第五章临床标本的细菌学检验第一节血液及骨髓标本一、血液标本血液标本的细菌培养是诊断菌血症或败血病的堆本方法。
正常人的血液是无菌的、如从患者血液中检出细菌一般应视为病原菌(排除采集标本或具他操作过程污染)、提示有菌血症或败血症，或心内膜炎、心包炎、血源性骨髓炎。
常见的病原菌主要有金黄色或表皮葡萄球菌、链球菌(A、B群，肺炎链球菌等)、肠球菌、产单核细胞李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、伤寒及副伤寒沙门菌和厌氧菌等。
(一)标本采集1.采血时间及次数一般应在在抗生素治疗前、发热初期或高峰时抽血。
伤寒患者应在发热一星期内抽血。
化脓性脑膜炎、鼠疫或野兔热患者应在发热1-2天内抽血。
亚急性心内膜炎及布鲁菌感染的患者，除在发热期采血外、并要多次抽血(24h内3一4次)和增加抽血量(可增至10ml):2。
抽血部位及抽血量以无菌方法从患者肘静脉(图}}1}或股动脉采血。
采血量以培养基的1/ 10为宜。
成人一次采血5一10ml，婴儿为1一2ml。
血液抽出后。
立即以无菌手续注入培养瓶，充分混合后送检。
1.操作过程将血培养瓶置3 5 `C培养，每日观察1次;或将血培养瓶置全自动血培养仪中培养。
根据肉眼观察，对有细菌生长迹象或全自动血培养仪发出阳性警报的血培养瓶应及时作如下检验:①涂片作革兰染色，染色结果应及时与临床医师联系②分离培养，培养瓶疑有细菌生长时，及时接种需氧血琼脂平板，麦康凯(或EMB、中国蓝)及巧克力琼脂平板(二氧化碳环境)进行分离培养，待获得纯菌后。
再分别鉴定。
次代培养的琼脂平板继续培养48h后无菌生长、弃去。
③同时作菌种鉴定并直接作药物敏感试验，争取尽早得出结果，报告临床医师作为治疗的参考。
除肉眼观察外，应当在培养5d, 7d时作盲目移种，以免漏检。
外观清晰的培养瓶、或全自动血培养仪不报警的培养瓶，培养7d后作盲目移种(怀疑亚急性细菌性心内膜炎时应连续培养3星期)，仍无细菌生长者者可做阴性报告。
培养瓶中出现异常变化，提示有不同细菌生长。
见表5-l。
表5-1培养瓶中有细菌生长时的不同表现2.报击方式培养7d无细菌生长者、报告“培养7天无细菌生长”。
查见细菌，报告菌名和药敏结果。
3.菌血症、败血症的诊断标准①两次培养均出现同种细菌(可排除污染):②发病2星期后血中抗体滴度上升。
二、骨髓标本正常人的骨髓是无菌的。
若从患者骨髓中检出细菌(排除污染)，提示细菌性骨髓炎或菌血症、败血症。
常见病原菌同血液培养。
(一)标本采集1、标本采集部位和时间一般用骨髓穿刺针从骼骨采集骨髓标本最好在用药前、发热初期或高热期采样，阳性检出率较高J2.标本采集注意事项①严格无菌操作;②标本采集后立即注入血培养瓶、送检。
(二}检验方法和操作流程检验方法和报告方式同血培养，见图5一2。
第二节脑脊液标本脑脊液的细菌学检查对于细菌性脑膜炎的诊断有重要的临床价植。
正常人的脑脊液是无菌的、检出细菌提示有细菌性(急性化脓性、结核性等)脑膜炎。
常见的病原菌主要有脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、链球菌( A、B 群和肺炎链球菌)、葡萄球菌、产单核细胞李斯特菌、结核分枝杆菌等。
(一)标本采集由临床医师以无菌操作腰椎穿刺(图5一3)，抽取脑脊液2一3m1,盛于无菌容器中送检。
脑膜炎奈瑟菌离体后能产生自溶素、迅速自溶;肺炎链球菌及流感嗜血杆菌也易死亡。
因此脑脊液无论涂片或培养、必须于采集后立即送检，不宜将其置于冰箱保存、否则影响检出率。
涂片检查(1)一般细菌涂片检查:除结核性脑膜炎外，由其他细菌引起的化脓性脑膜炎、脑脊液大部分明显混浊，可直接涂片，革兰染色后镜检。
无色、透明的脑脊液应离心后涂片、染色、镜检。
根据染色及形态特征,常可初步提不细菌的种类例如，革兰阴性、凹面相对的球菌，可能是脑膜炎奈瑟菌，链状排列的革兰阳性球菌，可能是链球菌；长丝状等多形态性的革兰阴性杆菌，可能是流感嗜血杆菌。
⑵结核分枝杆菌涂片检查: 取脑脊液的离心(3000r/min ,30min)沉淀物作抗酸染色。
如有纤维团，直接取纤维团涂片。
镜检必须非常仔细，因为往往在一张玻片上只能找到1一2个结核菌。
(3)新生隐球菌涂片检查取脑脊液的离心沉淀物作墨汁负染色.或取脑脊液的离心沉淀物接种于沙氏培养基上，置于35℃培养2一5d,根据菌落特性、涂片染色镜检作出报告:必要时可再作生化反应及动物试验进一步鉴定。
2．分离培养用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分时接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板、置于二氧化碳环境中35℃培养18 -- 24h，观察细菌生长情况，根据菌落特点、形态与染色及生化反应鉴定细菌、并作药敏试验。
3.报方式培养48 h，仍无细菌'生长者，报告“培养2天无细菌生长”。
查见细菌，报告菌名和药敏结果。
第三节呼吸系统标本一、痰标本痰标本的细菌学检查对于呼吸道感染的诊断有重要意义。
下呼吸道的痰液是无细菌的，而经口腔咳出的痰带有多种上呼吸道的正常寄生菌(如草绿色链球菌)。
若从患者痰标本中查见致病菌或条件致病菌，提示有呼吸道细菌感染。
常见的病原菌主要有肺炎链球菌、A群链球菌、金黄色葡萄球菌、卡他布兰汉菌、白喉捧状杆菌、结核分枝杆菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肠杆菌和军团菌等。
（一)标本采集1.痰标本的采集时间一般以晨痰为好;支气管扩张症患者，清晨起床后进行体位引流，可采集大虽痰标本。
2.标本采集方祛(1]自然咳痰法:在留取痰之前，用清水反复漱口.以减少常居菌的污染，应从气管深部咳出痰、吐入无菌容器内。
(2)气管镜下采集法: 在病灶附近用导管吸或用支气管刷直接取得标本。
(3)气管穿刺法:抽取痰液，收集标本〔图5一5)，1.肉眼观察包括颜色、粘度、有无血丝或脓。
2．涂片检查痰涂片的目的有二。
其一为确定标本是否适合做细菌培养。
直接涂片镜检、依据100 X镜下观察白细胞和上皮细饱数目多少来评定（表5-2 )。
其二是初步判定是否有病原菌存在。
(1)一般细菌涂片:挑取脓性或血性痰液制成薄而均匀的涂片，染色后锐检。
⑵)结核分枝杆菌涂片:以接种环取干酪样或脓性部分制成涂片、进行姜—尼染色和“O”荧光染色后镜检。
前者用油镜检查，后者用荧光显微镜高倍检查。
应查遍整个涂片，根据所见结果报告“找到(或未查到)抗酸杆菌”。
⑶放线菌及诺卡菌涂片: 将痰液用生理盆水洗涤数次，如含血液，则加水溶解红细胞，然后挑取黄色颗粒或不透明的着色斑点，置载玻片上、覆以盖玻片、轻轻挤压，置高倍镜下观察其结构、如见中央为交织的菌丝，末端呈放线状排列，较粗呈杵状、然后揭去盖玻片。
干燥后作姜—尼染色镜检。
如查见中间部分的菌丝为革兰阳性，而四周放射的末端为革兰阴性，姜一尼染色为非抗酸性者，可报告为“找到放线菌’，;如查见革兰染色结果与放线菌相同。
但萋—尼染色为杭酸性，可报告为“找到诺卡菌”。
4.培养（1)培养标本的选择: 应选择粘液脓痰作涂片，排除不合格的标本。
⑵痰标本培养前处理:用无菌盐水将痰洗涤3次、除去痰液表面的常居菌、加人等量的胰酶溶液(ph7.6})，37℃水浴90min，使痰液均质化后备用。
(3)分离培养:处理后痰液接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯(或EMB ，中国蓝)琼脂平板，置5%-10%二氧化碳环境中，3 5℃培养18-24h,根据菌落及形态特点，作出初步判断然后按各类细菌特征进行生化鉴定，并同时作药物敏感测定。
3.报告方式草绿色链球菌为口腔和鼻咽部的正常菌群，痰标本培养48h后仅有草绿色链球菌生长而无致病菌生长，报告“正常菌群”。
查出的致病或条件致病菌报告菌名和药敏结果。
同时报告细菌的量化指标(表5-3)，如“少量、中等或多量”二、咽拭标本咽拭培养对于上呼吸道的细菌感染有一定的诊断意义。
正常咽拭有多种上呼吸道的正常菌群(如草绿色链球菌)。
若从患者咽拭标本中查出致病菌或条件致病菌提示上呼吸道有细菌感染(如急、慢性扁桃体炎，咽炎，喉炎等)。
常见的病原菌主要有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、微球菌和棒状杆菌等。
(一)标本采集用无菌棉拭子轻轻擦试患者鼻咽部粘膜(图5-7 ),留取标本，置无菌试管内送检。
(二)检验方法和操作流程(图5一6)1．涂片检查(先培养后涂片)观察细菌的量、细菌的形态和染色性。
2，分离培养接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板、及麦康凯(或EMB及中国蓝)琼脂平板。
在5%一10%二氧化碳环境中，35℃培养18 – 24h,根据菌落及染色形态特点，作出初步推断;进一步作生化鉴定和药敏试验。
3．报告方式同痰标本检查。
第四节穿刺液标本各个部位穿刺液(胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等)的细菌学检查对于确定该部位是否有细菌感染具有诊断价值。
正常穿刺液是无菌的，若从患者穿刺液中查见致病菌或条件致病菌提示该部位有细菌感染。
胸腔感染的病原菌以结核分枝杆菌多见，其次是金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等;腹腔感染的病原菌以肠道细菌如大肠埃希菌、粪肠球菌，以及结核分枝杆菌多见。
心包炎和关节腔液以金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等多见。
(一〕标本采集采用无菌方法用注射器抽取体内可疑感染部位的液体(胸水、腹水、心包液、关节液或鞘膜液等)，注入无菌试管立即送检。
如怀疑厌氧菌感染，应做床边接种。
〔二)检验方法和操作流程(图5-8)1.涂片检查(先接种后涂片)脓性标本直接涂片。
浆液性标本先离心(3 OO0r/min, 15min),取沉淀物涂片2张，一张涂片作革兰染色、观察有无细菌，以及细菌的形态;另一张涂片作姜一尼染色，观察有无抗酸杆菌。
2.分离培养⑴普通细菌培养:接种血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯琼脂平板(或EMB及中国蓝琼脂平板)，5%一10%二氧化碳条件下，35℃培养18一24h、根据菌落及染色形态特点，作出初步判断。
⑵厌氧菌培养:床边接种或从厌氧运送培养基转种后，立即置厌氧环境中，35℃培养24～48h，挑取可疑菌落作耐氧试验。
确定为厌氧菌。
(3)结核菌培养:离心，取沉淀物接种罗氏培养基，35℃下培养3一4星期，观察有无可疑菌落现。
根据细菌形态和染色性、生长条件(需氧、厌氧、结核分枝杆菌培养)、菌落特征，以及生化特性鉴定细菌（必要时作血清凝集和毒力试验)，并作药敏试验。
3报告方式培养48h无细菌生长，报告“培养2天无细菌生长”查见细菌，报告菌名和药敏结果。
第七节脓液及创伤感染分泌物标本脓液的细菌学检查对于确定感染的种类(结核性或非结核性等)、提供药物敏感结果、指导临床治疗有重要的意义。
化脓性感染可由单种或多种细菌引起。
常见病原菌主要有金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌和肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和结核分枝杆菌、诺卜菌。
以及梭杆菌和拟杆菌等。
(一)标本采集1卜开放性脓肿和脓性分泌物先以无菌盐水冲洗溃疡表面，用2支灭菌棉拭取溃疡深处的分泌物后插入斯氏(Stuart)运送培养基内送检。
