转变为有活性的酶［11］，降解凝胶中相应部位的明胶。
明胶酶谱法 -回复明胶酶谱法是一种用于测定明胶酶活性的分析方法。
明胶酶谱法基于明胶酶对明胶的降解作用，通过测定明胶的降解程度来反映明胶酶活性。
这种方法可以在实验室中进行，通常需要一些特定的试剂和设备。
明胶酶谱法的原理是利用明胶对明胶酶的敏感性，通过观察明胶降解的速度来确定酶的活性。
在明胶酶谱法中，一般会选择特定浓度和分子量的明胶，以确保最佳的测定结果。
明胶酶谱法可以用来研究明胶酶对明胶的降解过程，了解酶的活性和特性。
这个方法可以应用于食品工业、制药工业等领域，用于检测明胶酶的活性和质量。
明胶酶谱法在实验室中的操作比较简单，但需要一定的实验操作技巧和对仪器的熟悉。
这种方法对明胶酶活性和测定结果的准确性有着重要影响，所以需要严格按照操作流程进行实验。
明胶酶谱法的操作流程包括样品制备、反应过程、数据记录等环节，需要仔细阅读方法说明书并进行实践。
在明胶酶谱法中，常用的数据处理方法有绘制酶活性曲线、计算酶活性单位等。
明胶酶谱法需要注意的问题包括试剂的质量、设备的准确性和对废液的处理等。
明胶酶谱法的优点是操作简便、结果准确可靠，可以在较短时间内完成分析。
明胶酶谱法的局限性在于它只是测定明胶酶活性的一种方法，不能全面了解酶的特性。
在明胶酶谱法中，一些因素如温度、pH值等会对酶的活性产生影响，需要进行恰当的控制。
明胶酶谱法的操作需要注意安全，避免对人体和环境造成伤害。
明胶酶谱法是一种常用的分析方法，被广泛应用于生物化学、食品科学等领域。
该方法在明胶酶的研究和应用中具有重要意义，可以帮助科学家们更好地了解酶的特性和机制。
明胶酶谱法的结果可以用于酶活性检测、比较不同酶样品的活性等。
这种方法还可以用于评估明胶酶的纯度和稳定性，指导生产过程中的酶的应用。
明胶酶谱法可以与其他分析方法结合使用，提高酶活性测定的准确度和可靠性。
该方法还可以用于研究明胶酶的底物特异性、抑制剂的效果等。
明胶酶谱法的发展使得对明胶酶的研究更加深入和全面。
明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。
Mmp-2 72kd mmp-9 92kd实验步骤1.取对数期的癌细胞在的C。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。
（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。
明胶酶谱实验方法明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
明胶酶谱法的定义和步骤
明胶酶谱法是一种常用于检测和定量分析细菌或其他微生物产生的明胶酶活性的实验方法。
明胶酶谱法通过将待测菌株培养在含有明胶的琼脂培养基上，并利用其产生的明胶酶在琼脂中形成透明带区来检测明胶酶活性的存在和水平。
明胶酶谱法的具体实验步骤如下：
1. 准备明胶琼脂板：将明胶溶液加入琼脂培养基中，制备明胶琼脂板；
2. 菌株预处理：将待测菌株培养在适当的富含明胶的培养基上；
3. 制备样品：将培养的菌液离心，收集上清液，加入样品缓冲液中；
4. 蛋白电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中，利用电场将蛋白质分离；
5. 明胶酶活性检测：将电泳胶浸泡在明胶酶活性染色剂中，在适当温度下孵育一段时间；
6. 显色和成像：将染色剂去除，并在电泳胶上观察到明显的透明带区，表示明胶酶活性的存在和水平。
通过明胶酶谱法，可以确定菌株是否产生明胶酶及其活性的强弱。
这种方法简单易行，并能够提供定性和半定量的结果。
这种方法在微生物学研究和临床诊断中得到广泛应用，尤其对细菌感染的相关研究具有重要意义。
明胶酶谱法明胶酶谱法是一种新型的蛋白质分析方法，它可以提供准确准确的蛋白质质量分析和分子量分析结果。
明胶酶谱法可以快速有效地测定蛋白质中的氨基酸和糖基化激酶的活性。
这种方法通过使用蛋白质，核酸和其他复合物构成的聚合物，结合相关的酶诱发反应，来分析蛋白质的质量和分子量。
这些复合物可以在单独的氨基酸片段中用来测量激酶反应，从而识别活性位点，反映了蛋白质质量和分子量分析的结果。
明胶酶谱法的原理是基于胶质酶结合物，它由多种蛋白质，核酸和其他复合物组成，使用酶诱发反应来分析蛋白质的质量和分子量。
该方法由激酶和聚合物组成，它们分别催化了激酶和聚合物的反应，从而产生了激酶的活性。
此外，该方法还能够测量氨基酸片段的活性，这将有助于评估蛋白质的质量和分子量。
明胶酶谱法的应用可以追踪物质的合成和分解的变化，从而发现蛋白质结构及其功能的改变。
它可以用来研究蛋白质结合位点分布、激动酶及蛋白质与酶类分子识别蛋白质、以及酶促反应的参与者等，这些结果将有助于改善蛋白质的性能，这将有助于提高药物的疗效和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。
明胶酶谱法在蛋白质质量和分子量分析方面具有优越性。
它可以快速有效地识别活性位点，由此提供了精确的蛋白质质量和分子量的分析结果。
同时，该方法可以提供有效的数据，可以评估蛋白质的功能和结构。
它还可以用来研究药物及其代谢物的代谢，改善药物的性能和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。
由此可见，明胶酶谱法已成为药物研究和分析的一种重要的手段。
明胶酶谱法的应用可以提供准确的蛋白质质量和分子量分析结果，从而有助于研究者分析蛋白质的功能和结构，并改善药物的性能和安全性。
明胶酶谱法是一种有效的、快速的、有精度的、具有易操作性的蛋白质质量和分子量分析方法，因此它已经成为药物研究和分析的一种重要手段。
明胶酶谱法是一种用于检测和分析明胶酶活性的生化分析方法。
明胶酶是一类酶，它能够降解明胶，即动物组织中的蛋白质。
明胶酶谱法旨在测量明胶酶在特定条件下对明胶的降解效果，以评估其活性和特性。
明胶酶谱法的基本原理是将明胶酶和明胶在适宜的条件下进行反应，产生可见的明胶降解区域。
这种方法常用于酶的纯化、酶的活性测定以及研究酶的底物特异性和酶动力学参数等方面。
明胶酶谱法的步骤一般包括以下几个方面：
1.准备明胶基质：将明胶制备成适当的浓度和形状，例如明胶凝胶或明胶板。
2.制备反应体系：将含有明胶酶的样品或纯化酶溶液与明胶基质混合，形成反应体系。
3.反应条件调控：根据需要，调控反应体系的温度、pH 值和时间等条件，以促进明胶酶的活性和反应效果。
4.明胶降解观察：通过观察反应体系在合适条件下的明胶降解情况，可以确定明胶酶的活性和降解能力。
5.结果分析：根据明胶降解程度的形态和程度，结合实验对照组，可以对明胶酶的活性进行定量或定性的评估和比较。
明胶酶谱法在生物化学、食品科学、药学等多个领域中得到广泛应用。
它不仅可以用于研究酶的特性和功能，还有助于解析酶与底物之间的相互作用，进而更好地理解生物体内的代谢过程和生物催化机制。
明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺
（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2（基质金属蛋白酶-2）和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。
试剂的配制
(1)配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）
A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 10ml（包括）
ddH2O 4.5ml
30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8）
2.5ml
10% SDS100ul
10%过硫酸铵（APS）100ul
TEMED8ul
1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml
B.浓缩胶的配制
浓缩胶6ml
ddH2O 4.5ml
30%储备胶0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8)0.76ml
10% SDS60ul
10%过硫酸铵60ul
TEMED6ul
(2)5×Tris –甘氨酸电极缓冲液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）
(3)4 ×上样缓冲液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2）8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚蓝0.024g
ddH2O 2.4ml
(4)洗脱液：
2.5% Triton X-100
50mmol/L Tris-HCl（6.057g/L）
5mmol/L CaCl2（0.5549g/L）
pH7.6
40分钟两次，中间换液
(5)漂洗液： 50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）
(6)孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）
(7)染色液：0.05% Coomassic 亮蓝 R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）
(8)脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%,20%,10%,乙酸浓度分别为10%,10%,5%（分别30min,1h,2h脱色）
实验步骤
(1)取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
(2)次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
(3)根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。
（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）
(4)配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
(5)电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。
(6)孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸)染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10% ,乙酸浓度分别为10%、10%、5%)分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2(72KD)和MMP-9(92KD)为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。
注意事项：
(1)制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。
(2)明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。
(3)用大梳子
(4)孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。
(5)孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
(6)明胶要4度保存，配好后1周内使用
凝胶制备：
(1)玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。
(2)配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。
若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。
(3)配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。
(4)将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。
(5)拔梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。
【PS 某种酶蛋白活性分析】
（1）用于测定蛋白酶活性。
（2）三个主要内容：生物轭合物；试剂盒；分析方法。
（3）生物轭合物包含：连接物；荧光剂；猝灭剂。
（4）连接物包含能识别所检测的酶并且与之相互作用的部分；荧光剂包含多种荧光物质，并与所述连接物的第一位置轭合；猝灭剂与所述连接物的第二位置轭合。
连接物上能识别蛋白酶并与之相互作用的部分位于第一和第二位置之间。
多种荧光物质相互结合，使得猝灭剂能放大荧光剂的超猝灭。
