第十章亲和色谱
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分析化学第十章_亲和色谱
分析化学第十章_亲和色谱亲和色谱(affinity chromatography)是一种利用生物分子之间的特异性相互作用来分离和纯化目标分子的分析方法。
它是一种分子识别性较强的分离技术，广泛应用于生物医药领域。
亲和色谱的基本原理是利用配体（ligand）与目标分子之间的特异性结合，实现目标分子的选择性吸附和洗脱。
配体可以是抗体、酶、受体、亲和剂等，通过共价或非共价的化学方法与固定在色谱填料上，形成亲和色谱填料。
目标分子与配体之间根据亲和性或特异性结合，而非目标分子则快速洗脱。
亲和色谱的步骤包括样品加载、洗脱条件优化和目标分子收集。
首先将样品加载到亲和色谱柱中，目标分子与亲和填料的配体结合。
随后，通过改变洗脱液的条件，如pH、温度、离子强度等，以破坏目标分子和配体之间的结合，实现目标分子的洗脱。
最后，收集目标分子的洗脱液，得到纯化目标分子的样品。
亲和色谱具有高选择性、高灵敏度、易操作等优点，适用于分离和纯化复杂混合物中的目标分子。
它被广泛应用于蛋白质、核酸、糖类等生物大分子的纯化和分析。
亲和色谱的应用领域包括药物研发、生命科学研究、生物工程等。
例如，在药物研发中，可以利用亲和色谱分离和纯化药物靶标蛋白，以研究药物的作用机制。
在生命科学研究中，亲和色谱可以用于蛋白质相互作用的研究，如蛋白质结构和功能的研究。
在生物工程中，亲和色谱可以实现重组蛋白的纯化和分析。
亲和色谱还可以与其他色谱技术相结合，形成多维色谱系统，提高分离的选择性和分辨率。
例如，结合亲和色谱与离子交换色谱，可以实现对混合物中多种目标分子的同时纯化和分析。
近年来，亲和色谱技术不断发展，涌现出更多新的亲和填料和新的亲和配体。
例如，金属亲和色谱、核酸亲和色谱、抗体亲和色谱等，拓宽了亲和色谱的应用范围。
此外，与质谱、光谱等分析技术相结合，可以进一步提高亲和色谱的灵敏度和分析能力。
综上所述，亲和色谱是一种利用生物分子间特异性相互作用的分离纯化方法，具有高选择性和灵敏度，广泛应用于生物医药领域。
分析化学 第十章_亲和色谱
配基的选择
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分 为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等 生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、 酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的 特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的 特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异 性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的 生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实 验。
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的 蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine） 可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋 白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异 性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分 辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容 量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了 广泛的应用。
常见亲合作用体系
特异性 高特异性 亲和体系 抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
（2）抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析 （Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有 高度特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。 因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫 亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。
亲和色谱
聚丙烯酰胺-琼脂糖 多孔玻璃
1,6-己二胺, 6-氨基己酸 氨基丙基, 氨基己基
第四节 亲和吸附剂的制备
一、要求 ㈠. ㈡. 结 L与基质结合，对L-S结合无干扰； L为小分子有的需“手臂”，使L-S
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件
亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活
㈡常用系统
酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物 核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物 激素: 受体、运载蛋白 抗体: 抗原、病毒、细胞 外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞
亲和层析常用配体
连接臂先偶联至载体后接配体
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备 Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-Sep Sep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep 碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
第三节 亲和层析载体
一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好
二、载体的选择
1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污 剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力 比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
4.3
亲和色谱(层析)
Affinity Chromatography, AC 第一节 概述
亲和色谱
亲和作用
亲和作用：生物分 特异性
亲和体系
子能够区分结构和 性质非常接近的其
高特异性
抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白
他分子，选择性地
酶－底物、产物、抑制剂
与其中某一种分子
相结合，生物分子
群特异性
免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶
间的这种特异性相
凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面
分类
名称
作用原理
应用
免疫亲和色谱
抗原与抗体专一性识别
抗原或抗体
固定化金属亲和色谱 锌、镍离子与蛋白表面组氨酸特异性识别 含有组氨酸的蛋白
染料亲和色谱
染料与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
核苷酸亲和色谱
核苷酸与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
凝集素亲和色谱
凝集素与糖之间转移性可逆结合
糖蛋白
蛋白亲和色谱
对 类似的抗体的转移性
免疫蛋白等
操作流程
❖ 找与底物专一可逆结合 的配基；
❖ 将配基通过共价键偶联 到基质；
❖ 配基与底物吸附； ❖ 洗脱目标物。
例子
免疫亲和色谱
❖ 抗原和抗体的作用具有高度的专一性, 并且它 们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将 抗原或抗体结合到吸附剂上, 便可有效地分离 和纯化免疫物质。
条件； 3、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品
中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。
影响因素
❖ 上样体积---若目标产物与配基的结合作用较强，上 样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力 较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱 载量的5%~10%。
亲和色谱精讲PPT课件
一、要求
㈠. L与基质结合，对L-S结合无干扰； ㈡. L为小分子有的需“手臂”，使LS结
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
.
24
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
3. 需了解L-S的作用机制
如……
.
12
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单A E
EA
P E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
.
13
双底物依次
AB E
EA EAB
PQ E
EPQ EQ
须选择A、若选B则吸附时须加A
.
14
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P）
E
E
EA EA（B） EPQ
.
37
其他方法
羰基二咪唑（CDI）法 高碘酸盐法 磺化氟甲基吡啶鎓法 N-羟基琥珀酰亚胺法
.
38
其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
连接臂的连接
连接臂先接配体后偶联至载体 连接臂先偶联至载体后接配体
.
30
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备
Sep-(CH2)6-NH2 Sep
L-COOH AH-
Sep-(CH2)6-COOH L-NH2
CH-Sep
碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
《亲和色谱》课件
生物工程技术
利用生物工程技术改造蛋白质 或酶，提高亲和色谱的特异性
。
光学检测技术
结合光学检测技术，实现高灵 敏度、高分辨率的亲和色谱分
析。
亲和色谱在各领域的应用前景
生物医药领域
用于蛋白质、细胞、病毒等生物分子 的分离和纯化，为药物研发和疾病诊 断提供支持。
环境监测领域
用于水体、土壤、空气等环境样品中 污染物的分离和检测，为环境治理和 保护提供依据。
农药残留检测
亲和色谱可用于农药残留的检测，通过与农药分 子的特异性结合，实现对农药残留的高灵敏度检 测。
食品营养成分分析
亲和色谱可用于食品营养成分的分析，如维生素 、矿物质等，通过与特定配基的结合，实现对营 养成分的高效分离和检测。
亲和色谱在环境监测领域的应用案例
有毒有害物质检测
亲和色谱可用于有毒有害物质的检测，如重金属、有机污染物等， 通过与特定配基的结合，实现对有毒有害物质的高灵敏度检测。
食品安全领域
用于食品中农药残留、添加剂、毒素 等有害物质的检测和分离，保障食品 安全。
农业领域
用于植物生长调节物质、农药残留等 的分离和检测，促进农业可持续发展 。
亲和色谱的发展趋势和未来展望
智能化发展
通过自动化、智能化技术，提高亲和色谱的 分离效率和准确性。
高通量、高分辨率
开发高通量、高分辨率的亲和色谱技术，满 足大规模样品分析的需求。
稳定性差
亲和色谱的配体和载体在某些条件下可能不稳定，影 响实验结果。
适用范围有限
亲和色谱的适用范围相对较窄，仅适用于具有特异性 相互作用的目标分子。
亲和色谱的改进方向
开发通用型配体
通过研究不同类型分子间的相互作用，开发 出适用于多种目标分子的通用型配体，降低 实验成本。
亲和色谱法的原理及应用
亲和色谱法的原理及应用一、亲和色谱法的原理亲和色谱法是一种利用生物大分子间的特异性相互作用进行分离和纯化的方法。
其原理是通过靶分子与固相上的配体之间产生亲和结合来实现分离。
亲和色谱法利用了配体与靶分子之间的特异性相互作用，如抗原与抗体的结合、酶与底物的结合等，从而实现对目标分子的选择性捕获。
其分离和纯化效果优于传统的分离方法，成为现代生物科学研究中不可或缺的技术手段。
二、亲和色谱法的应用亲和色谱法在生物学和药物研发等领域中有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用案例：1.抗体纯化：亲和色谱法广泛应用于抗体的纯化工艺中。
通过将抗体的抗原特异性与配体结合，可以实现对抗体的高效选择性纯化。
2.蛋白质纯化：亲和色谱法在蛋白质纯化中起到了重要的作用。
通过将某一特定结合配体固定在色谱柱上，可以实现对目标蛋白质的选择性捕获。
3.酶底物亲和纯化：亲和色谱法可利用酶与底物之间的亲和结合进行酶的纯化。
通过将底物或类似物固定到色谱柱上，可实现对酶的选择性捕获。
4.核酸纯化：亲和色谱法可应用于核酸的纯化过程。
通过将亲和配体固定在色谱柱上，可以实现对目标核酸的高效分离。
5.生物药物开发：亲和色谱法在生物药物的开发过程中起到关键作用。
通过分离和纯化目标蛋白质，可以获得高纯度的生物药物。
三、亲和色谱法的优势和局限性使用亲和色谱法进行分离和纯化具有以下优势：•高选择性：亲和色谱法可以实现对目标分子的高度选择性捕获，减少了其他杂质的干扰。
•高纯度：亲和色谱法可以获得高纯度的目标分子，满足进一步研究和应用的需要。
•原位纯化：亲和色谱法能够在原位进行纯化操作，避免了传统离心、沉淀等分离步骤。
然而，亲和色谱法也存在一些局限性：•配体选择性：亲和色谱法的成功与否，取决于配体与靶分子之间的相互作用是否特异、强烈，因此选择合适的配体是亲和色谱法的关键。
•杂质的干扰：亲和色谱法在分离和纯化过程中，有时可能会受到杂质的干扰，导致目标分子的选择性捕获不够理想。
亲和色谱名词解释
亲和色谱名词解释
亲和色谱（Affinity chromatography）是一种基于生物分子之间特异性相互作用的层析技术，用于分离和纯化特定的生物大分子，如蛋白质、核酸、糖等。
亲和色谱依赖于亲和剂（affinity ligand）与目标分子之间的特异性相互作用。
亲和剂通常是一种高度特异性结合到目标分子的物质，可以是抗体、酶、亲和标靶蛋白等。
这种特异性相互作用可以是通过离子交换、亲水性、金属离子的配位、疏水性等作用机制实现的。
亲和色谱的原理是将亲和剂固定在固定相上，并将混合物溶液通过柱床进行层析分离。
由于亲和剂与目标分子之间的特异性相互作用，目标分子可以选择性地结合到亲和剂上，而其他非目标分子则通过柱床被洗脱。
最后，目标分子可以通过改变缓冲条件、温度或添加特定的竞争性配体等方式进行洗脱。
亲和色谱具有选择性高、纯度好、操作简单等优点。
它广泛应用于生物医学研究、药物开发、生物制药等领域，特别适用于从复杂的混合物中高效分离纯化目标分子。
亲和色谱原理和方法
亲和色谱原理和方法
亲和色谱法
相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。
例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物，用来作为层析用固定相，将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获，达到纯化的目的。
可用于分离活体高分子物质、过滤性病毒及细胞。
或用于对特异的相互作用进行研究。
亲和色谱
亲ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ层析原理图
影响亲和色谱的因素
• 1、上样体积 若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积 对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度 要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。 • 2、柱长 亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果 亲和介质的载量(同上 求解释T ^T)高，与目标产物(目标物)的 作用力强，可以选择较短的珠子(柱子);相反，则应该增加柱 子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。 • 3、流速 亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡 需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢， 保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间 结合力弱和样品浓度过高时。 • 4、温度 温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附 能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一 般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在 上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲 和力，充分地结合;而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离 物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。 例如，一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行解
亲和色谱法
生物工程领域 2016-6-13
生物亲和作用
• 定义：生物物质，特别是酶和抗体等蛋白 质，具有识别特定物质并与之相结合的能 力。这种识别并结合的能力具有排他性， 即生物分子能够区分结构和性质非常相近 的其他分子，选择性地与其中一种分子相 结合。这种特异性的相互作用称为生物亲 和作用（bioaffinity）或简称亲和作用 (affinity)。
例：抗原抗体的特异性结合
电镜图片
抗原抗体结合示意图
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5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相
互作用减弱
6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失
利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作 用进行分离的技术为亲和分离技术
亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的
相互作用的物质
常见亲合作用体系
特异性 高特异性 亲和体系 抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要
因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤
其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到
合适的特异性配体通常需要大量的实验。
通用性配体
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某
一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种
凝集素（ lectine ）可以结合各种糖蛋白，核酸可
5、价格相对较昂贵； 6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并
进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料
等配基。
亲和色谱介质的制备
基质的选择
理想的基质应符合下面的要求：
1．极低的非特异性吸附
2．高度的亲水性 3．较好的理化稳定性
4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合 5．适当的多孔性 一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰 胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多 孔玻璃珠等。
生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分
子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分
子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。
生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、 激素-受体等亲和作用。
具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁 孔” 的空间结构关系。 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： 静电作用 氢键 疏水相互作用 配位键 弱共价键
加配基浓度有利于吸附。 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
32
配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
腺嘌呤 N6- 氨基接到载体上，
对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。
磷酸基接到载体上，对甘油醛
利用色素为配基的亲和色谱法一般称作色素亲和
色谱(dye ligand affnity chromatography)。
除脱氢酶和激酶外,三嗪类色素还与很多蛋白质具 有结合能力,如血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶
菌酶和糖解酶等,用途非常广泛。
色素与这些蛋白质结合的作用机理很复杂,有些是 疏水性相互作用,有些则是疏水性吸附和静电吸附 共同作用的结果。
第十章
亲和色谱
生物分离过程的一般流程
原料液 细胞分离(离心，过滤) 细胞－胞内产物 路线一 路线一A 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 纯化(层析、电泳) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤) 精制(结晶、干燥)
路线二
清液－胞外产物
路线一B
包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 复性
细胞破碎 碎片分离
一、概述
影响亲和作用的因素
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用
减弱或完成破坏。 2、pH：在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其 它pH下，亲和作用减弱或完成破坏。 3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱 亲和作用
4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱； 但是，疏水性相互作用增强
11
配基
生物特异性配基 拟生物亲和配基
亲和配基必须具备的条件： 1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的 2、结合常数要适当 3、稳定性好，可进行化学改性
专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度 相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度
亲和配基的分类
单专一性的小分子配基 基团专一性的小分子亲和配基
亲和洗脱
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。 特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和 结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标 产物的竞争性结合，洗脱目标产物。 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、 离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。
亲和色谱
亲和层析(Affinity Chromatography ，AC)是利用 生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部 位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不
受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态
上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子 化合物。
（2）抗体
利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层 析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与 抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一 般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法， 特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯
这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外， 磷 酸 腺 苷 （ adenosine 5’-monophosphate ，
AMP ） 、 二 磷 酸 腺 苷 （ adenosine2’,5’diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结 构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用， 可用做这些酶的亲和配基。
逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，
也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。
是亲和分离技术中最具优势的方法
混合蛋白样 品
平衡 液
含配体溶液
带有配体的树 脂珠（或胶粒）
洗下未结合的 蛋白
收集目的蛋 白
亲和作用体系
将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联， 可特异性结合另一种分子（目标产物），使其从
混合物中高选择性地分离纯化。
一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基 （ligand），用L表示。
Kd解离常数 Keq结合常数
[E]、[L]和[E· L]分别表示蛋白质、配基和其复合
体的平衡浓度。
结合常数Keq越大，或解离常数Kd越小，表示亲
和结合作用越强。Keq一般为104～108 L/mue 3GA(又称Reactive Blue 2) 最常用的活性色素
（7）过渡金属离子
Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、 S和O等供电原子（electron donor atom）产生配 位键，因此，可与蛋白质表面的组氨酸(His)的咪 唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp） 的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基 的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合 强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+ 。
专一性的大分子亲和配基
免疫亲和配基
基团专一性的大分子亲和配基
亲和配基的选择
组合化学肽库选择亲和配基 目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序 列 噬菌体展示技术 目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克 隆群体→氨基酸序列 SELEX技术 随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选
亚胺二乙酸（IDA）
（8）组氨酸
在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有 弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋 白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机 理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白 质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏 水性相互作用均有可能参与亲和结合。
（6）色素配基
三嗪类色素 (triazine dyes) 是一类分子内含有三
嗪环的合成活性染料,与各种需要在NAD的存在下 表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用。
这类色素与NAD的结合部位相同,具有抑制酶活性 的 作 用 , 因 此 又 称 为 生 物 模 拟 色 素 (biomimetic dye)。
蛋白A不与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而 且任何抗体的 Fc片断的结构都非常相似，因此蛋
白 A 可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的
结合常数有所不同。
（4）凝集素
凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶
和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，
含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖 结合的特异性不同。
过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（ IDA ）或三 羧甲基乙二胺（ TED ）形成螯合金属盐固定在固 定相粒子表面，用作亲和吸附蛋白质的配基。
这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为金
属螯合亲和色谱 (metal chelate affinity chromatography) 或 固 定 化 金 属 离 子 亲 和 色 谱 (immobilized metal affinity chromatography, IMAC)。
化蛋白质类生物大分子的有效手段。
（3）蛋白A
蛋白A（protein A）为分子量约42KD的蛋白质， 存在于黄色葡萄球菌的细胞壁中，占该细胞壁构
成成分约 5 ％。蛋白 A在确定其为蛋白质之前称 A
抗原，与动物免疫球蛋白 G(immunogloblin G ， IgG) 具有很强的亲和结合作用，结合部位 IgG 分 子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分）。