蛋白酶活性的测定方法及原理

蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。

测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。

2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。

荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。

3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。

通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。

4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。

5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。

需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。

蛋白酶酶活测定方法一、实验原理：一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。

本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。

在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。

一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。

二、试剂配制：A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。

底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。

三、操作步骤：1. 试样1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

2.空白1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

四、Lowry法显色反应试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反，空白的吸应30min。

1.5.2.2 蛋白酶活性测定采用福林酚−试剂法[3]测定肠道及肝胰脏中蛋白酶活性，其原理是：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯醋酸（TCA ）氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这些氨基酸可与福林酚试剂反应呈蓝色，用756分光光度计在波长680nm 测定。

蛋白酶活性的定义：1克食糜或组织在30℃，pH7.0[4]的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的酶量为1个蛋白酶活力单位。

测定步骤如下：将2%的酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴锅中预热3-5min ，每个样品取两个重复（每个酶液样品设一个空白对照），各取1mL 酶液注入试管中，在30℃恒温水浴锅中预热1-2min ，加入2%的酪蛋白1mL ，准确反应10min ，加0.4M 三氯醋酸2mL 终止反应，在水浴锅中静置10min 后过滤，取滤液0.5mL 加0.4M 碳酸钠溶液2.5mL ，并加入显色剂福林试剂0.5mL 摇匀，在30℃恒温水浴中显色20min ，取出放在756分光光度计，680nm 的波长下测定吸光度（OD ）。

蛋白酶活性计算公式：4—反应总体积(mL) 10—反应时间(min) K —标准曲线获取 N —酶液稀释倍数 M —样品质量(g)A. Setting up the Protease Assay1. Pre-heat 0.5% Casein solution In a water-bath at 30 o C for 5min2. Follow the following table蛋白酶酶活性(U/g) =4×K×OD×N 10×M3.4.Follow the following table to determine sample blank。

1 蛋白酶活力的测定1.1 原理采用福林-酚试剂法。

福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。

因此可利用此原理测定蛋白酶活力。

通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。

1.2 试剂1.2.l 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。

此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。

1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。

1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。

1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。

水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。

二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。

将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。

按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。

匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。

酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。

取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。

方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。

1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。

1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。

3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。

蛋白酶活性检验方法1 定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和P H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。

2 福林法（第一法）2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与P H条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。

2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。

混匀，过滤。

制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

2、2、5 盐酸溶液c（HCI）＝1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（P H＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（P H＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

蛋白酶活性电泳活性电泳(明胶酶谱法)一、实验原理明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。

通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。

通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。

二、材料与方法1试剂与溶液配制1.1试剂和仪器：酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2·2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5×蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。

水为去离子水或超纯水。

主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等1.2溶液配制1.2.1 5×SDS-PAGE电泳缓冲液配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。

使用时用去离子水稀释至1×，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。

实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。

实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。

胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。

酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。

胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。

这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。

不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。

E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。

由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。

在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。

器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。

试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。

1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。

2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。

一、实验目的1. 学习和掌握蛋白酶活性检测的基本原理和方法。

2. 了解蛋白酶的特性和作用。

3. 通过实验，学会使用相关仪器和操作技能。

二、实验原理蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶，其活性是指在一定条件下，蛋白酶催化蛋白质水解的能力。

蛋白酶活性检测通常采用紫外分光光度法，通过测定反应体系中蛋白质的降解程度来评估蛋白酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白酶样品（2）底物：酪蛋白（3）缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.0）（4）其他试剂：硫酸铜、碘化钾、氢氧化钠等2. 实验仪器：（1）紫外分光光度计（2）恒温水浴锅（3）电子天平（4）移液器（5）试管（6）烧杯四、实验步骤1. 准备实验试剂和仪器。

2. 配制底物溶液：称取一定量的酪蛋白，加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后备用。

3. 设置实验组：（1）取若干个试管，分别加入不同浓度的蛋白酶样品。

（2）在每个试管中加入相同体积的底物溶液。

（3）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。

4. 设置对照组：（1）取若干个试管，分别加入相同体积的蛋白酶样品和底物溶液。

（2）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。

5. 测定反应体系中蛋白质的降解程度：（1）取一定体积的反应体系，加入硫酸铜和碘化钾溶液。

（2）用紫外分光光度计测定反应体系的吸光度。

（3）根据吸光度计算蛋白质的降解程度。

6. 数据处理和分析：（1）绘制蛋白酶活性与酶浓度、反应时间的关系曲线。

（2）分析蛋白酶的特性和作用。

五、实验结果与分析1. 实验结果：（1）不同浓度的蛋白酶样品对底物溶液的降解程度不同。

（2）随着反应时间的延长，蛋白质的降解程度逐渐增加。

2. 分析：（1）蛋白酶的活性与酶浓度呈正相关，即酶浓度越高，活性越强。

（2）在一定反应时间内，蛋白酶活性随着反应时间的延长而增加，但当反应时间过长时，活性逐渐降低，可能是因为蛋白酶自身发生降解。

六、实验结论1. 通过本实验，掌握了蛋白酶活性检测的基本原理和方法。

蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。

磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。

由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。

利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。

2 仪器和设备2.1 分析天平：精度0.0001g2.2 恒温水浴：精度±0.2℃2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计: 精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。

3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。

3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml3.6 0.5mol/L的NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml酪素溶液称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。

解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展1 定义1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和PH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/ mL)表示。

2 福林法(第一法)2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与PH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。

2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50g、水50mL和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，见水定溶至1000ml。

混匀，过滤。

制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

2、2、2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。

2、2、5 盐酸溶液c(HCI)=1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液 (PH=7.5)适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液(PH=3.0)适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

华南农业大学综合实验报告实验项目名称：酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：所属课程名称：食品与发酵工业分析实验完成时间：2013.05.10糖化酶活力测定（直接滴定法）1、原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖 (还原糖)，以直接滴定法测定。

2、试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜钾溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2） 0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。

（3） pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。

（4） 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。

（5） 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。

（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶3、测定步骤（1） 5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。

用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。

（2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。

蛋白酶检测操作1. 概述蛋白酶检测是一种用于检测样品中蛋白酶活性和浓度的实验操作。

蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶，其活性和浓度的检测对于许多生物学和生化学研究非常重要。

本文将介绍蛋白酶检测的基本原理、常用的实验方法和操作步骤，并简要介绍一些常见的蛋白酶检测试剂和设备。

2. 基本原理蛋白酶检测的基本原理是通过特定的底物或试剂与蛋白酶发生反应来间接或直接测定蛋白酶的活性或浓度。

常用的蛋白酶检测方法包括颜色反应法、荧光法和质谱法等。

2.1 颜色反应法颜色反应法是一种常用的蛋白酶活性测定方法，其原理是将蛋白酶作用于特定的底物后，产生的产物与某些指示剂发生颜色变化，并通过测定颜色的强度来间接测定蛋白酶的活性。

常用的颜色反应法有Bradford法、Lowry法和BCA法等。

这些方法的原理相似，底物与蛋白酶作用后产生巯基体系或受酸水解而形成可着色反应产物，其颜色强度与酶活性成正比。

2.2 荧光法荧光法是一种直接测定蛋白酶活性的方法，其原理是利用荧光探针与蛋白酶反应后荧光强度的变化来测定酶活性。

荧光法具有高灵敏度、高选择性和实时监测的优点。

常用的荧光法有AF488-Casein法和AF488-Gelatin法等。

这些方法的原理是荧光探针与蛋白酶结合后产生荧光信号，可以通过荧光显微镜或荧光光度计进行测定。

2.3 质谱法质谱法是一种直接测定蛋白酶活性和浓度的方法，其原理是利用质谱仪对蛋白酶水解产物进行检测和定量分析。

质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的优点。

常用的质谱法有MALDI-TOF法和LC-MS法等。

这些方法的原理是将蛋白酶水解产物通过质谱仪分析和测定，可以得到酶活性和浓度的相关信息。

3. 实验方法和操作步骤3.1 颜色反应法3.1.1 Bradford法材料准备•Bradford试剂•蛋白质标准溶液•待测样品实验步骤1.准备一系列不同浓度的蛋白质标准溶液，浓度范围覆盖待测样品的浓度。

2.取一定量的标准溶液和样品，分别加入试管中。

实验四蛋白酶活力得测定一、实验目得1、了解蛋白酶活力测定得原理;2、掌握蛋白酶活力测定得方法。

二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力、本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。

在２８0ｎm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。

三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液(0、01g/ml):称取１。

0ｇ酶制剂,加１00ｍl蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数;② 0。

０2mol/L磷酸盐缓冲液(ｐH7.5);③ 1％酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加10０ml 0。

2mｏl/L磷酸盐缓冲液(PＨ7。

５),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存;④ 5%三氯醋酸(TCA)溶液。

四、实验步骤1、将5％TCA溶液与1％酪蛋白溶液在37℃下保温。

２、取四支1５ml具塞试管,分别标上记号A1、Ａ０、Ｂ1与B０、在A１与A ０试管中各吸入0、20ml酶液,在Ｂ１与B0试管中各吸入0.４0ml酶液,分别用0.2mｏl/L磷酸盐缓冲液定容至２、00ml。

在A0与B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温、3、在各试管中吸入2。

00mｌ1％酪蛋白溶液,在３7℃下保温10ｍin(准确计时)后,再向A1与Ｂ1试管中吸入6。

00ml５％三氯醋酸溶液。

4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。

5、在2８０ｎｍ波长下,分别以A0与B0滤液为空白,测定A1与B１滤液得吸光度。