明胶酶谱分析法

蛋白酶活性电泳活性电泳(明胶酶谱法)一、实验原理明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。

通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。

通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。

二、材料与方法1试剂与溶液配制1.1试剂和仪器：酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2·2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5×蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。

水为去离子水或超纯水。

主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等1.2溶液配制1.2.1 5×SDS-PAGE电泳缓冲液配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。

使用时用去离子水稀释至1×，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。

明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。

10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。

注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。

先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。

如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。

你加了这个我保证你一辈子也做不出来。

蛋白浓度一般是先摸索一个量。

就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。

条带看不见的，或者太透明的，都不能选。

就是要半明半暗的那种。

看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。

(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。

明胶酶谱法 -回复明胶酶谱法是一种用于测定明胶酶活性的分析方法。

明胶酶谱法基于明胶酶对明胶的降解作用，通过测定明胶的降解程度来反映明胶酶活性。

这种方法可以在实验室中进行，通常需要一些特定的试剂和设备。

明胶酶谱法的原理是利用明胶对明胶酶的敏感性，通过观察明胶降解的速度来确定酶的活性。

在明胶酶谱法中，一般会选择特定浓度和分子量的明胶，以确保最佳的测定结果。

明胶酶谱法可以用来研究明胶酶对明胶的降解过程，了解酶的活性和特性。

这个方法可以应用于食品工业、制药工业等领域，用于检测明胶酶的活性和质量。

明胶酶谱法在实验室中的操作比较简单，但需要一定的实验操作技巧和对仪器的熟悉。

这种方法对明胶酶活性和测定结果的准确性有着重要影响，所以需要严格按照操作流程进行实验。

明胶酶谱法的操作流程包括样品制备、反应过程、数据记录等环节，需要仔细阅读方法说明书并进行实践。

在明胶酶谱法中，常用的数据处理方法有绘制酶活性曲线、计算酶活性单位等。

明胶酶谱法需要注意的问题包括试剂的质量、设备的准确性和对废液的处理等。

明胶酶谱法的优点是操作简便、结果准确可靠，可以在较短时间内完成分析。

明胶酶谱法的局限性在于它只是测定明胶酶活性的一种方法，不能全面了解酶的特性。

在明胶酶谱法中，一些因素如温度、pH值等会对酶的活性产生影响，需要进行恰当的控制。

明胶酶谱法的操作需要注意安全，避免对人体和环境造成伤害。

明胶酶谱法是一种常用的分析方法，被广泛应用于生物化学、食品科学等领域。

该方法在明胶酶的研究和应用中具有重要意义，可以帮助科学家们更好地了解酶的特性和机制。

明胶酶谱法的结果可以用于酶活性检测、比较不同酶样品的活性等。

这种方法还可以用于评估明胶酶的纯度和稳定性，指导生产过程中的酶的应用。

明胶酶谱法可以与其他分析方法结合使用，提高酶活性测定的准确度和可靠性。

该方法还可以用于研究明胶酶的底物特异性、抑制剂的效果等。

明胶酶谱法的发展使得对明胶酶的研究更加深入和全面。

明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。

静置于Trition中是不妥的。

）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。

Mmp-2 72kd mmp-9 92kd实验步骤1.取对数期的癌细胞在的C。

2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。

3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。

与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。

（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。

5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。

·简 报·改良明胶酶谱测定明胶酶活性①710032　西安　第四军医大学细胞工程研究中心　骞爱荣　商　澎　陈志南②关键词　明胶酶谱;基质金属蛋白酶;电泳;聚丙烯酰胺凝胶中图分类号　R965.2 基质金属蛋白酶(M MPs)是能降解细胞外基质和基底膜成分的酶家族成员之一。

这个蛋白家族包括胶原酶、明胶酶、基质素和膜型基质金属蛋白酶(M T-M MP)等5大类。

MMPs家族成员目前已鉴定出28种[1]。

M MP的基因表达水平和酶活性的高低与许多生理或病理过程及其恶性程度相关,如肿瘤转移、血管浸润、骨质疏松、组织纤维化等,尤其是明胶酶A和B(MMP-2,9)在肿瘤的转移和血管生成方面起重要的作用[2]。

目前,测定明胶酶活性的方法多用明胶酶谱法(gelatin zymog-raphy),即收集待测样本,处理后在含有明胶-聚丙烯凝胶中进行SDS-PAGE。

但是,传统的方法样品处理费时、费事。

因此,从方法学的角度,寻找简便实用的检测MM Ps活性的方法有重要的意义。

本文介绍一种改良的明胶酶谱方法,较好地解决了实验中遇到的一些难题,且简单、实用、结果可靠。

尤其是在筛选MM Ps的抑制剂时,该方法省时,省实验药物。

1　材料与方法1.1　常规仪器和试剂　垂直电泳槽和电泳仪(美国B io-Rad公司),图像分析系统(上海复日科技有限公司),96孔板(瑞典Nunc 公司),培养瓶,CO2培养箱(德国Heraeus公司),超净工作台,震荡器等。

明胶,Triton X-100(购自华美生物技术公司)。

1.2　酶谱电泳专用梳子和边条　自制专用梳子和边条的厚度1.2mm,齿孔宽度为13.3mm,每个梳子有5个孔。

1.3　试剂配制　1%明胶溶液;2×电泳载样缓冲液(5%SDS,2%蔗糖,0.2%溴酚蓝,50mmol/L Tris-HCl,pH6.8);电泳缓冲液25mmol/L Tris,250mmol/L甘氨酸,pH8.3,0.1%SDS;聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液:①30%的丙烯酰胺溶液;②1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8);③1.5mol/L Tris-HCl(p H8.8);④10%SDS;⑤10%过硫酸铵;⑥10%TEM ED;2.5%Triton X-100溶液;明胶酶缓冲液50mmol/L Tris,10mmol/L CaCl2,200mmol/L NaCl,1μmol/L ZnCl2 (pH7.5);染色液0.1%考马斯亮蓝R-250;脱色液甲醇∶水∶冰醋酸=45∶45∶10.1.4　样品制备　①人成纤维细胞(Fb)和人肝癌细胞(HHCC)培养至对数期,用0.25%胰酶消化,以105/孔的密度接种于96孔板中,培养24h;②第二天,弃去培养上清,用PBS洗2次后,加300μl 无血清培养液,培养24h;③收集无血清培养细胞上清,低速离心(200g)去除细胞碎片后,4℃备用。

酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生【摘要】目的建立检测肝星状细胞(HSC)合成的明胶酶(MMP-2,MMP-9)活性的方法.方法用含SDS-明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,检测体外培养的HSC所合成的明胶酶活性.结果酶谱法能灵敏地检测到HSC分泌到培养基中的MMP-2和MMP-9,培养基中MMP-2活性高于MMP-9,并观察到药物作用以后酶活性的改变.结论酶谱法是研究HSC调节肝纤维化过程中细胞外基质(ECM)代谢的有效手段.【期刊名称】《泰山医学院学报》【年(卷),期】2010(031)007【总页数】2页(P513-514)【关键词】肝纤维化;肝星状细胞;明胶酶;酶谱法【作者】王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生【作者单位】泰山医学院,山东,泰安,271016;泰山医学院,山东,泰安,271016;山东大学药学院,山东,济南,250014;山东大学药学院,山东,济南,250014;泰山医学院附属医院,山东,泰安,271000;泰山医学院,山东,泰安,271016【正文语种】中文【中图分类】R282.71肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内过量沉积为病理特征[1]。

近年的研究[2]表明肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,HSC从静止转化为激活状态可合成肝脏几乎全部 ECM,因此 HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节,同时合成大量 ECM,并通过其合成的基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)调节 ECM降解。

为了研究 HSC在ECM降解中的作用及用 HSC研究具有促进 ECM降解的药物,我们尝试了 HSC明胶酶谱的测定方法。

1 材料与方法1.1 实验材料明胶酶(gelatinase,17104-019,美国 Gibco BRL公司产品);TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺),过硫酸胺(amnonium persulfate,AP,A-6761)均为美国 Sigma公司产品;考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250),丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(bisacrylamide)均为美国 Bio.Basic.Inc.BBI 公司产品 ;Triton X-100、SDS等,美国SERVA公司产品。

明胶酶谱实验方法明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。

10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。

注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。

先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。

如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。

你加了这个我保证你一辈子也做不出来。

蛋白浓度一般是先摸索一个量。

就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。

条带看不见的，或者太透明的，都不能选。

就是要半明半暗的那种。

看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。

(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。

明胶酶谱法的定义和步骤
明胶酶谱法是一种常用于检测和定量分析细菌或其他微生物产生的明胶酶活性的实验方法。

明胶酶谱法通过将待测菌株培养在含有明胶的琼脂培养基上，并利用其产生的明胶酶在琼脂中形成透明带区来检测明胶酶活性的存在和水平。

明胶酶谱法的具体实验步骤如下：
1. 准备明胶琼脂板：将明胶溶液加入琼脂培养基中，制备明胶琼脂板；
2. 菌株预处理：将待测菌株培养在适当的富含明胶的培养基上；
3. 制备样品：将培养的菌液离心，收集上清液，加入样品缓冲液中；
4. 蛋白电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中，利用电场将蛋白质分离；
5. 明胶酶活性检测：将电泳胶浸泡在明胶酶活性染色剂中，在适当温度下孵育一段时间；
6. 显色和成像：将染色剂去除，并在电泳胶上观察到明显的透明带区，表示明胶酶活性的存在和水平。

通过明胶酶谱法，可以确定菌株是否产生明胶酶及其活性的强弱。

这种方法简单易行，并能够提供定性和半定量的结果。

这种方法在微生物学研究和临床诊断中得到广泛应用，尤其对细菌感染的相关研究具有重要意义。

明胶酶检测方法研究进展陈秋凤;周防震【摘要】明胶酶,亦称Ⅳ型胶原酶[1]、基底膜性胶原酶[2]等,属于基质金属蛋白酶( Matrix metalloproteinases,MMPs)范畴,包括明胶酶A(MMP -2或称72kDaⅣ型胶原酶)和明胶酶B(MMP-9或称92kDaⅣ型胶原酶),可降解Ⅳ型胶原、明胶和Ⅴ型胶原等基底膜成分,在组织炎症[3]、纤维化[4,5]、免疫[6]与肿瘤转移[7～9]等诸多过程中发挥重要作用.明胶酶检测方法从最初的明胶酶谱法到现在采用的ELISA法,从粗略定性到逐渐发展为准确定量,方法稳定性、可靠性逐渐完善,操作也变得更为简单.本文就明胶酶测定方法的研究进展进行综述.【期刊名称】《湖北民族学院学报（医学版）》【年(卷),期】2012(029)001【总页数】3页(P70-71,74)【关键词】明胶酶;检测方法;进展【作者】陈秋凤;周防震【作者单位】湖北民族学院附属医院湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院湖北恩施445000【正文语种】中文【中图分类】R739.87明胶酶，亦称Ⅳ型胶原酶[1]、基底膜性胶原酶[2]等，属于基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases, MMPs)范畴，包括明胶酶A(MMP-2或称72kDaⅣ型胶原酶)和明胶酶B(MMP-9或称92kDaⅣ型胶原酶)，可降解Ⅳ型胶原、明胶和V型胶原等基底膜成分，在组织炎症[3]、纤维化[4,5]、免疫[6]与肿瘤转移[7～9]等诸多过程中发挥重要作用。

明胶酶检测方法从最初的明胶酶谱法到现在采用的ELISA 法，从粗略定性到逐渐发展为准确定量，方法稳定性、可靠性逐渐完善，操作也变得更为简单。

本文就明胶酶测定方法的研究进展进行综述。

1 基于明胶酶催化活性的检测方法利用明胶酶能催化降解明胶的特点发展建立起来的检测方法主要有明胶酶谱法(Zymography)、荧光明胶酶法和DQ明胶(Dye-quenched-gelatin)原位酶谱法。

明胶酶谱法明胶酶谱法是一种新型的蛋白质分析方法，它可以提供准确准确的蛋白质质量分析和分子量分析结果。

明胶酶谱法可以快速有效地测定蛋白质中的氨基酸和糖基化激酶的活性。

这种方法通过使用蛋白质，核酸和其他复合物构成的聚合物，结合相关的酶诱发反应，来分析蛋白质的质量和分子量。

这些复合物可以在单独的氨基酸片段中用来测量激酶反应，从而识别活性位点，反映了蛋白质质量和分子量分析的结果。

明胶酶谱法的原理是基于胶质酶结合物，它由多种蛋白质，核酸和其他复合物组成，使用酶诱发反应来分析蛋白质的质量和分子量。

该方法由激酶和聚合物组成，它们分别催化了激酶和聚合物的反应，从而产生了激酶的活性。

此外，该方法还能够测量氨基酸片段的活性，这将有助于评估蛋白质的质量和分子量。

明胶酶谱法的应用可以追踪物质的合成和分解的变化，从而发现蛋白质结构及其功能的改变。

它可以用来研究蛋白质结合位点分布、激动酶及蛋白质与酶类分子识别蛋白质、以及酶促反应的参与者等，这些结果将有助于改善蛋白质的性能，这将有助于提高药物的疗效和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。

明胶酶谱法在蛋白质质量和分子量分析方面具有优越性。

它可以快速有效地识别活性位点，由此提供了精确的蛋白质质量和分子量的分析结果。

同时，该方法可以提供有效的数据，可以评估蛋白质的功能和结构。

它还可以用来研究药物及其代谢物的代谢，改善药物的性能和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。

由此可见，明胶酶谱法已成为药物研究和分析的一种重要的手段。

明胶酶谱法的应用可以提供准确的蛋白质质量和分子量分析结果，从而有助于研究者分析蛋白质的功能和结构，并改善药物的性能和安全性。

明胶酶谱法是一种有效的、快速的、有精度的、具有易操作性的蛋白质质量和分子量分析方法，因此它已经成为药物研究和分析的一种重要手段。

基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书（中文版）主要用途基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过明胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的无色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种细胞萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等）、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶-2，9，以及13等活性及其抑制剂的检测。

产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，条带清晰，重复性好。

技术背景基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。

其功能在于分解细胞外基质成分。

迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。

根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。

体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。

ZymographyProvided by Hsu suo-wen一。

用品1.细胞培养或者提取组织2.试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶）A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 5ml（包括）ddH2o 1.5ml30%储备胶 （0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺） 1.65ml1.5mol/l Tris（PH 8.8） 1.25ml10% SDS 50ul10%过硫酸铵（AP） 50ulTEMED 4ul1%明胶 0.5ml(or 100ul)(注意：天气如果较冷除TEMED，其他成分按顺序加完后要置于37度温育，最后加TEMED)B.浓缩胶的配制-同Western Blot浓缩胶 3mlddH2o 2.1ml30%储备胶 0.5ml1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml10% SDS 30ul10%过硫酸铵 30ulTEMED 3ul（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）（4）4 ×上样缓冲液20ml(不同于Western)0.32% Tris-HCL 6.4ml 50mM Tris 0.606g4%SDS（PH7.2） 8ml 2% SDS 0.2g16%甘油 3.2 ml 10%甘油 10ml溴酚蓝 0.024g 0.1%溴酚蓝 0.01gddH2o 2.4ml(20ml) (10mlsystem)(5) 洗脱液（1L）:2.5% Triton X-100（25ml），50mmol/L Tris –HCl（6.06g），5mmol/L CaCl2（or 10mMol 1.11g），1μmol/L ZnCl2，pH7. 6漂洗液（相比洗脱液，少了Triton）： 50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6注意：洗脱液不能重复使用，必须现配，尽可能多加洗脱液，温育摇动时注意Triton有毒。

明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。

静置于Trition中是不妥的。

）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。

试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括）ddH2O 4.5ml30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml1.5mol/l Tris（PH 8.8）2.5ml10% SDS 100ul10%过硫酸铵（APS）100ulTEMED 8ul1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5mlB.浓缩胶的配制浓缩胶6mlddH2O 4.5ml30%储备胶0.75ml1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml10% SDS 60ul10%过硫酸铵60ulTEMED 6ul（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）（4）4 ×上样缓冲液0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS（PH7.2）8ml16%甘油3.2 ml溴酚蓝0.024gddH2O 2.4ml(5)洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液）（6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）实验步骤1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

MMP明胶酶谱MMP-2&MMP-9明胶酶谱法检测试剂盒这步操作很关键哦！基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。

通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。

血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。

检测步骤1、制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。

按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。

将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟。

分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。

2、待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。

切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。

可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。

阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样。

注：因为全血成分复杂,MMP活性较低，的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照3、低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。

溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4、洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。

可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。

1) 母液配制：1. 10X明胶溶液（50ml）：称取500mg明胶，加入高压灭菌三蒸水约40ml，室温放置2h，使其吸水膨胀，然后置于65°C水浴，在15min之内溶成均匀的液体，最后定容至终浓度10mg/ml，于4°C备用。

注：样本量较多时一次性配制50ml，分装于5ml EP管中-20°C备用。

2. 10X 50mM Tris-HCl母液（2L）：即0.5M Tris-Hcl。

称取121.14g Tris-base，双蒸水溶解后浓盐酸调节pH值至7.5，定容至2L。

3. 20X 5mM CaCl2母液（1L）：即100mM CaCl2（分子量111）。

称取11.1g CaCl2，双蒸水溶解后定容至1L。

4. 2000X 1uM ZnCl2母液（1L）：即2mM/L ZnCl2（分子量136.30）。

称取0.2726g ZnCl2，双蒸水溶解后定容至1L。

（注：使用浓度实在太小，只好配大体积的母液增加精准度。

ZnCL2在水中呈絮状，用前剧烈震荡均匀）5. 10X 2.5% Triton X-100母液（400ml）：即25%TritonX-100。

100mlTriton X-100原液双蒸水稀释至400ml。

4度保存备用。

6. 10X Brij-35 0.02%母液（500ml）：即0.2%Brij-35。

称取1g Brij-35至400ml双蒸水，65度水浴加热至完全溶解后定容至500mL。

4度保存备用。

2) 使用液配制：1. 5×loadingbuffer配方:用培养细胞上清等浓度较低样本检测Tris-HCl(PH6.8) 0.4MSDS 10%Glycerol 50%Bromophenol blue 0.03%2. 2×loadingbuffer配方:用血清、组织样本等浓度较高样本检测0.125 M Tris–HCl, pH 6.84% (w/v) SDS20% (v/v) glycerol0.04% (w/v) bromophenol blue.3. 洗脱缓冲液1L：4. 漂洗液1L：5. 孵育缓冲液1L：6. 考马斯亮蓝R-250染色液（可重复使用）：Methanol 30%Acetic acid 10%Coomassie R blue 0.25%7. 脱色液：Methanol 20%Acetic acid 10%3) 操作步骤：1. SDS-PAGE胶的灌制：灌制8%SDS-page分离胶（同western blot，现配现用）和5%浓缩胶，分离胶加入1/10体积的10mg/ml的明胶溶液，使明胶终浓度为1mg/ml。

⑶RIPA 蛋白裂解液：称取Tris 0.605g、NaCl 0.8775g、TritonX-100 1g、1%脱氧胆酸钠1g、SDS0.1g，加入60ml 去离子水，盐酸调pH7.5，定容100ml。

⒂明胶酶谱试验孵育液Tris 2.97g，CaCl2 0.353g，NaN3 0.1g，去离子水400ml，pH7.6，定容500ml。

⒃明胶酶谱试验复性液2.5ml TritonX-100 加入去离子水100ml。

⒄明胶酶谱试验脱色液甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml，混匀，室温保存。

⒅10%明胶储备液明胶5g，去离子水40ml，加热、磁力搅拌至完全溶解，定容50ml，4℃冰箱备用。

⒆考马斯亮蓝R250 染液取甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml、0.1g 考马斯亮蓝R250，混匀，室温保存。

⑵BCA 法测定组织提取液的蛋白浓度。

采用Pierce 蛋白测定BCA 法试剂盒，按照说明书进行操作。

同第一部分。

A．制作蛋白浓度标准曲线生理盐水稀释蛋白标准溶液，配成梯度蛋白标准溶液浓度分别为：0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml 作液。

10μ l 不同浓度的蛋白溶液分别加入96 孔板，加入200μ l 工作液，室温放置30 分钟，测定OD562。

以不同浓度蛋白溶液测得OD562 数值为纵坐标，对应标准蛋白浓度为横坐标，制备蛋白浓度标准曲线。

B．待测样品蛋白浓度测定待测样品用生理盐水稀释50 倍。

取稀释样品10μl 置96 孔板，与200μl 蛋白浓度测定工作液（A:B=50:1）混合，室温放置30 分钟，测定OD562，利用蛋白质浓度标准曲线计算待测样品蛋白浓度。

3.5 明胶酶谱法检测MMP2、9 活性3.5.1 蛋白样品准备上述UTMD 后3 天（缺血再灌注后6 天）收集大鼠心脏梗死和边缘区及远端非梗死区组织匀浆，加入组织裂解RIPA 液（不含蛋白酶抑制剂cocktail），混匀，置冰上2 小时，13000rpm/分钟、4℃离心20 分钟，取上清获得组织提取液。

明胶酶谱MMP(2/9)检测实验
实验技术服务介绍：
酶谱法（Zymography）是基于SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法检测MMP-2、MMP-9 活性，其灵敏度可达10pg，高于ELISA 方法。

基本原理和程序：
以加有胶原酶底物的SDS-PAGE 凝胶分离含蛋白酶的样品，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。

凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，能同时指示MMP-2、MMP-9 的位置(酶谱)，可检测样本有血液、渗出液、细胞提取物等。

【晶莱生物】
样本提供需知：
1）客户告知实验分组、编号及背景设计资料，有具体要求请事先说明；
2）标本收集、保存与运送：
组织样品新鲜组织放入液氮或-70 度保存，组织不少于100mg；
培养细胞通过细胞计数取不少于2×106 个细胞于EP 管，加入0.5ml 生理盐水，混匀后保存于冰箱（-70℃，避免反复冻融）；
血液细胞标本以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml 生理盐水，保存（-70℃可长期保存，避免反复冻融）
血清或细胞培养液标本离心去掉杂质后取上清入EP 管，保存（4℃可保存15-20 天，-70℃可长期保存，避免反复冻融）
3）样本运输：
组织样本、细胞样本以干冰运输；
细胞样本也可直接寄送培养瓶（密封保证不污染、培养液不漏出）；
血清或上清液直接加冰袋寄（送视路程远近2-3 天可到达）。

⑶RIPA 蛋白裂解液：称取Tris 0.605g、NaCl 0.8775g、TritonX-100 1g、1%脱氧胆酸钠1g、SDS0.1g，加入60ml 去离子水，盐酸调pH7.5，定容100ml。

⒂明胶酶谱试验孵育液Tris 2.97g，CaCl2 0.353g，NaN3 0.1g，去离子水400ml，pH7.6，定容500ml。

⒃明胶酶谱试验复性液2.5ml TritonX-100 加入去离子水100ml。

⒄明胶酶谱试验脱色液甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml，混匀，室温保存。

⒅10%明胶储备液明胶5g，去离子水40ml，加热、磁力搅拌至完全溶解，定容50ml，4℃冰箱备用。

⒆考马斯亮蓝R250 染液取甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml、0.1g 考马斯亮蓝R250，混匀，室温保存。

⑵BCA 法测定组织提取液的蛋白浓度。

采用Pierce 蛋白测定BCA 法试剂盒，按照说明书进行操作。

同第一部分。

A．制作蛋白浓度标准曲线生理盐水稀释蛋白标准溶液，配成梯度蛋白标准溶液浓度分别为：0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml 作液。

10μ l 不同浓度的蛋白溶液分别加入96 孔板，加入200μ l 工作液，室温放置30 分钟，测定OD562。

以不同浓度蛋白溶液测得OD562 数值为纵坐标，对应标准蛋白浓度为横坐标，制备蛋白浓度标准曲线。

B．待测样品蛋白浓度测定待测样品用生理盐水稀释50 倍。

取稀释样品10μl 置96 孔板，与200μl 蛋白浓度测定工作液（A:B=50:1）混合，室温放置30 分钟，测定OD562，利用蛋白质浓度标准曲线计算待测样品蛋白浓度。

3.5 明胶酶谱法检测MMP2、9 活性3.5.1 蛋白样品准备上述UTMD 后3 天（缺血再灌注后6 天）收集大鼠心脏梗死和边缘区及远端非梗死区组织匀浆，加入组织裂解RIPA 液（不含蛋白酶抑制剂cocktail），混匀，置冰上2 小时，13000rpm/分钟、4℃离心20 分钟，取上清获得组织提取液。

明胶酶谱分析法实验原理酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。

静置于Trition中是不妥的。

）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。

实验步骤1. 取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

2. 次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。

3. 根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。

与5×上样缓冲液混合，13ul样本 4ul上样缓冲液。

（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4. 配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。

5. 电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris -HCl , 5mmol/ CaCl2, 0. 02%Brij-35,pH7.6) 中37℃孵育42h。