蛋白质在金属螯合亲和色谱中的竞争洗脱

玉米芯纤维素基金属螯合亲和吸附剂对牛血清白蛋白的吸附研究李步海;张永红【摘要】以玉米芯纤维素为基质,通过环氧氯丙烷（EPI）交联活化、亚氨基二乙酸（IDA）修饰、金属离子Cu,Fe,Zn,Ni螯合制得亲和吸附剂.通过红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）、原子吸收分光光度法（AAS）对其表征.考察了pH、离子强度、初始浓度、洗脱液等因素对螯合了不同金属离子的吸附剂吸附牛血清白蛋白（BSA）的影响.结果表明：对强亲和性的Cu（Ⅱ）螯合亲和吸附剂对BSA的吸附主要受配位作用控制,而对弱亲和性的Fe（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）螯合亲和吸附剂则主要受静电作用影响,配位作用为辅.%Several biosorbents were successfully prepared using coin cellulose as supporting materials, epichlorohydrin (EPI) as crosslinking agent and iminodiacetic acid (IDA) as modification agent. Adsorbents with metal-chelated affinity were obtained by chelating with Cu, Fe, Zn and Ni metal ions respectively. These novel adsorbents were characterized with FIIR, XPS and AAS. The effects of pH, ionic strength, initial concentration, desorbents on the adsorption of adsorbents for BSA were studied. It was proposed that the retention of protein on Cu ( 11 ) chelating affinity adsorbent was mainly dominated by the coordination role between the immobilized metal and protein. The protein retention on Fe( II ), Zn( lI ) and Ni( 11 ) chelating affinity adsorbents with weak affinity was mainly controlled by the electrostatic interaction between metal chelating ligand and protein, whereas the coordination role was additional in the protein retention.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(031)004【总页数】5页(P1-5)【关键词】纤维素;金属螯合亲和吸附剂;吸附;洗脱;牛血清白蛋白【作者】李步海;张永红【作者单位】中南民族大学化学与材料科学学院分析化学国家民委重点实验室,武汉430074;中南民族大学化学与材料科学学院分析化学国家民委重点实验室,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】O652.6固定化金属螯合亲和色谱法(IMAC)是近年发展起来的蛋白质分离技术，它最初由Porath 1975年引入［1］，与普通的亲和层析相比，它价廉、合成方便、稳定、可选择金属离子多、可在高盐浓度下操作，容易再生等，主要适用于具有金属离子亲和能力的蛋白质吸附和分离纯化.目前商品化的IMAC亲和介质制备一般是在软基质Sepharose上用化学偶联法引入螯合剂，再通过螯合剂固定金属配基.由于软基质易被压缩，分离操作只能在低流速下进行［2］，对色谱操作压力有一定的限制，限制了其在实际应用中的规模和工作效率，故载体的选择成为关键.现有研究结合亲和色谱特异性高、膜技术分离快、处理量大，成功研制了亲和膜，使生物工程产品的大规模分离纯化成为可能.纤维素不仅作为一种优良的膜材料，还是良好的亲和载体，是亲和膜介质的首选材料，而制备价廉易得的产品成为研究者的首要任务.玉米在我国产量丰富，玉米芯的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，纤维素和半纤维素都是可再生资源，目前在工业生产中仅利用了玉米芯的半纤维素，故将玉米芯纤维素用于蛋白质分离纯化和酶固定化基质材料具有很好的应用前景.研究表明，以纤维素滤纸为材料制备固定化金属亲和膜用于Cu/Zn-SOD的分离、人血清白蛋白除杂及其他生化制剂的纯化等，都取得良好的效果［3-4］.本研究以玉米芯纤维素为基质制得螯合有不同金属离子的IDA型亲和吸附剂，应用该吸附剂进行牛血清白蛋白(BSA)的吸附.通过考察溶液的pH值、离子强度等不同条件下BSA在吸附剂上的保留行为，探讨了固定金属与蛋白质间的相互作用机理，为蛋白质的分离纯化提供理论依据.1 实验部分1.1 材料与仪器实验用玉米芯由山西农户提供，粉碎后过200目筛，与去离子水充分混匀，浸泡24 h，去除悬浮细小物质和可溶性物质，室温下风干备用.环氧氯丙烷(EPI)、亚氨基二乙酸(IDA)、BSA购于上海试剂公司，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、CuSO4·5H2O等均为国产分析纯试剂.酸度计(PHS-4型，上海大普仪器有限公司)，集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S，上海卫凯制冷仪器设备有限公司)，恒温水浴摇床(SHZ-03，上海堪鑫仪器设备有限公司)，X射线光电子能谱仪(VGMultilab 2000)，傅立叶红外光谱仪(NEXUS 470智能型，美国珀金一埃尔默公司)，荧光/磷光/发光光度计(LS-55型，美国PE公司).1.2 Me(金属离子)亲和吸附剂的制备将玉米芯与 NaOH(0.04 g/mL)－H2O2(5×10－3 g/mL)水溶液按固液比为1∶8混均后于95～100℃水浴4 h，取出真空抽滤，低温干燥剩余固体备用［5-7］.将制得的玉米芯纤维素放入4 mol/L NaOH溶液溶胀45min后，再加入20mL的环氧氯丙烷(EPI)、二甲基亚砜(DMSO)混合液(1∶1，V/V)，放入70℃水浴中活化45min，将活化后的玉米芯纤维素用大量去离子水洗至中性.称取适量的亚氨基二乙酸(IDA)，用10mL 1.5 mol/L Na2CO3溶液溶解，放入活化好的玉米芯纤维素，60℃偶联反应15～16 h，去离子水洗至中性.取4份分别浸入到浓度为0.05mol/L的 CuSO4、FeSO4、ZnSO4、NiSO4溶液中，3 h后取出，并用去离子水洗至无残余的金属离子，制得4种金属离子螯合的玉米芯纤维素亲和吸附剂备用. 1.3 Me(金属离子)亲和吸附剂的表征1.3.1 红外光谱(FIIR)将修饰前后的吸附剂用KBr粉末压片后，在红外光谱仪上观察4000～400cm－1各峰的变化，研究修饰前后吸附剂表面官能团的变化.1.3.2 X射线光电子能谱分析(XPS)用XPS分析修饰前后纤维素表面的各元素成分的变化，干燥的样品表面在10－8托真空度条件下，用Mg X-ray分析，谱图用284.6 eV的C1s基碳峰校正，Avantage 3.22软件拟合.1.3.3 金属离子螯合量的测定准确称取一定量的金属螯合吸附剂，加入同体积同浓度(0.05mol/L)的EDTA溶液于恒温振荡器振荡3 h，离心后，原子吸收分光光度法测定上清液中金属离子的量即为金属离子螯合量.1.3.4 BSA 的吸附分别称取20.0 mg干燥的吸附剂各2份，置于2个25 mL锥形瓶中，设为1、2号.l号加入10 mL磷酸盐缓冲溶液，2号加人10 mL 0.4 g/L BSA缓冲溶液，25℃摇床，130 r/min振荡吸附10 h，取上清液.以l号为参比，2号加入初始浓度的BSA液为对照，用荧光分光光度计在激发波长为280nm，发射波长为350 nm下测定其荧光强度值，计算亲和吸附剂的吸附量.1.3.5 BSA 的洗脱用不同浓度的NaCl和NaSCN溶液对吸附了BSA的吸附剂洗脱.在1号、2号移去上清液的2个锥形瓶中各加入10 mL洗脱剂，25℃摇床振荡10 h后，取上清液，测定BSA含量，计算洗脱率.2 结果与讨论2.1 玉米芯纤维素金属螯合吸附剂的表征2.1.1 红外光谱(FIIR)IDA成功修饰到吸附剂表面，反应历程见图1.在结合环氧氯丙烷(EPI)和亚氨基二乙酸(IDA)这2个步骤中，使用红外光谱检测，结果见图2.由图2可见，曲线a中于1250、866 cm－1出现环氧基的特征谱带.曲线b中环氧基的特征谱带消失，于1784cm－1出现吸收带.这是由于环氧基与螯合物(IDA)发生偶联反应后产生的特征谱带.图1 反应历程Fig.1 Reaction process图2 交联纤维素和修饰纤维素红外光谱图Fig.2 FTIR spectra of the cellulose before and after modificationa)交联纤维素;b)修饰纤维素2.1.2 X射线光电子能谱分析(XPS)交联纤维素及修饰纤维素表面C、O、N、Cl 4种元素所占比例如表1所示.由表1可见，由于在纤维素表面连接了亚氨基二乙酸(IDA)，修饰纤维素表面各元素的比例变化较大，尤其是N和O的比例提高很大.说明IDA成功地修饰到了纤维素表面，XPS结果和红外解析结果一致.表1 交联纤维素和修饰纤维素各元素比例比较Tab.1 Comparison of element proportions of the cellulose before and after modification元素交联纤维素/% 修饰纤维素/%75.32 70.67 O 23.79 28.02 N 0.59 1.21 C Cl 0.30 0.102.1.3 金属螯合量的测定分别称取2份同等质量的交联纤维素和修饰纤维素，加入同体积同浓度(0.05 mol/L)的金属离子溶液进行螯合反应，随后加EDTA解析，通过原子吸收分光光度法(AAS)测定螯合反应后的上清液和解析液中金属离子的浓度，发现交联纤维素未结合金属离子，而修饰纤维素螯合了金属离子 Cu、Zn、Fe、Ni，具体含量见表2.表2 不同金属离子螯合量Tab.2 Chelate quantity of different metal金属离子金属离子螯合量/(mmol·g－1)Cu 0.6790 Zn 0.8450 Fe 0.4583 Ni 0.4244由表2可知，修饰纤维素螯合Zn最高，Cu次之，而 Fe、Ni较少.2.2 BSA吸附行为的影响因素2.2.1 溶液 pH溶液pH对牛血清白蛋白吸附率的影响结果见图3.由图3 可见，在 pH 3.0～8.0，Cu(Ⅱ)螯合吸附剂的吸附率无显著变化;而Fe(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)螯合吸附剂的吸附率则变化很大.说明BSA在C u(Ⅱ)螯合吸附剂上的保留几乎不受酸度的影响，而在Fe(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)螯合吸附剂上的吸附受 pH 影响较大.图3 溶液pH对牛血清白蛋白吸附率的影响Fig.3 Effect of pH on BSA adsorption ratioa)cellulose-IDA-Zn(Ⅱ);b)cellulose-IDA-Fe(Ⅱ);c)cellulose-IDA-Ni(Ⅱ);d)cellulose-IDA-Cu(Ⅱ)吸附条件:吸附剂用量(m)=0.0200g，吸附温度(T)=298K，吸附时间(t)=10h，牛血清白蛋白初始浓度(ρ0)=0.4 mg/mL在 pH 5.0～8.0，BSA 在Fe(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)螯合吸附剂上吸附率很小，而在Cu(Ⅱ)螯合吸附剂上吸附率近20%.说明BSA在吸附剂上的保留是静电与配位协同作用的结果.静电作用的大小主要取决于金属螯合配体和蛋白质所带电荷，两者电荷差异越大，静电作用越强［8］.而金属螯合配体和蛋白质所带电荷与溶液pH有关，实验所用BSA 的 pI为4.7.因在 pH 5.0～8.0 时配位水分子的去质子化作用，金属螯合配体带负电荷，而BSA也带负电荷，静电排斥作用使BSA在除Cu螯合吸附剂(以配位作用为主)外的Fe、Zn、Ni螯合吸附剂上均不保留.2.2.2 BSA 初始浓度BSA的初始浓度与4种吸附剂吸附量的关系见图4.图4 牛血清白蛋白初始浓度对吸附容量的影响Fig.4 Effect of BSA initial concentration on the adsorption capacitya)cellulose-IDA-Zn(Ⅱ);b)cellulose-IDA-Fe(Ⅱ);c)cellulose-IDA-Ni(Ⅱ);d)cellulo se-IDA-Cu(Ⅱ)吸附条件:吸附剂用量(m)=0.0200g，吸附温度(T)=298K，吸附时间(t)=10h，pH=7.0、3.0由图4可见，随着BSA初始浓度的增加，4种吸附剂的吸附量逐渐增加，吸附饱和后吸附量基本不变.螯合了Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)亲和吸附剂的吸附容量较低，在BSA 初始浓度分别为0.8，1.0 mg/mL时，达到最大值71.03，69.01 mg/g;Fe(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)螯合吸附剂的吸附容量较高，在初始浓度分别为1.0，0.6 mg/mL 时，吸附容量分别达最大值99.38，121.3 mg/g.分别用Langmuir和Freundlich吸附模型模拟各吸附等温线，结果见图5，模拟参数见表3.由表3可知，Langmuir模型模拟Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)螯合亲和吸附剂吸附BSA的相关系数分别为0.9568，0.9998，0.9979，0.9973.算得4 种吸附剂对BSA最大理论吸附容量分别为61.94，121.58，99.34，70.32 mg/g，均和实验值 71.03，121.3，99.38，69.01mg/g 接近.比较 Langmuir 和Freundlich吸附模型的相关系数，可见4种吸附剂的吸附模式更符合Langmuir模型.说明吸附过程是以单分子层吸附为主，被吸附的分子在吸附剂表面没有转移，且被吸附的分子间的相互作用可忽略不计.图5 Langmuir和Freundlich等温线吸附模拟图Fig.5 Langmuir and Freundlich isotherms for BSA adsorptiona)cellulose-IDA-Ni(Ⅱ);b)cellulose-IDA-Cu(Ⅱ);c)cellulose-IDA-Fe(Ⅱ);d)ce llulose-IDA-Zn(Ⅱ)表3 吸附剂对牛血清白蛋白吸附等温线Langmuir和Freundlich模拟参数Tab.3 Langmuir and Freundlich parameters for the absorption of BSA on the adsorbent吸附剂Langmuir b/(L·mg－1)qm/(mg·g－1) R2 FreundlichKF/(mg·g－1)n/(L·mg－1) R2 cellulose-IDA-Cu(Ⅱ)0.0037 61.94 0.9568 4.36 2.490 0.9061 cellulose-IDA-Zn(Ⅱ) 0.1137 121.58 0.9998 52.95 7.751 0.6295 cellulose-IDA-Fe(Ⅱ) 0.0216 99.34 0.9979 40.06 7.692 0.9211 cellulose-IDA-Ni(Ⅱ)0.0231 70.32 0.9973 33.30 9.447 0.86712.2.3 介质中离子强度介质中离子强度对BSA吸附率的影响结果见图6.由图6可见，Cu(Ⅱ)螯合吸附剂，随着离子强度的增加，BSA的吸附率几乎没有变化，而Fe(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)螯合吸附剂，随着离子强度的增加，BSA的吸附率迅速降低.说明Cu(Ⅱ)螯合吸附剂吸附BSA基本不受离子强度的影响，以配位作用为主.而其他金属离子螯合吸附剂对蛋白质的吸附受离子强度影响较大，以静电作用为主.此外，Fe、Zn、Ni螯合吸附剂对BSA的吸附，在盐浓度增大到一定值后，吸附率会随着盐浓度的增大而升高，是由于盐浓度较高时，盐析作用提高了蛋白质的吸附率.图6 离子强度对吸附率的影响Fig.6 Effect of NaCl concentration on the adsorption ratioa)cellulose-IDA-Zn(Ⅱ);b)cellulose-IDA-Fe(Ⅱ);c)cellulose-IDA-Ni(Ⅱ);d)cellulose-IDA-Cu(Ⅱ)吸附条件:吸附剂用量(m)=0.0200g，吸附温度(T)=298K，牛血清白蛋白初始浓度(C0)=0.4 mg/mL，pH=7.0、3.0，吸附时间(t)=10h2.2.4 温度在15～35℃ 随着温度的升高，吸附率增大.这是因为溶液中分子热运动加剧，吸附量增加.当温度达到25℃后，吸附率变化不大，表明吸附可在较宽的温度范围内进行.2.3 BSA 的洗脱为选择适宜的洗脱液，在保证固定金属离子不严重流失的情况下，将吸附有BSA 的亲和吸附剂分别用NaCl、NaSCN进行洗脱.结果表明，金属Cu螯合亲和吸附剂吸附的蛋白质由于亲和力强，通过改变离子强度的方法进行洗脱几乎无效，加入竞争洗脱剂如NaSCN［9］后，其洗脱率可提高到75%.因为竞争洗脱剂可与金属离子竞争结合蛋白质表面配体如—NH2、—S或—COO－，降低配体与金属离子的结合能力.部分竞争洗脱剂(如EDTA)与固定金属离子间的配位作用较强，易造成固定金属离子泄露，故选用竞争洗脱剂的种类要适当.而对于弱结合力的Fe(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)［10］螯合亲和吸附剂吸附的BSA，则可通过改变离子强度(1 mol/L的NaCl或NaSCN)洗脱，洗脱效果几乎相同，进一步说明这些金属离子螯合亲和吸附剂对BSA的吸附主要是受到静电作用影响.3 结论(1)用玉米芯纤维素做基质，通过预处理、修饰等步骤研制成了亲和吸附剂，可用于吸附BSA，该法利用了农作物废弃物，成本低，制备和吸附操作简便.(2)固定金属离子的种类、溶液pH、离子强度等是影响BSA与金属螯合亲和吸附剂作用及吸附量的主要因素.(3)BSA与亲和吸附剂之间的作用力与固定金属离子的种类有关.对强亲和性的Cu(Ⅱ)螯合吸附剂，以配位作用为主，静电作用为辅;对于弱结合力的Fe(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)螯合吸附剂，静电作用为主，配位作用为辅.(4)可通过改变洗脱液pH、盐浓度或加入竞争洗脱剂吸附在亲和吸附剂上的BSA. 参考文献【相关文献】［1］Porath J，Carlsson J，Olsson I，et al.Metal chelate affinity chromatography，a new approach to protein fractionation［J］.Nature，1975，258(5536):598-599.［2］魏琪，姚汝华，鲍时翔.固定化金属螫合亲和膜色谱柱的制备及纯化铜锌超氧化物歧化酶的研究［J］.色谱，2000，28(4):353-361.［3］商振华，郭为，于亿年，等.化学改性纤维素亲和膜色谱用作人血清白蛋白中杂质的去除［J］.分析测试学报，1995，14(4):28-32.［4］魏琪，姚汝华.固定化金属螯合亲和膜纯化重组抗菌肽研究［J］.生物化学与生物物理进展，2000，27(4):401-403.［5］魏琪，姚汝华，鲍时翔.固定化金属螯合亲和膜色谱柱制备及纯化铜锌超氧化物歧化酶的研究［J］.色谱，2000，18(4):361-363.［6］吕晓霞，李海燕.不同预处理方法对玉米芯成分的影响［J］.林产化工通讯，2004，38(2):11-13.［7］Wu C Y，Suen S Y，Chen S C，et al.Analysis of protein adsorption on regenerated cellulose-based immobilized copper ion affinity membranes［J］.J Chromatogr A，2003，996(1/2):53-70.［8］Anspach F B.Silica-based metal chelate affinity sorbents I.Preparation and characterization of iminodiacetic acid affinity sorbents prepared via different immobilization techniques［J］.J Chromatogr，1994，672(1/2):35-49.［9］Odabasi M，Uzun L，Adil Denizli A.Porous magnetic chelator support for albumin adsorption by immobilized metal affinity separation［J］.J Appl Polym Sci，2004，93(5):2501-2510.［10］李蓉，陈国亮.金属螯合亲和色谱中固定金属与蛋白质的作用［J］.分析化学，2002，30(5):552-555.。

填空题1..根据吸附剂与吸附质之间存在的吸附力性质的不同，可将吸附分为物理吸附、化学吸附和交换吸附；2.比表面积和孔径是评价吸附剂性能的主要参数。

3。

层析操作必须具有固定相和流动相.4。

溶质的分配系数大，则在固定相上存在的几率大，随流动相的移动速度小。

5.层析柱的理论板数越多，则溶质的分离度越大。

6.两种溶质的分配系数相差越小，需要的越多的理论板数才能获得较大的分离度.7. 影响吸附的主要因素有吸附质的性质，温度，溶液pH值，盐的浓度和吸附物的浓度与吸附剂的用量；8. 离子交换树脂由网络骨架（载体），联结骨架上的功能基团（活性基）和可交换离子组成.9。

电泳用凝胶制备时，过硫酸铵的作用是引发剂（提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基）;甲叉双丙烯酰胺的作用是交联剂（丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链）；TEMED的作用是增速剂(催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合)；10。

影响盐析的因素有溶质种类，溶质浓度，pH 和温度；11。

在结晶操作中，工业上常用的起晶方法有自然起晶法，刺激起晶法和晶种起晶法；12。

简单地说离子交换过程实际上只有外部扩散、内部扩散和化学交换反应三步；13.在生物制品进行吸附或离子交换分离时,通常遵循Langmuir吸附方程,其形式为14.反相高效液相色谱的固定相是疏水性强的，而流动相是极性强的；15。

等电聚焦电泳法分离不同蛋白质的原理是依据其等电点的不同；16.离子交换分离操作中，常用的洗脱方法有静态洗脱和动态洗脱；17.晶体质量主要指晶体大小，形状和纯度三个方面；18.亲和吸附原理包括配基固定化，吸附样品和样品解析三步；19.根据分离机理的不同，色谱法可分为吸附、离交、亲和、凝胶过滤色谱20.蛋白质分离常用的色谱法有免疫亲和色谱法,疏水作用色谱法，金属螯合色谱法和共价作用色谱法;21。

SDS-PAGE电泳制胶时，加入十二烷基磺酸钠（SDS)的目的是消除各种待分离蛋白的分子形状和电荷差异，而将分子量作为分离的依据；加入二硫叔糖醇的目的是强还原剂,破坏半胱氨酸间的二硫键；22.影响亲和吸附的因素有配基浓度、空间位阻、配基与载体的结合位点、微环境和载体孔径;23。

镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书一、简介金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。

因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。

半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。

镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。

本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。

二、性能参数：特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便基质6%的交联琼脂糖凝胶配体 Ni2+配体密度20-40μmol /ml吸附载量15mg蛋白/ml介质颗粒大小45-165μm最大流速600cm/hpH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11保存温度+4-8℃保存液体20%乙醇三、适用范围分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。

四、应用实例实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4-8℃环境中保存。

蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二）一、层析技术1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。

如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。

然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。

注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。

2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。

这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。

用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。

注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。

该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。

将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。

洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。

要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。

3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。

构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。

然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。

然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。

亲和色谱洗脱步骤-概述说明以及解释1.引言1.1 概述亲和色谱是一种分离和纯化生物大分子的常用技术，它通过利用生物大分子与其配体之间的特异性相互作用来实现分离。

配体可以是一种蛋白质、抗体、寡核苷酸或其他具有亲和性的分子。

亲和色谱的洗脱步骤是整个分离过程中非常重要的一环。

洗脱步骤通常是在样品与亲和色谱介质之间相互作用的基础上进行的，旨在以一种控制的方式解离目标分子与亲和介质之间的相互作用，从而实现目标分子的高效纯化。

在洗脱步骤中，通常会使用适当的洗脱缓冲液来改变样品与亲和介质之间的物理、化学条件，从而打破它们之间的亲和作用。

这样一来，目标分子会从亲和介质上解离出来，进而被洗脱出来。

洗脱缓冲液的选择具有很大的灵活性，可以根据目标分子与亲和介质之间的相互作用类型进行优化。

常用的洗脱策略包括改变pH值、离子强度或离子种类、添加竞争性配体等。

通过这些手段调控洗脱缓冲液的条件，可以实现对目标分子的高效洗脱。

同时，洗脱步骤的优化也需要考虑目标分子的稳定性和纯化效率等因素。

总之，亲和色谱的洗脱步骤是亲和色谱技术中至关重要的一环。

它通过改变样品与亲和介质之间的相互作用条件，实现了目标分子的高效纯化。

洗脱策略的选择和优化对于获取高纯度的目标分子至关重要，因此需要充分考虑各种因素的影响并进行实验验证。

文章结构部分的内容可以包括以下几个方面：1.2 文章结构本文共分为三个部分：引言、正文和结论。

引言部分介绍了亲和色谱洗脱步骤的背景和意义，包括亲和色谱的定义和作用。

接着介绍了本文的目的，即详细讨论亲和色谱的洗脱步骤。

正文部分分为两个小节。

第一个小节是亲和色谱的原理，详细介绍了亲和色谱的基本原理和工作机制，包括亲和剂与目标分子的特异性结合、固定相和流动相的选择等内容。

第二个小节是亲和色谱的洗脱步骤，将详细讨论亲和色谱洗脱的各个步骤，包括样品的加载、洗脱剂的选择和优化、梯度洗脱的条件等。

结论部分对亲和色谱洗脱步骤进行总结，归纳了各个步骤的重要性和影响因素。

重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。

本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。

关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。

据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。

由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。

纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。

但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。

与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。

目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。

重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。

因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。

90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。

本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。

1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。

!"卷#期$%%%年&月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12’()*!"+(*#,-).!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$%%%金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究孙旭东李红旗隋洪艳沈忠耀（清华大学化工系北京!%%%1#）摘要金属螯合亲和层析是近$%年发展起来的一项新型分离技术。

它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

本文从单组分蛋白质入手，考查了23值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响，并进行了分析。

还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际体系的分离研究打下了基础。

关键词金属螯合亲和层析，牛血清白蛋白，血红蛋白，分离中图分类号41!5文献标识码6文章编号!%%%07%"!（$%%%）%#0%#/50%5金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（899(:;);<=>?=@A)8(B6C C;B;@.D E F(9A@(0 G F A2E.，简称8?6D），是近$%年发展起来的一项新型分离技术。

最早由H A F(@E等人［!，$］提出。

该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸、色氨酸、赖氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离［7］。

由于它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一［#］。

本文主要以单组分蛋白质牛血清白蛋白（I J6）和血红蛋白为研究对象，考查了23值、铵离子浓度及阴离子等不同洗脱条件对出峰时间的影响。

对不同的金属螯合柱的性能和不同单组分蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际生物产品的分离奠定了基础。

金属螯合亲和色谱中的疏水作用李　蓉31,2　陈国亮2　赵文明11(西安交通大学生命科学与技术学院,西安710049) 2(西北大学化工学院,西安710069)摘　要　通过考察盐溶盐和盐析盐浓度对蛋白质在I D A 裸柱和金属螯合柱上保留行为的影响,详细研究了金属螯合色谱中的疏水作用,疏水作用的发生、形成的条件以及不同条件下对蛋白质保留值的贡献。

实验结果表明,在高浓度和低浓度的盐溶盐以及低浓度盐析盐中,蛋白质在金属螯合柱上的保留主要受静电和配位作用控制,而疏水作用对蛋白质的保留影响很小。

对弱亲和性的金属螯合柱以静电作用为主,其大小可用参数Q 表征;对强亲和性的I D A 2Cu (Ⅱ)柱以配位作用为主。

仅在高浓度的盐析盐中,金属螯合柱才呈现较强的疏水作用,支配蛋白质保留。

实验证明,金属螯合色谱中疏水作用主要来自固定相间隔臂中的疏水碳链和盐析盐对蛋白质的增疏作用,利用这种疏水作用有可能改善金属螯合色谱分离的选择性。

关键词　金属螯合亲和色谱,疏水作用,蛋白质　2004210225收稿;2005201217接受本文系陕西省科委资助项目(No .96H09)1　引 言金属螯合色谱又称固定金属亲和色谱(I M AC ),1975年由Porath 等[1]首先提出,该法是基于蛋白质与固定金属离子的配位作用进行分离。

与其它亲和色谱法相比,金属螯合色谱具有较高通用性、柱容量、柱寿命;色谱柱的制备与再生比较容易;在不同色谱条件下柱子具有多种分离功能[2];多数情况下蛋白质通过柱子仍保持生物活性,并且容易放大和工业化。

由于上述特点,I M AC 技术成为蛋白质识别和分离纯化的重要工具[3]。

关于蛋白质在金属螯合色谱中的保留机理,蛋白质与固定金属间的相互作用以及影响这些作用的因素,相关文献已进行过讨论[4]。

这些作用力主要包括静电与配位作用,但很少涉及疏水作用。

蛋白质在金属螯合色谱中的疏水作用现象,虽然早已发现[5],然而疏水作用产生原因、形成的条件以及不同条件下对蛋白质保留的影响却未深入研究。

蛋白质脱附金属
蛋白质脱附金属是一个重要的生物化学过程，涉及到蛋白质与金属离子的结合和解离。

蛋白质可以通过不同的方式与金属离子结合，包括配位键、离子键和范德华力等。

蛋白质与金属的结合形式多种多样，例如金属离子可以与蛋白质的特定残基形成配位键。

这种结合对于蛋白质的结构和功能具有重要影响，例如在酶的活性中起到关键作用。

蛋白质脱附金属的过程可以通过不同的方法实现。

一种常见的方法是使用螯合剂，它们可以与金属离子形成更稳定的配合物，从而促使金属离子从蛋白质中解离。

另一种方法是改变溶液的条件，例如调节pH值或者添加竞争性配体来影响蛋白质与金属离子的结合状态。

此外，还可以利用某些生物学过程，如金属离子的还原或氧化来促使蛋白质与金属离子的解离。

蛋白质脱附金属在生物技术和生物医学领域具有重要意义。

例如，在蛋白质纯化过程中，需要将蛋白质与金属离子结合，然后再将其脱附以得到纯净的蛋白质样品。

此外，在生物体内，一些蛋白质需要与金属离子结合才能发挥其生物学功能，而另一些情况下则需要脱附金属离子以调节其活性。

总的来说，蛋白质脱附金属是一个复杂而重要的生物化学过程，涉及到蛋白质与金属离子的结合和解离，对于生物体的正常功能和
生物技术应用都具有重要意义。

金属螯合亲和层析技术及其应用摘要:固定化金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术,它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。

因此,其在蛋白质纯化、复性和空间定位以及酶的固定化和金属离子清除等方面具有广泛的应用。

关键词:固定化金属螯合亲和层析;纯化;应用固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一种亲和纯化技术,它是由Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分离纯化出数百种生物大分子。

该法是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化。

它因配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点而被广泛应用。

随着研究的进一步深入,IMAC的新应用也不断地被发现。

1金属螯合亲和层析作用原理固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。

过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合,金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点,在溶液中被水分子或阴离子占据。

当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时,氨基酸残基的供电原子将取代与金属离子结合的水分子或阴离子,与金属离子形成复合物,从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。

氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应,由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属配基的亲和力大小不同,从而可选择性地加以分离纯化[2]。

2金属螯合亲和层析技术的应用2.1金属螯合亲和层析用于生物分离纯化IMAC在生物分子纯化方面具有很多优点:(1)结合力强,蛋白结合容量大,可用于工业生产,如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附(EBA)技术可从哺乳动物细胞培养粗提物中一步分离纯化溶解性目标蛋白;(2)洗脱条件温和,再生后配体恢复完全,一种IMAC树脂可再生几百次而不改变其层析特性;(3)价格便宜;(4)可通过改装各种金属离子,引入目标蛋白质最适宜的金属离子进行不同蛋白质的纯化。

亲和色谱分离蛋白质原理
亲和色谱是一种利用生物分子之间的特异性相互作用来分离和纯化蛋白质的色谱技术。

它的基本原理是利用固定在色谱柱上的亲和配体与目标蛋白质之间的特异性亲和力，从而实现蛋白质的分离和纯化。

具体来说，亲和色谱分离蛋白质的原理包括以下几个步骤：
1. 固定亲和配体：选择一种与目标蛋白质具有特异性亲和力的配体，并将其固定在色谱柱上。

常用的固定方法包括共价键结合、离子交换、亲和吸附等。

2. 上样：将待分离的蛋白质混合物加载到色谱柱上。

3. 特异性结合：目标蛋白质与固定在色谱柱上的亲和配体发生特异性结合，形成复合物。

4. 洗涤：用适当的缓冲液冲洗色谱柱，以去除未结合的杂质和非特异性结合的蛋白质。

5. 洗脱：改变缓冲液的条件，如pH、离子强度等，使目标蛋白质与亲和配体之间的亲和力降低，从而将目标蛋白质从色谱柱上洗脱下来。

亲和色谱具有高选择性、高效率、高纯度等优点，在蛋白质分离和纯化中得到广泛应用。

它可以用于分离和纯化各种蛋白质，如酶、抗体、受体等。

同时，亲和色谱也可以与其他色谱技术结合使用，如
离子交换色谱、凝胶过滤色谱等，以进一步提高分离效果和纯度。

利用金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质金属离子亲和层析法是一种常用的蛋白质纯化方法，其中最为广泛应用的是使用含有氨基膦酸（Imidazole）配体的镍柱。

该方法可以通过蛋白质与镍离子之间的亲和作用，实现对His标记蛋白质的选择性分离。

本文将介绍如何使用金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质的步骤和操作要点。

1. 蛋白质表达与纯化前的准备工作在进行蛋白质表达前，需要将目标蛋白的编码序列克隆至适合的表达载体中，并转化至表达宿主菌。

通常选择大肠杆菌作为表达宿主，而His标记通常插入至目标蛋白的N末端或C末端。

表达宿主菌感染后，通过诱导表达基因，使目标蛋白在细胞内大量表达。

2. 细胞收获与细胞破碎待表达菌株达到适当的浓度后，进行细胞收获。

采用离心等方式将菌株分离并收集。

随后，通过细胞破碎等方式将汇集到的细胞进行裂解，使蛋白质释放至裂解液中。

3. 镍柱填充与样品加载将合适尺寸和柱床材料的镍柱进行填充，将其与柱盒连接。

连接后，用洗涤缓冲液平衡镍柱，去除杂质和剩余离子。

之后，将裂解液进行预处理，去除细胞碎片和不溶性物质，得到清晰的样品液。

4. His标记蛋白质的特异性结合与洗脱将样品液缓慢地加载至预处理后的镍柱上，使蛋白质与镍离子发生特异性结合。

待样品通过后，用足够的洗脱缓冲液进行洗脱。

洗脱过程中，可逐渐增加洗脱缓冲液中的Imidazole浓度，以促进His标记蛋白质的洗脱。

5. 蛋白质纯化与储存经过上述步骤，可得到高纯度的His标记蛋白质。

使用蛋白质分析方法，如SDS-PAGE和Western blot等，对纯化后的样品进行验证。

验证合格后，可将蛋白质进行长期储存，或进一步进行后续的实验和研究。

通过金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质的过程相对简单，但操作要点仍需注意。

在实验中，需注意离心、洗涤和洗脱步骤的温度、时间和缓冲液浓度等参数的控制。

此外，为提高纯化效果，可通过调整裂解液pH值、添加适量的盐类以及优化洗脱条件等方法进行优化。

MBP洗脱的原理MBP洗脱是一种常用的蛋白质纯化方法，它基于蛋白质与金属离子的亲合性，通过金属离子与蛋白质特定位点的结合来实现蛋白质的选择性纯化。

本文将详细解释MBP洗脱的原理，包括金属亲和层析、蛋白质与金属离子的结合机制、洗脱条件的选择等内容。

1. 金属亲和层析金属亲和层析是利用金属离子与蛋白质之间的特异性结合来实现蛋白质的纯化。

常用的金属离子包括镍（Ni2+）、铜（Cu2+）、锌（Zn2+）等。

在金属亲和层析中，通常将金属离子固定在亲和基质上，形成金属螯合层析树脂。

2. 蛋白质与金属离子的结合机制蛋白质与金属离子的结合是通过蛋白质的亲和位点与金属离子之间的配位作用实现的。

蛋白质通常具有亲和位点，如组氨酸、半胱氨酸、组氨酸和半胱氨酸等。

金属离子与亲和位点之间的结合是可逆的，可以通过改变洗脱条件来实现蛋白质的洗脱。

金属离子与蛋白质的结合通常是通过配体交换或配体结合来实现的。

在配体交换中，金属离子与蛋白质结合的配体被洗脱缓冲液中的其他配体所取代。

在配体结合中，金属离子与蛋白质结合的配体被洗脱缓冲液中的其他化合物所取代。

3. MBP洗脱的步骤MBP洗脱通常包括以下几个步骤：细胞破碎、裂解液制备、亲和层析、洗脱和纯化。

3.1 细胞破碎首先需要将目标蛋白质表达的细胞进行破碎，以释放细胞内的蛋白质。

细胞破碎的方法可以选择化学方法（如溶菌酶处理）、物理方法（如超声波处理）或机械方法（如高压破碎）等。

3.2 裂解液制备细胞破碎后，需要制备裂解液，以使目标蛋白质在裂解液中保持稳定。

裂解液通常包含缓冲剂、蛋白质稳定剂和金属络合剂等。

缓冲剂用于维持溶液的pH值，蛋白质稳定剂用于保护蛋白质的结构，金属络合剂用于与金属离子形成络合物，以增强蛋白质与金属离子的结合。

3.3 亲和层析制备好裂解液后，将裂解液与金属螯合层析树脂进行接触，使蛋白质与金属离子结合。

金属螯合层析树脂可以通过柱层析或批量层析的方式进行操作。

在柱层析中，将裂解液加入层析柱，使蛋白质与金属离子结合，非目标蛋白质被洗脱。

实验十一金属螯合亲和层析分离蛋白质【实验目的】1．学习亲和层析的原理。

2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。

【实验原理】亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。

蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。

已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。

过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。

金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。

本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv,该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。

【试剂与器材】〈一〉试剂1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL2. 2mol/L NaCL 溶液50mL3. 1mol/L NaOH溶液50mL4. 0.2mol/L NiSO4溶液50mL5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL6. Ni2＋Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品20—50ml8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.09. 洗脱液：300mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.010 20%乙醇溶液50ml〈二〉器材1. 1.5cm X 50cm层析柱2. 蠕动泵3. 紫外检测仪4. 自动收集器5. 伍豪色谱工作站【操作方法】1. 样品的制备细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。