酶谱法检测金属蛋白酶活性

明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。

10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。

注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。

先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。

如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。

你加了这个我保证你一辈子也做不出来。

蛋白浓度一般是先摸索一个量。

就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。

条带看不见的，或者太透明的，都不能选。

就是要半明半暗的那种。

看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。

(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。

·１７０８·［文章编号］１０００—４７１８（２００６）０９—１７０８—０４强力霉素影响基质金属蛋白酶活性和血管重构的实验研究景颖，郑兴△，陈少萍，吴弘，张静（第二军医大学附属长海医院心内科，上海２００４３３）［摘要］目的：观察强力霉素对损伤动脉组织中基质金属蛋白酶（ＭＭＰ）活性的抑制作用，并探讨强力霉素对血管平滑肌细胞增殖、动脉内膜增生、管腔重构的影响。

方法：球囊导管扩张动脉的方法建立大鼠颈总动脉损伤模型。

治疗组用强力霉素３０ｍｇ·ｋｇ～·ｄ‘１干预。

明胶酶谱法测定损伤动脉组织中ＭＭＰｓ的活性。

用ＨＥ染色、ＶＶＧ染色、免疫组化标记仅一ａｃｔｉｎ和增殖细胞核抗原的方法观察损伤动脉内膜厚度、管腔重构及平滑肌细胞增殖的情况。

结果：①强力霉素治疗组ＭＭＰ一９活性在术后２４ｈ，３ｄ分别比对照组低２６．３％、３４．５％（Ｐ＜０．０１）；ＭＭＰ一２活性在术后７ｄ比对照组低４０．ｏ％（Ｐ＜０．０１）。

②强力霉素治疗使术后７ｄ内膜平滑肌细胞增殖率（４３．２３％±１．０６％）显著低于对照组（６２．７６％±１。

０２％）（Ｐ＜０．０１）；使术后１４ｄ、２８ｄ新生内膜厚度比对照组分别少３２．Ｏ％、３８．８％（Ｐ＜０．０１），而管腔面积比对照组多５８．０％、９０．４％（Ｐ＜０．０１）。

结论：强力霉素可以显著降低血管损伤后ＭＭＰｓ活性，抑制内膜平滑肌细胞的增殖、新生内膜增生以及管腔重构，提示它可能具有防治ＰＴＣＡ术后再狭窄的作用。

【关键词］血管成形术，气囊；多西环素；基质金属蛋白酶；肌，平滑，血管；血管重建［中图分类号］Ｒ３６３［文献标识码］ＡＥｆｆｅｃｔｏｆｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅｏｎｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅ－ｍｏｄｅｌｉｎｇｉｎｂａｌｌｏｏｎ－－ｉｎｊｕｒｅｄｒａｔｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓＪＩＮＧＹｉｎｇ，ＺＨＥＮＧＸｉｎｇ，ＣＨＥＮＳｈａｏ—ｐｉｎｇ，ＷＵＨｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＣｈａｎｇｈａｉＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３３，Ｃｈｉｎａ）［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］ＡＩＭ：Ｔｏｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（Ｄｏｘｙ）ａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ（ＳＭＣｓ）ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｔｈｅｍｏｄｅｌｏｆｒａｔｃｏｍｍｏｎｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｙｉｎｊｕｒｙｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｂａｌｌｏｏｎ—ｄｉｌａｔａｔｉｏｎ．Ｄｏｘｙｗａｓａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｔｏｔｈｅａｎｉｍａｌｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐａｔｄｏｓｅｏｆ３０ｍｇ·ｋｇ～·ｄ～．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰｓｉｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｏｆｉｎｊｕｒｅｄｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｇｅｌａｔｉｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅｔｈｉｃｋｎｅｓｓａｎｄａｒｅａｏｆｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ，ｌｕｍｅｎａｒｅａａｎｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＳＭＣｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ：１．ＭｔｅｒＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰ一９ｉｎｔｈｅｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓＷａｓｒｅｄｕｃｅｄｂｙ２６．３％ａｎｄ３４．５％ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈａｔｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｏｕｔＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔａｔ２４ｈｏｕｒｓａｎｄ３ｄａｙｓａｆｔｅｒｂａｌｌｏｏｎｉｎｊｕｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰ一２Ｗａｓａｌｓｏｒｅｄｕｃｅｄｂｙ４０．Ｏ％ａｔ７ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙ（Ｐ＜０．０１）．２．Ｔｈｅｔｈｉｃｋｎｅｓｓｏｆｎｅｏｉｎｔｉｍａｌｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙ３２．０％ａｎｄ３８．８％（Ｐ＜０．０１）ａｎｄｔｈｅｌｕｍｅｎ小ｅａｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ５８．０％ａｎｄ９０．４％ａｔ１４ａｎｄ２８ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙｉｎｔｈｅＤｏｘｙ—ｔｒｅａｔｅｄｒａｔｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｏｓｅｉｎｃｏｎｔｒｏｌｒａｔｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）．ＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｉｎｔｉｍａｌＳＭＣｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍ６２．７６％±１．０２％ｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓｔｏ４３．２３％±１．０６％ａｔ７ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙ（Ｐ＜０．０１）．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｄｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ咖ｈｉｂｉｔｓｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰｓ，ｔｈｅＳＭＣｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｉｍａｌ，ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｓｕｓｅｆｕｌｉｎｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓａｆｔｅｒＰＴＣＡ．［ＫＥＹＷＯＲＤＳ］Ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ，ｂａｌｌｏｏｎ；Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ；ＭａｔｒｉｘｍｅｔａＵｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；Ｍｕｓｃｌｅ，ｓｍｏｏｔｈ，ｖａｓｃｕｌａｒ；Ｖａｓｃｕ－ｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ经皮腔内冠状动脉成形术（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｔｒａｎｓｌｕ－ｍｉｎａｌｃｏｒｏｎａｒｙａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ，ＰＴＣＡ）后再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｏ—ｓｉｓ，ＲＳ）的防治是血管介入学领域内的热点课题。

精品文档蛋白酶活性的测定方法（GB/T23527-2009）1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。

磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林 - 酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。

由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。

利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。

2 仪器和设备2.1 分析天平：精度 0.0001g2.2 恒温水浴：精度土 0.2 C2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计：精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（ 80%-90%）1 0 .6g, 加水溶解并定容至 1000ml。

乙液：称取乳酸钠（70% 16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液 8ml, 加乙液 1ml, 摇匀，稀释一倍，即成 0.05mol/L 乳酸缓冲溶液。

3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（ Na2HPO3.12H2O）6.02 和磷酸二氢钠（ NaH2PO3.2H2O） 0.5g, 加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液（pH=10.5）适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g, 加水溶解并定容至 1000ml。

乙液：称取氢氧化钠 4.0g, 加水溶解并定容至 1000ml. 使用溶液：取甲液500ml, 加乙液 400ml, 摇匀，用水稀释至 1L。

3.4 0.4mol/L 碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠 42.4g, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml.3.5 0.4mol/L 的三氯醋酸液：准确称取 65.4 三氯醋酸, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml3.6 0.5mol/L 的 NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml 酪素溶液称取酪素 1.000g, 准确至 0.001g, 用少量的 0.5mol/L 的氢氧化钠溶液（若为酸性蛋白酶则用浓乳酸 2-3 滴）润湿,, 加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中 , 用适宜的缓冲液稀释至刻度 , 此溶液在冰箱内贮存 , 有效期为三天 .3.8 100卩g/ml酪氨酸标准溶液3.8.1准确称取预先于105C干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸 60ml 溶解后定容至 100ml, 即为 1.00mg/ml 的酪氨酸溶液 .精品文档3.8.2 吸取 1.00mg/ml 酪氨酸标准溶液 10.00ml, 用 0.1mol/L 盐酸定容至100ml,即得100.0卩g/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取 1.000g 固体酶或移取 1ml 液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研 , 然后将上清液倒入 100ml 容量瓶, 沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次 , 最后全部移入容量瓶 , 稀释到刻度 , 用四层纱布过滤。

基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书（中文版）主要用途基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过明胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的无色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种细胞萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等）、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶-2，9，以及13等活性及其抑制剂的检测。

产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，条带清晰，重复性好。

技术背景基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。

其功能在于分解细胞外基质成分。

迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。

根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。

体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。

酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。

在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。

通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。

色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。

该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。

粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。

木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。

基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。

高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。

免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。

这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。

免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。

琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。

用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。

在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。

比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。

酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP生物化学与分子生物学引言酶谱法是一种常用的方法，用于测定血清基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，简称MMP）的活性。

MMP是一类重要的蛋白酶，参与多种生理和病理过程，包括组织再生、肿瘤转移等。

本文将介绍血清基质金属蛋白酶MMP的生物化学特性以及酶谱法的原理和操作步骤。

血清基质金属蛋白酶MMP的生物化学特性血清基质金属蛋白酶（MMP）是一类富含锌离子的蛋白酶，在生物体内起到调节基质降解的重要作用。

MMP主要由细胞外基质成分和细胞表面的蛋白酶组成，包括胶原酶、明胶酶等。

这些酶在正常生理过程中，如组织再生和修复中，起到调节细胞迁移、基质降解的作用。

然而，在许多疾病的进展中，MMP的活性过高或过低都可能导致病理性结果，如肿瘤的转移和心肌梗塞。

MMP的活性可以通过多种方法进行检测，其中酶谱法是一种常用且灵敏的方法之一。

酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP的原理酶谱法是一种使用荧光信号来测定酶活性的方法。

在血清基质金属蛋白酶MMP的检测中，常使用一种荧光基质作为底物，这种底物在未被酶降解时会发出弱的荧光信号，但在被酶降解时会发出明显的荧光信号。

利用这种差别，可以通过测量荧光信号的强度来反映MMP的活性。

酶谱法的操作步骤包括以下几个方面：1.实验前准备：清洗试管和工具，准备所需试剂和样品。

2.底物制备：制备稀释的荧光底物，使其浓度适用于实验。

3.样品处理：将待测的血清样品加入试管中，同时添加荧光底物。

4.反应混合：轻轻摇动试管，使样品和底物充分混合，然后放置在恒温器中反应一段时间。

5.测量荧光信号：使用荧光检测仪器来测量样品中荧光信号的强度。

6.数据分析：根据荧光信号的变化来计算MMP的活性，并进行数据统计和分析。

酶谱法是一种常用的方法，用于检测血清基质金属蛋白酶MMP的活性。

通过测量荧光信号的强度，可以间接反映MMP的活性水平。

酶谱法具有操作简单、结果可靠、灵敏度高等优点，在生物化学和分子生物学研究中得到了广泛应用。