蛋白质定量研究技术方法及差异表达蛋白质作用通路分析95页PPT

53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 — 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
蛋白质的研究方法与原理 PPT课件
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生

芳香族氨基酸的紫外吸收
优 点 • 快速
• 对蛋白质无破坏性
缺 点 • 不是严格的定量，适用于测定蛋
白质粗提液
• 核酸可引起强干扰作用 •芳香族氨基酸含量差异可以起误 差
计算方法 • 标准曲线法
• 蛋白质浓度 (mg/ml)
=1.45×A280-0.74×A260
注意事项
• 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液
PVDF膜 尼龙膜
0.22 um 0.45 um
80-100 ug/cm2
170-200 ug/cm2
< 20kD不易丢失 容量大、强度高
480 ug/cm2
用于核酸
电转移装置
电转移示意图
电转移装置
4. 靶蛋白的免疫学检测
➢ 封闭
— 对转移膜上的潜在结合位点进行封闭 ，防止抗体非特异性结合在膜上，降低背 景颜色
液280 nm的光吸收值是分析 蛋白质的分子量范围 15～200 KD之间
SDS-PAGE凝胶的制备 二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量
溶液中蛋白质含量的快速简 这一方法可用来快速检测溶液中是否含有
注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡 ！
便的方法
一、免疫印迹分析的应用
➢ 对蛋白质进行定性分析
➢ 对蛋白质进行半定量分析 ➢ 信号转导分析
➢生物大分子相互作用分析
二、免疫印迹分析的基本流程
制备蛋白样品 电泳分离蛋白
转移至固相膜
蛋白质转移
封闭非特异结合位点
与第一抗体温育反应
抗体检测
与第迹操作流程图
1. 样品的制备
优 点 • 终产物稳定

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2、利用微电极直接测定凝胶表面的p H而得知样品的等电点；
3、将凝胶切成等距离(5nm)的小块， 浸于水中，用精密试纸测定pH。以凝 胶块距正极的距离为横坐标，pH为纵 坐标作用图得出胶的pH梯度曲线。根 据待测样品在凝胶中的位置而得出蛋
白质样品的等电点。
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与标准蛋白比较，得出样品蛋白的含量。
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免疫印迹技术的基本操作(例PKC)
1、细胞裂解物的制备 2、细胞裂解液蛋白含量测定 3、细胞裂解物SDS－PAGE电泳 4、蛋白质转膜 5、目的蛋白的检测
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转变为硫酸铵。
Pr＋H2SO4
CO2＋H2O＋(NH4)2SO4
(NH4)2SO4+2NaOH NH4OH+HCl
NH4OH+H2SO4 NH4Cl+H2O
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凯氏法的评价： 优点：
1、适用于一切形态的样品； 2、不用比色，对混浊不透明的样品也可 进行分析； 3、结果的精、准度较高。
其它蛋白质定性定量分析技
术
蛋白质的电泳染色定量分析
特定蛋白质在总蛋白中所点比例的分析：最
早应用于血浆蛋白电泳分离后白蛋白和球蛋
白的比例测定。其方法有二，其一是将染色
后的蛋白区带剪下，用适当的溶剂提取后比
色测定；其二用反射扫描仪处理后，计算各

抗体
Western Blotting 实验技术
免疫印迹法
之 封闭
目的：防止抗体与膜的非特异性结合。
脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
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免疫印迹法
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SDS-PAGE 注意事项
免疫印迹法
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W品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
免疫印迹法
之 流程详解
（3） 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
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硝酸纤 维素膜
价格便宜
Western Blotting 实验技术 之 转膜
个人简介
血统：正宗重庆人 ——直爽、耿直
普通话：渝普话
——多多包涵
爱好：篮球
——切磋投篮
邮箱：
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酶解
蛋白质 PMF
肽的混合物
蛋白质组研究路线
搜索引擎 Search engine
验证
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数据库 搜索结果
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RNAi实验流程
授课内容
一
候选蛋白质的验证
1
下一讲
凯氏定氮法：蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐，与浓NaOH 作用，产生氨气，吸收于标准硼酸溶液中，用标准酸直接滴 定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（16%），换算出 蛋白的含量。 福林-酚法（Lowry法）：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸残 基与Cu2+结合，生成复合物，进而还原酚试剂的磷钼酸， 生成蓝色化合物，用比色法测定。
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免疫印迹法
SDS-PAGE 电压设置 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电 压恒压电泳。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分 子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

拖尾"point streaking") 。
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。

就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白 完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
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非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
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细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
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#
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等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
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5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
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计算
〔1〕规范管法〔规范比较法〕 实践测定过程中，用一知浓度的测定物
按测定管同样处置显色，读出吸光度，再根 据前式计算。
A规范/A样品= KC规范/ KC样品 C样品=A样品/A规范×C规范
A：吸光度；K：吸光系数；C：溶液浓度；L： 液层厚度
〔2〕规范曲线法
配制一系列知不同浓度 的测定物溶液，按测定 管同样方法处置显色， 分别读取各管吸光度。
测定管
0.1
5.0
实验三 紫外分光光度法
【根本原理】 Tyr and Trp包含不饱和的共轭双键，因此蛋白质具
有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm波优点， 可利用该吸收峰值估计蛋白质浓度; 核苷酸是蛋白质样品中的主要污染成分, 其在280nm 处也有吸收峰, 但最大吸收峰值出如今 260nm;
Protein Conc (mg/ml)=1.45A280-0.74A260; A280/A260>1.5 (核苷酸的污染可以接受) ; 不够准确，但较为简便，样品可回收利用; 灵敏度：50-100μg
2．比尔〔Beer〕定律 一束单色光经过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介
质的浓度的添加呈指数减少。 LgI0/I=KC
I0 :入射光强度； I :透射光强度；C ：介质浓度 K：吸光系数
mbert-beer’s law
一束单色光经过某溶液时，光波被溶液吸收一部分， 吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。
2. 在试管架上有3中蛋白质样品 a. 规范血清，浓度70 mg/ml. 在Improved Lowry Assay中，用于 制备不同浓度的规范样品； b. 用于 Improved Lowry Assay的未知样品； c. 用于 Bradford assay的未知样品(勿稀释).。

但是仅仅进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质的功 能的全部信息，监控蛋白质的表达水平对阐明细胞 体内存在的各种生物进程是非常重要的。因此，定 量蛋白质组学作为蛋白质组学研究的重要一部分被 提出来。
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常用研究方法
以质谱技术为基础的化学标记定量方法 荧 光 差 示 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 （ F－2D－
质量变化依赖于氮原子数目，因此对未 知的蛋白质难以进行定量。
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（二）稳定同位素标记的必需氨基酸体 内标记(SILAC法)
高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入，如赖氨酸 (Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等，这些氨基酸细胞自身 无法合成，需要从外界摄入补充。
在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标 记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合 成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。
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MCAT策略流程：定性
Lys只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的y 离子带Lys，因此被修饰。
在MS/MS图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现， 丰度比例一样，且相差同样的m/z。
容易区分b离子和y离子，容易读出氨基酸序列。
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MCAT策略流程：定量
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–COOH羧基标记
通过对羧基酯化进行 标记
用H和D标记的甲醇酯 化标记，来定量研究 蛋白质表达量的差异
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羧基酯化标记进行蛋白定量研究
比例＝2 : 1
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缺点：
特异性不是很好，在C末端和Asp和 Glu残基上都有标记，且效率不均
采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺

遗传分析可揭示该蛋白质在细胞中的作用－某 一蛋白质的基因可通过突变失活或用重组DNA 技术删除，进而研究其突变体的表现型，揭示 该蛋白质的作用
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蛋白质折叠
蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学” 的重要课题。研究蛋白质特定三维空间结构形 成的规律、稳定性和与其生物活性的关系。
三维凝胶块芯片
是在基片上点布以10000个微小聚苯烯酰胺凝胶块，每个凝胶 块可用于靶DNA、RNA和蛋白质的分析。这种芯片可用于筛选抗原 抗体、酶动力学反应的研究。该系统的优点是：凝胶条的三维化 能加进更多的已知样品，提高检测的灵敏度；蛋白质能够以天然 状态分析，可以进行免疫测定、受体、配体研究和蛋白质组分分 析。
蛋白质分析法
蛋白质纯化 蛋白质测序 分子量的测定 X－射线晶体学与核磁共振 功能分析 蛋白质折叠 蛋白质组学 蛋白质芯片
Байду номын сангаас
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蛋白质纯化
为了研究某一种蛋白质，必须首先将该蛋白质 从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来
用于分离蛋白质的最重要的依据
– 分子大小 – 电荷 – 疏水性 – 亲和性 – 重组技术
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蛋白质组学
Proteomics is the systematic study of all of the proteins in a cell, tissue, or organism.
proteomics has been used to identify hundreds of proteins in the ovary, prostate, breast, and esophagus that increase or decrease as cells begin to grow abnormally.

2. 亲和层析是高度浓缩的过程；
3. 可从样品中去除大量杂质； 4. 可在活性物质中去除理化性质几乎完全相同的但已失
活的那些“杂质”。
亲和层析中的三大通用技术
1. 免疫亲和层析：将蛋白质抗体偶联到免疫亲和柱可 用于抗原蛋白的纯化；
2. 凝集素亲和层析：凝集素是一大类能专一性和糖类和糖 复合物结合的蛋白质，固定化凝集素可用于糖蛋白纯化 ；
相对离心力/×g 1 000 4 000
15 000 30 000
100 000
时间/min 5 10
20 30
3～10 h
沉降的组分 真核细胞 叶绿体、细胞碎片、 细胞核 线粒体、细菌 溶酶体、细菌细胞
碎片 核糖体
2. 粗分级分离（rough fractionation）
获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与其它杂 蛋白分离开来。
亲和层析是基因工程中最常用的纯化技术
❖ 在各种表达载体上都带有各种标签蛋白，如GSTtag、His-tag、V5-tag等，它们不仅可用于鉴定蛋白表
达与否，更可用于与之相连的目标蛋白的纯化；
❖ 通过免疫亲和层析技术，只需一步，即可纯化带 有标签的目标蛋白。
亲和层析的优点
1. 高效与简便：一旦固定化配体制备好后，操作使用非常 方便；
❖ 疏水层析的机制与离子交换层析正好相反，因此两者 是互补的。
反向层析与疏水层析原理相同
❖ 反向层析，或称反相色谱，reverse phase
chromatography，是液相色谱分析中最常用的技术
。
❖ 当反相色谱用于蛋白质分离时，其原理与疏水层 析基本相同，区别在于：
① 疏水层析的配基疏水性较弱（苯基等），所以高盐 吸附，低盐洗脱；