蛋白酶酶活测定方法及原理简介

蛋白酶酶活测定方法及原理Protease activity assay method and principle 方法原理福林酚法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。

考马斯亮蓝法考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

甲醛滴定法蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。

DHT-酪蛋白法用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。

以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。

选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。

DNA-溴乙锭荧光分析法溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。

接近饱和的溴乙锭(0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。

在DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。

通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。

X-光胶片法酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方，出现透明的圆圈。

蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。

测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。

2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。

荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。

3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。

通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。

4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。

5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。

需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。

蛋白酶酶活测定方法一、实验原理：一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。

本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。

在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。

一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。

二、试剂配制：A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。

底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。

三、操作步骤：1. 试样1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

2.空白1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

四、Lowry法显色反应试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反，空白的吸应30min。

1.5.2.2 蛋白酶活性测定采用福林酚−试剂法[3]测定肠道及肝胰脏中蛋白酶活性，其原理是：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯醋酸（TCA ）氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这些氨基酸可与福林酚试剂反应呈蓝色，用756分光光度计在波长680nm 测定。

蛋白酶活性的定义：1克食糜或组织在30℃，pH7.0[4]的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的酶量为1个蛋白酶活力单位。

测定步骤如下：将2%的酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴锅中预热3-5min ，每个样品取两个重复（每个酶液样品设一个空白对照），各取1mL 酶液注入试管中，在30℃恒温水浴锅中预热1-2min ，加入2%的酪蛋白1mL ，准确反应10min ，加0.4M 三氯醋酸2mL 终止反应，在水浴锅中静置10min 后过滤，取滤液0.5mL 加0.4M 碳酸钠溶液2.5mL ，并加入显色剂福林试剂0.5mL 摇匀，在30℃恒温水浴中显色20min ，取出放在756分光光度计，680nm 的波长下测定吸光度（OD ）。

蛋白酶活性计算公式：4—反应总体积(mL) 10—反应时间(min) K —标准曲线获取 N —酶液稀释倍数 M —样品质量(g)A. Setting up the Protease Assay1. Pre-heat 0.5% Casein solution In a water-bath at 30 o C for 5min2. Follow the following table蛋白酶酶活性(U/g) =4×K×OD×N 10×M3.4.Follow the following table to determine sample blank。

1 蛋白酶活力的测定1.1 原理采用福林-酚试剂法。

福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。

因此可利用此原理测定蛋白酶活力。

通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。

1.2 试剂1.2.l 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。

此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。

1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。

1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。

1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。

简述蛋白酶活力测定的原理蛋白酶活力测定是一种用于评估酶分解蛋白质的能力的方法。

蛋白质是生命活动不可或缺的重要分子，然而，它们需要在体内被分解为较小的分子才能被利用。

其中，蛋白酶是一种特殊的酶，它能够将蛋白质分解为较小的肽链或氨基酸。

蛋白酶活力测定的原理主要基于蛋白质分解后的产物——氨基酸的检测。

在这个测定中，蛋白质被蛋白酶分解为氨基酸，然后这些氨基酸与一些特定的化学物质反应，产生一种有颜色的产物，这种产物能够吸收光，从而使溶液的吸光度增加。

通过测量溶液的吸光度，可以定量地测定蛋白酶的活力。

具体来说，测定蛋白酶活力的步骤如下：1.准备测试样品：将待测的蛋白酶与适当底物（即待分解的蛋白质）混合，置于适宜的反应条件下。

2.设定反应时间：在一定时间内，蛋白酶将底物分解为氨基酸。

为了确保反应在最佳条件下进行，需要设定一个适当的反应时间。

3.终止反应：在反应达到设定时间后，需要终止酶促反应，以便停止蛋白质的分解。

通常使用一种称为终止液的化学物质来实现这一步骤。

4.显色反应：终止液中的化学物质将与氨基酸反应，生成一种有颜色的产物。

这种产物能够吸收光，从而使溶液的吸光度增加。

5.吸光度测量：使用分光光度计测量溶液的吸光度。

吸光度的大小与溶液中氨基酸的浓度成正比，因此可以用来计算蛋白酶的活力。

通过这种测定方法，可以评估不同样品中蛋白酶的相对活力，并了解在不同条件下的酶促反应动力学。

这对于研究蛋白质分解过程、优化蛋白质分解反应的条件以及生物工程等领域都具有重要意义。

此外，蛋白酶活力测定也可以用于诊断和治疗某些与蛋白质分解相关的疾病，如胰腺炎等。

总之，蛋白酶活力测定的原理是基于蛋白质分解后的氨基酸形成染料，通过测量溶液的吸光度来定量测定蛋白酶活力。

这种方法在生物学、生物工程和医学等领域具有广泛的应用价值。

水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。

二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。

将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。

按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。

匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。

酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。

取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。

方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。

1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。

1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。

3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。

实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。

2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。

酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。

3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。

4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。

将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。

三支试管中反应液用滤纸过滤。

另取三支试管（一支空白。

两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。

以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。

5.数据处理。

蛋白酶活性检验方法1 定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和P H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。

2 福林法（第一法）2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与P H条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。

2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。

混匀，过滤。

制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

2、2、5 盐酸溶液c（HCI）＝1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（P H＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（P H＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。