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SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。
(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
原理酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。
2试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括）ddH2O 4.5ml30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml1.5mol/l Tris（PH 8.8）2.5ml10% SDS 100ul10%过硫酸铵（APS）100ulTEMED 8ul1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5mlB.浓缩胶的配制浓缩胶6mlddH2O 4.5ml30%储备胶0.75ml1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml10% SDS 60ul10%过硫酸铵60ulTEMED 6ul（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）（4）4 ×上样缓冲液0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS（PH7.2）8ml16%甘油3.2 ml溴酚蓝0.024gddH2O 2.4ml(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/LCaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液）（6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）3实验步骤1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
实验试剂和器材1.材料：低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白MW=66,200 兔肌动蛋白MW=43,000 牛碳酸酐酶MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶MW=14,400 开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。
2.实验试剂(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。
（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml。
（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml。
（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定容至100ml。
（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至10ml。
（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。
（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用。
（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。
（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
匀浆:1.匀浆缓冲液含有多种蛋白酶抑制剂，降低蛋白酶活性，以防蛋白降解。
2.SDS在匀浆以后再加入，以防起沫。
3.所有操作尽量在冰上进行。
4.94C水浴（或沸水浴）处理的作用是为了是蛋白变性，以防降解（水浴锅事先要打开升温）。
5.PMSF是有毒试剂，处理时注意。
6.操作过程尽量带上手套，以防人手表面的蛋白和脂肪的污染。
7.热水浴后，离心是用的可以控温的离心机，使用前15分钟打开使温度降到4C,即可。
8.离心后分装，可以用枪头先把表面的一层吸走，换取新的枪头在分装。
9.SDS,DDT,PMS是用时临时加入缓冲业的，根据母液的浓度计算所需的量。
制胶：10.APS和TEME是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30%。
11.玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。
12.丙烯酰胺是有毒的，操作时注意安全。
（凝胶以后，聚丙烯酰胺毒性降低。
）13.1.5mm的玻璃板有黑色条带封低，1mm勺玻璃板用白色条带封底。
（封紧以防漏胶）14.凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30min。
15.样品处理时，沸水浴使蛋白充分变性以防在电泳时产热蛋白质降解。
一般要5-10分钟。
而且要注意把样品的管口封好，以防沸水浴时冲开（出错了）。
16.点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。
（点在边上时，跑出的带是斜的）17.点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。
18.开始电泳时，电压调到80V,当跑过浓缩胶时电压调到100V。
19.电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下）20.脱色时，尽量多次进行换水。
21.上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10卩g-50卩g,，一般V 15卩I.22.做胶时，凝胶时间控制在25min。
梳子不能歪来歪去。
23.上样时，Mark最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。
24.制胶时，在加APS前尽量不要搅拌，加入APS后可以轻轻搅拌，不要产生气泡。
注意：温度，时间，光照，APS和TEMEDfE会对凝胶产生影响。
蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。
2.重新加入8mltris饱和状态酚（ph8.8）和8ml裂解液，在通风橱内研磨30s。
先加8mltris饱和状态酚，tris饱和状态酚会变为液态，此时需以研磨碓将液态的tris饱和状态酚研磨变成小块。
接着重新加入8ml裂解液，也须要将液态的裂解液研磨变成小块。
等三者搅匀后，将粉末迁移至45mltube。
3.振荡30min。
室温静置，等待tube中液态变为液体后，已经开始震荡。
震荡须要持续30min，每震荡1min，放在冰上加热1min。
4.10000g，4℃，10min。
将酚相（topphase）转移至45mltube。
酚相（topphase）可置于冰上。
酚二者必须就是绿色的，水相必须就是淡黄色的。
5.取6ml的抽提液和6ml饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
6.10000g，4℃，10min。
将酚二者（topphase）迁移至45mltube。
7.沉淀酚相。
取一定体积（是酚相的5倍）的0.1m乙酸铵/甲醇溶液（c20℃保存）于酚相（45mltube）。
振荡30s，c20℃培育1h或过夜。
8.冲洗结晶①15min，20,000g，4℃。
弃上清。
②提10ml0.1m乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
③15min，20,000g，4℃。
弃上清。
④重新加入10ml乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑤15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑥提10ml80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑦15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑧重新加入10ml80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑨15min，20,000g，4℃。
弃上清。
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究木瓜蛋白酶（Papain）是一种广泛存在于木瓜中的天然酶，具有优异的蛋白水解能力和广泛的应用领域。
对于木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法的研究，可以为其在食品、药物和生物技术等领域的应用提供重要的理论和实践基础。
纯化木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
首先，通过将木瓜果肉或木瓜乳剂进行初步的提取和分离，得到粗木瓜酶液或浓缩液。
接下来，通过酸性、碱性或酶处理等方法，将杂质蛋白质去除，然后经过一系列的层析纯化步骤，最终获得纯度较高的木瓜蛋白酶。
其中，离子交换层析是最常用的纯化方法之一。
离子交换层析是根据蛋白质与固定在固定相上带电的离子交换基团之间的相互作用进行纯化的。
通常使用阳离子交换剂如DEAE-Sepharose CL-6B或阴离子交换剂如CM-Sepharose CL-6B作为固定相，可实现木瓜蛋白酶与其他蛋白质之间的分离。
通过控制缓冲液的pH和离子强度，可以调节木瓜蛋白酶在层析柱上的吸附和洗脱，从而实现对其的纯化。
凝胶过滤层析是另一种常见的纯化方法，其基本原理是根据蛋白质分子大小的差异进行纯化。
凝胶过滤层析对分子量较大且较纯的蛋白质具有较好的分离效果。
在纯化木瓜蛋白酶时，可以选择适当的凝胶过滤层析介质，如Sephadex G-75或Sephadex G-100等，将混合溶液在凝胶柱上进行层析，分离出目标蛋白质。
除了纯化方法的研究外，正确鉴定木瓜蛋白酶的纯度和活性也是非常重要的。
鉴定木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：SDS-PAGE电泳、活性测定和质谱鉴定等。
其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分子量分析方法，它可将蛋白质按照分子量大小进行分离和定量。
通过在分离凝胶上染色或通过Western blotting方法检测，可以确定木瓜蛋白酶的纯度和分子量。
活性测定是评价木瓜蛋白酶酶活性的重要手段。
常用的活性测定方法包括卟啉-酪蛋白分光光度法、酪蛋白分解能力法等。
凝胶电泳法检测dnase凝胶电泳法是一种常用的生物分析技术，可用于检测和分析蛋白质和核酸等生物分子。
本文将以凝胶电泳法检测DNase为主题，介绍该方法的原理、步骤以及在实验室中的应用。
一、原理凝胶电泳法是利用电场作用下，带电粒子在凝胶中的迁移速率不同，从而实现分离和分析的技术。
在DNase检测中，通常使用琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖凝胶是一种由聚糖构成的凝胶，通过调节凝胶的浓度和孔隙大小，可以实现不同大小的生物分子的分离。
二、步骤1. 样品制备：将待检测的DNase样品进行处理，通常需要进行蛋白酶抑制剂的添加以保护目标蛋白不被降解。
样品处理完成后，进行蛋白质的提取和纯化，获取待检测的DNase样品。
2. 凝胶制备：制备琼脂糖凝胶，通常将琼脂糖加入缓冲液中，加热溶解后冷却至适宜温度，然后倒入凝胶板中，插入梳子形成样品槽和标记槽，待凝胶固化。
3. 样品加载：将样品与适当的加载缓冲液混合，然后加入样品槽中，注意不要超过凝胶孔隙的容量。
4. 电泳：将凝胶板放入电泳槽中，加入适当的电泳缓冲液，连接电源，施加电场进行电泳。
根据目标蛋白的大小和电荷特性，设置适当的电压和时间。
5. 显色和照相：电泳结束后，将凝胶取出，进行染色和显色。
通常使用DNA染料如乙溴化乙锭进行染色，然后使用紫外光或化学显影剂进行显色。
显色后，可以使用相机或扫描仪进行照相或扫描，记录凝胶上的带状图像。
三、实验应用凝胶电泳法检测DNase在生物医学研究中具有广泛的应用。
下面列举几个常见的应用领域：1. 酶活性检测：通过在凝胶上观察DNase活性带，可以评估样品中DNase的活性水平。
不同的带状图案代表不同的酶活性水平，进一步可以用于判断细胞或组织中DNase的功能和生理状态。
2. 蛋白质纯化：通过对样品进行凝胶电泳分离和检测，可以定量和纯化目标蛋白。
通过观察目标蛋白在凝胶上的位置和强度，可以进行进一步的分析和提取。
3. DNA分析：凝胶电泳法也可用于检测DNA的大小和纯度。
蛋白酶活性电泳活性电泳(明胶酶谱法)一、实验原理明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。
通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。
通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。
二、材料与方法1试剂与溶液配制1.1试剂和仪器：酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2·2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5×蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。
水为去离子水或超纯水。
主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等1.2溶液配制1.2.1 5×SDS-PAGE电泳缓冲液配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。
使用时用去离子水稀释至1×，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。
1.2.2 明胶储液（10 mg/ml）配法：称取明胶0.1 g，加去离子水10 ml，溶解，配好后储存于4℃。
若凝固成胶冻状可用温水浴解冻。
1.2.3 10 %过硫酸铵（W/V）配法：称取1g过硫酸铵；加入10ml的去离子水，将固体粉末彻底溶解；贮存于4℃。
注意：10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4℃保存可使用2周左右，过期会凝胶效果会减弱，可适当增加用量。
1.2.4 凝胶配制：1) 10% SDS-PAGE凝胶之分离胶（含1.0 mg/ml 明胶）dH2O 3ml30%丙烯酰胺溶液 3.3 ml4×分离胶缓冲液 2.5 ml10%过硫酸铵0.1 mlTEMED 0.004 ml10 mg/ml明胶 1 mlTotal 10 ml2)5%浓缩胶的配置dH2O 4.56 ml30%丙烯酰胺溶液 1.36 ml4×浓缩胶缓冲液 2.0 ml10%过硫酸铵0.1 mlTEMED 0.008 ml10 mg/ml明胶0 mlTotal 8 ml3) 配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶轻溶液（5%）dH2O 7.25 ml30%丙烯酰胺溶液 2.50 ml4×分离胶缓冲液 3.75ml10%过硫酸铵0.1 mlTEMED 0.008 ml10 mg/ml明胶 1.5 mlTotal 15 ml4) 配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶重溶液15% 20%dH2O 1.0 ml 030%丙烯酰胺溶液7.50 ml 10.04×分离胶缓冲液 3.75ml 3.75ml10%过硫酸铵0.1 ml 0.1 mlTEMED 0.01 ml 0.01 ml10 mg/ml明胶 1.5 ml 1.5 mlTotal 15 ml 15 ml重溶液添加蔗糖至0.1g/ml，增加溶液密度。
1.2.5洗脱液（1×）配法：量取Triton X-100 25 ml，加去离子水定容至1000 ml即可。
1.2.6孵育液（1×）配法：1)中性孵育液：称取 Tris碱6.06 g，CaCl2·2H2O 0.74 g（或CaCl2 0.555 g），Brij-35 0.2 g，NaCl 11.7 g；加水至800 ml；用浓HCl调pH至7.6；定容至1000 ml。
2)弱酸性孵育液40g NaCH3COOH·3H2O溶于适量水，6mol CH3COOH 168mL，CaCl2·2H2O 0.74 g（或CaCl2 0.555 g），Brij-35 0.2 g，NaCl 11.7 g，加水至800，用冰乙酸调pH至4.0，定容，1000mL。
1.2.7 0.5%（w/v）考马斯亮蓝R-250(400 ml)配法：称取2 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取100 ml异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入40 ml冰醋酸，搅拌均匀；加入260 ml去离子水，搅拌溶解；用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。
1.2.8 考马斯亮蓝脱色液（400ml）配法：甲醇：乙酸：水=5：1：4 。
2 实验方法2.1蛋白酶样品制备样品液前处理：发酵液10000g 离心，上清液经3kD超滤管6500 rpm浓缩，得到粗酶液，﹣20℃保存。
2.2 样品液蛋白酶活性的测定（福林一酚试剂法）2.2.1 标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2 mol/L盐酸溶解，用50mmol/L的Tris-HCl (pH9.0) 缓冲液定容至100 mL，分别配成0-100μgm/L的不同浓度的溶液。
不同浓度酪氨酸溶液各取lmL，加2%酪素l mL，于50℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸(TCA) 2 mL，离心，取上清液l mL，加入0.4mol/L的碳酸钠5 mL，再加入福林试剂l mL，于37℃水浴中显色15分钟，在680 nm波长比色，测光密度(O.D)。
以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制标准曲线。
2.2.2 样品测定：取适当稀释的酶液l mL，加入2%酪素l mL，以下操作同上，同时作对照管。
2.2.3 酶活定义：在50℃，pH9.0的条件下每分钟水解酪蛋白产生l μg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
样品中含蛋白酶活力单位=A×F/15。
式中：A为由样品测定的光密度值查曲线得到的相当于酪氨酸的微克数，F为酶液最终稀释倍数，15为反应时间(分钟)。
2.2.4 调整样品液的浓度，计算出凝胶电泳所需酶量（约200U），若样品液比活不够高，须进一步浓缩以提高样品比活，或适当提高加样量。
2.3 活性胶操作步骤（gelatin zymogram）2.3.1 配胶梯度胶配制：灌制梯度胶与线性胶最大的区别在于需要使用梯度生成装置。
高浓度丙烯酰胺溶液内加入蔗糖可以稳定梯度的形成。
操作步骤：1）准备好凝胶模具，并装配好梯度混合器，下置磁力搅拌器，混合槽内放入小转子，调整流速约为5ml/min(可使用蠕动泵)。
2）准备好未加TEMED的轻重分离胶溶液，灌制1mm厚的小板胶约需要轻重溶液各4ml，灌制1mm厚的大板胶约需要轻重溶液各15-18ml，倒入混合器前加入TEMED并混匀。
3）关闭梯度混合器的输出阀和两液槽间的连通阀，在贮液槽中加入定量的凝胶轻溶液，短暂打开连通阀，让少量轻溶液通过阀门流入混合槽中以除去阀门内气泡，防止堵塞。
4）在混合槽中加入等量凝胶重溶液，完全打开连通阀，开启磁力搅拌器，调整转速至混合槽内液体稍起漩涡，并固定转速，制相同凝胶使用固定转速以保证制胶的重复性。
5）打开连通阀，输出管头从胶板夹层顶部加入凝胶液体，吸头对着夹层一面，使液体只沿一块玻璃板留下。
当最后轻溶液流入输出管时，要注意，调整流速，确保最后几毫升轻溶液不致过快流入凝胶夹层影响梯度形成。
6）梯度胶顶部用1ml枪缓慢加入少量水，让凝胶聚合约1h充分聚合。
7）灌制浓缩胶，准备样品，加样进行电泳。
注意：一次可同时跑两板胶，配胶时一板为添加明胶的活性胶，一板为无明胶的普通胶，配胶过程尽量一致，普通胶做对照。
2.3.2上样，样品与非还原性上样缓冲液混合，室温静置10 min，不能加热。
2.3.3 同常规电泳，电泳槽冰浴，电压100-200 V，标记跑至距凝胶底部1-2cm时结束。
2.4 活性胶的处理2.4.1 直接酶谱法1) 活性胶孵育最适pH制备活性胶A 2板（含明胶），浓度梯度为5%-20%，电泳结束后，洗脱，漂洗；漂洗完毕后，凝胶置于不同pH的孵育液中50℃孵育3h；考马斯亮蓝R-250 染色1h，脱色液脱色过夜。
2）活性胶孵育最佳时间制备活性胶A 2板（含明胶），电泳洗脱漂洗同上，孵育时将胶条置于已确定的最适pH孵育液内，分别孵育1h、3h、6h、12h。
孵育完毕后操作同上。
3）蛋白酶电泳后位置的标定制备活性胶A 1板，B 1板，C 1板；电泳洗脱漂洗同上；A胶于最适pH孵育液孵育最佳时间后染色脱色；B胶浸泡2%酪蛋白溶液2h，孵育同A胶，染色脱色；C胶电泳结束后，切下一条泳道，直接染色脱色，其余不作处理，４摄氏度保存。
根据A B胶亮带位置，对比各蛋白酶亮带位置；比较B亮带位置与C胶蛋白条带进行对比，确定ＡＢ胶亮带对应的蛋白酶在Ｃ胶中的大概位置。
4）将Ｃ胶中亮带对应的位置附近几条蛋白条带分别切下，回收。
操作见表1。
表1 活性胶的处理孵育完毕后，染色1h，过夜脱色。
三实验结果与讨论3.1 活性胶孵育最适pH由图1 看出pH8.5的条件下，凝胶中的酶与底物明胶反应生成的条带数量最多，亮度最大。
图1 不同pH孵育条件下明胶活性电泳的差异泳道1、2、3分别为在pH4.0、7.0、8.5条件下孵育3小时的条带3.2活性胶孵育最佳时间由图2得出，在pH8.5条件下，随孵育时间延长条带数增多，孵育4h后，条带模糊。
相比较孵育3h效果最好，条带数最多且条带清晰。
图2 pH8.5 孵育不同时间下明胶活性电泳的差异泳道1、2、3、4分别为在8.5条件下孵育1h、2 h、3 h、4 h的条带A B图3 A ：粗酶液非变性SDS-PAGE 结果 B ：粗酶液非变性SDS-PAGE 复性浸泡酪蛋白孵育结果3.3讨论从明胶活性电泳结果可以看出，粗酶液中含有多种蛋白酶，但大部分条带亮度微弱，说明这些蛋白酶含量太低或活性较低。
泳道上方有多条亮度较大的条带，说明该位置可能存在几种活性较高的蛋白酶，且分子量较大，但从粗酶液非变性SDS-PAGE 结果（图3A ）看，对应位置上并无蛋白亮带，复性后浸泡酪蛋白孵育也无亮带。
References:J E. 科林根等，精编蛋白质科学实验指南,Dass, S. B. and C. G. Dosoretz, et al. (1995). "Extracellular proteases produced by the wood -degrading fungus Phanerochaete chrysosporium under ligninolytic and non-ligninolytic conditions." Archives of microbiology 163 (4): 254-258.Liota, L.A. and W.G. Stetler-Stevenson (1990) Cancer Biology, 1, 96-106Mitsuhashi, W. and A. Oaks (1994). "Development of endopeptidase activities in maize (Zea mays L.) endosperms." Plant physiology 104 (2): 401-407.Morikawa, M. and Y. Izawa, et al. (1994). "Purification and characterization of a thermostable thiol protease from a newly isolated hyperthermophilic Pyrococcus sp." Applied and environmentalmicrobiology 60 (12): 4559-4566.。
