蛋白酶酶活测定方法
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蛋白酶酶活测定方法及原理简介
蛋白酶酶活测定方法及原理Protease activity assay method and principle 方法原理福林酚法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。
考马斯亮蓝法考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
甲醛滴定法蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。
DHT-酪蛋白法用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。
以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。
选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。
DNA-溴乙锭荧光分析法溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。
接近饱和的溴乙锭(0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。
在DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。
通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。
X-光胶片法酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方，出现透明的圆圈。
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。
测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。
2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。
荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。
3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。
通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。
4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。
5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。
需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。
2测定原理蛋白酶在一定得温度与pＨ条件下，水解酪素（酪蛋白)底物，产生含有酚基得氨基酸（如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下，将福林试剂（Ｆolｉn）还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长68０nm下测定溶液吸光度.酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品得酶活力。
酶活单位得定义:每１mL粗酶液，在一定温度与pＨ值条件下,10min水解酪素产生１μｇ酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。
3仪器与设备3.1分析天平：精度为0、000１ｇ。
3.2紫外分光光度计.3.3恒温水浴锅:精度±０、2℃。
3.4ＰH计:精度为0、01PH单位.4试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。
4.1福林（Foliｎ）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42、4g/L）称取无水碳酸钠(Nａ2ＣＯ3）42、4g，用水溶解并定容至１000mｌ。
4.4三氯乙酸ｃ(ＣCl３COOH）=0、4ｍｏl/L称取三氯乙酸65、4g，用水溶解并定容至１000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c(NａOH）=０、5mol/L称取氢氧化钠片剂20、0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至10００ml,摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL)=1 mol/L及０、１ mol/L1 ｍol／L ＨCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至１000ｍL.0、1 mｏl/ＬHCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1０00mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pＨ=７、5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Nａ２HPO4•12H2O）6、02g与磷酸二氢钠（NaH2PO４•1２H2O)0、５g，加水溶解并定容至１０00mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝３、0,适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸(8０％～90％）10、6g，加水溶解并定容至1000 mL。
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。
2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。
3.4PH计：精度为0.01PH单位。
4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。
4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。
4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
紫外分光光度法测蛋白酶酶活
2013/05/13紫外分光光度法测蛋白酶酶活1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2、试剂和溶液三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。
2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解
分光光度法测定蛋白酶酶活分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。
2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。
3.4PH计：精度为0.01PH单位。
4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。
4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。
4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
实验四蛋白酶活力的测定
实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。
2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。
4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。
将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
三支试管中反应液用滤纸过滤。
另取三支试管（一支空白。
两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。
5.数据处理。
蛋白酶酶活的测定方法(福林法)
蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。
制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。
3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
蛋白酶酶活测定方法福林法
蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。
制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。
3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
蛋白酶活性的测定方法
结果分析
酶活性计算
根据实验数据，计算蛋白酶的活性，包括比活力和米氏常数等参 数。
显著性检验
通过t检验、方差分析等方法，对实验组和对照组之间的差异进行 显著性检验，确定实验结果是否具有统计学意义。
可重复性评估
评估实验结果的重复性，判断实验方法的可靠性和稳定性。
误差分析
误差来源
分析实验过程中可能存在的误差来源，如试剂不纯、 操作误差、仪器误差等。
电化学法
总结词
电化学法是一种快速、简便的蛋白酶活性测定方法，通过电化学信号的变化来检 测酶的活性。
详细描述
电化学法利用电化学探针或电极检测酶反应过程中产生的电化学信号，如电流、 电位等，通过分析这些信号的变化可以计算酶的活性。该方法具有快速、简便和 实时监测等优点。
核磁共振法
总结词
核磁共振法是一种高分辨率、高灵敏度的蛋白酶活性测定方法，通过检测核自旋磁矩的变化来计算酶的活性。
酶液的保存
选择适当的保存条件，如温度、pH值和添加稳定 剂等，以确保酶液的活性。
反应条件优化
温度对酶活性的影响
通过在不同温度下测定酶活性，找到最适温度范围，确保酶活性 的最大化。
pH对酶活性的影响
在不同pH条件下测定酶活性，找到最适pH值，确保酶活性的最大 化。
底物浓度对酶活性的影响
通过改变底物浓度，观察酶活性的变化，找到最佳底物浓度。
在测定过程中，可能存 在异常值、缺失值或重 复数据，需要进行数据 清洗，确保数据准确性 和可靠性。
图表绘制
通过绘制图表，如柱状 图、折线图或散点图， 可以直观地展示蛋白酶 活性随时间、温度、pH 等参数的变化趋势。
数据转换
根据需要，对数据进行 适当的数学转换，如对 数转换或归一化处理， 以便更好地分析数据。
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蛋白酶酶活测定方法
一、实验原理：
一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。
一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。
二、试剂配制：
A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）
试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。
底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。
三、操作步骤：
1. 试样
1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用
2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min
3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止
4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
2.空白
1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min
2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min
3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
四、Lowry法显色反应
试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反
，空白的吸应30min。
与水对照分别测定750nm吸光度，试样的吸光度为A
1光度为A。
五、标准曲线制作与线性回归
1．取市售标准牛血清蛋白（BSA，2mg/ml）溶液，按下表配制成不同溶度的标准蛋白溶液。
2．试管中分别加入不同浓度的标准蛋白溶液0.2mL和作为对照蒸馏水
0.2mL。
3．各试管中分别加入试剂A 1mL，室温下放置10min后，再每隔1min加入试剂B 0.1mL，立即振荡混匀后于37℃反应30min，反应结束后每隔1min 取出一支试管，于750nm测吸光度。
4．对不同标准蛋白溶液浓度（y，mg/ml）与吸光度差（S1-S0）作标准曲线与线行回归。
六、蛋白酶活性计算
蛋白酶活性（u/g或u/ml）=C×（A1-A0）×4.4×V/(0.4×T×W) 式中：C为标准曲线斜率，A1-A0为试样与空白吸光度之差，4.4/0.4为总液量换算系数，T为酶反应时间（min），V为粉末试样溶解体积（ml）或液体试样稀释体积（ml），W为粉末试样重量（g）或液体试样体积（ml）。