纯泰镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)使用说明书(完全版)[1]

镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书一、简介金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。

因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。

半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。

镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。

本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。

二、性能参数：特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便基质6%的交联琼脂糖凝胶配体 Ni2+配体密度20-40μmol /ml吸附载量15mg蛋白/ml介质颗粒大小45-165μm最大流速600cm/hpH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11保存温度+4-8℃保存液体20%乙醇三、适用范围分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。

四、应用实例实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4-8℃环境中保存。

Ni Seplife FF（NTA）说明书1.产品介绍Ni Seplife FF（NTA）是蓝晓科技自主研发的一种新型亲和层析介质，是将氨基三乙酸基键合在高流速琼脂糖凝胶过滤层析介质上，再螯合金属离子Ni2+形成的一种亲和层析介质，其利用样品组分中的组氨酸与金属离子的亲和吸附进行分离纯化。

镍螯合高流速琼脂糖层析介质（NTA）特异性好，流速快，螯合金属离子更稳定不易脱落，能耐受更高的还原剂，物理和化学性能稳定，批次重复性好，颗粒粒度均匀，分离效果好。

可用于分离纯化能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及带His 标签的重组蛋白。

2.性能介绍产品牌号Ni Seplife FF（NTA）外观球状凝胶，无臭无味基质Seplife 6FF形状球形最高流速（cm/h）≧370耐压（MPa）0.3粒径（μm）45～165离子结合量（Ni2+ umol/ml）：~20pH稳定性3~13（长期）；2~14（短期，在位清洗[CIP]）在常用水相溶液中稳定：0.1M氢氧化钠；0.01M盐酸；8M尿素，70%化学稳定性醋酸，30%异丙醇应用适用His 标签的重组蛋白纯化3.使用方法3.1 装柱装柱按照标准操作规程操作。

必须保证每种材料都处于工作温度，凝胶装柱前需要脱气。

3.2平衡用2~5个柱床体积的初始缓冲溶液进行平衡，直至电导率、pH值等参数不变。

3.3上样（1）样品一般溶解于pH6～8的初始缓冲液中，提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。

（2）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，同时最好避免巯基乙醇、DTT等还原剂。

（3）常用缓冲液有10～100mmol/L磷酸钠缓冲液、20～200mmol/LTris-HCl缓冲液等。

（4）缓冲液中一般要加入0.15～0.5mol/L的NaCl以消除离子交换作用。

（5）初次使用镍螯合琼脂糖凝胶时，推荐使用50mmol/L PBS（50 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4）作为初始缓冲液。

固定金属离子亲和柱主要用于金属螯化离子。

位于许多蛋白中的组氨酸残基将会和许多金属离子，例如锌。

铜，镍，铁等形成复合物。

因此，该柱料能选择性螯合一些具有组氨酸残基的蛋白质。

但是半胱氨酸和咯氨酸残基也能和固定化金属螯和。

但是亲和力比组氨酸要弱。

所以，结合的强度是和缓冲液的PH和金属离子决定的。

金属螯和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料，借助醚长生7个原子的空间。

全部容量：24-30um的含有zn的干胶柱料结构：6%的高铰链的琼脂糖柱料大小：45-165um平均微粒：90um直流速度：25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小时可达700厘米最大压强：0.3MPaPH变化：长期3-13短期2-14化学稳定：通用含水缓冲液0.01M盐酸，1.0M NAOH, 20%乙醇（保存7天）物理性质：可以忽略在PH或者离子变化下的体积变化耐热性能：121度下0.1M乙酸钠作用半小时金属螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇。

所以要搅拌驱除20%乙醇溶液。

换成去离子水。

比例是25%去离子水和75%处理胶。

处理金属螯和柱料：1 平衡所有用到的材料于室温。

2 搅拌金属螯和柱料3 倒水进柱子，驱除气体。

用无离子水液封几厘米。

4 将金属螯和柱料连续倒进柱子，用玻璃棒支撑柱壁防止气泡形成。

5 然后立即用无离子水液封，装上柱盖，连接上泵。

6 打开柱子底部的开关，然后调节泵的流速。

通常是不超过0.3MPa的。

7 经过一个稳定的柱床填鸭后，维持填压速度为3个柱床。

使用adaptor1 经过上溯填鸭后，关闭柱床下面开关，移开上面的薄膜，小心的加上去离子水进行液封。

2 一定角度插入adaptor，确保没有气泡。

3 确保所有的连接都没有问题，柱子/泵/样品接受器4 倾斜插入活塞确保没有气泡和管道充满液体。

利用活泵正反向的流动确保没有气泡。

5 固定adaptor，打开柱子开关，开始缓冲液的流动。

先以填鸭的速度直到柱床稳定后。

镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书1简介金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。

因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。

半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。

镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。

本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。

2性能参数：3适用范围分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。

4应用实例实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存。

缓冲液组成：缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。

配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g, 加适量水溶解后定容到1000ml。

千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质是一种用于蛋白质纯化的重要工具，在生物技术领域广泛应用。

本文将从其原理、特点、应用以及未来发展方向等方面进行介绍和分析。

一、原理千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质的原理主要是利用镍离子与蛋白质中的组氨酸残基结合的特性，实现对蛋白质的选择性结合和分离。

在琼脂糖基质的支持下，镍nta螯合亲和层析介质可以与目标蛋白质发生专一性结合，并通过洗脱等步骤实现对蛋白质的分离纯化。

二、特点1.高选择性：镍nta螯合亲和层析介质具有较高选择性，能够与蛋白质中的组氨酸残基结合，实现对目标蛋白质的有效分离。

2.良好的生物相容性：介质材料琼脂糖在生物体内具有良好的生物相容性，不会对生物体产生毒副作用。

3.稳定性：介质具有良好的稳定性，可以承受一定的流速和压力，适合于在不同操作条件下进行蛋白质的层析纯化。

三、应用千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质在生物制药、基因工程、生物化学等领域有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1.蛋白质纯化：通过千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质可以实现对蛋白质的高效分离和纯化，为后续的生物学研究和药物开发提供优质的蛋白质样品。

2.蛋白质结构分析：可用于蛋白质的结构研究和功能分析，为了解蛋白质的结构和功能提供有效手段。

3.抗体制备：可用于从复杂混合物中纯化目标抗体，为抗体制备提供技术支持。

四、未来发展方向千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，其未来发展方向主要有以下几个方面：1.多功能化：将其与其他螯合亲和剂结合，开发出具有多功能性能的层析介质，实现对不同类型蛋白质的快速纯化。

2.自动化：结合自动化技术，实现对层析过程的自动控制，提高工作效率和操作便捷性。

3.高通量：发展高通量的层析介质，满足大规模蛋白质纯化的需求。

千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，在生物技术领域具有重要的应用价值，并且其具有良好的发展前景。

金属螯合亲和层析技术及其应用摘要:固定化金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术,它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。

因此,其在蛋白质纯化、复性和空间定位以及酶的固定化和金属离子清除等方面具有广泛的应用。

关键词:固定化金属螯合亲和层析;纯化;应用固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一种亲和纯化技术,它是由Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分离纯化出数百种生物大分子。

该法是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化。

它因配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点而被广泛应用。

随着研究的进一步深入,IMAC的新应用也不断地被发现。

1金属螯合亲和层析作用原理固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。

过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合,金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点,在溶液中被水分子或阴离子占据。

当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时,氨基酸残基的供电原子将取代与金属离子结合的水分子或阴离子,与金属离子形成复合物,从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。

氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应,由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属配基的亲和力大小不同,从而可选择性地加以分离纯化[2]。

2金属螯合亲和层析技术的应用2.1金属螯合亲和层析用于生物分离纯化IMAC在生物分子纯化方面具有很多优点:(1)结合力强,蛋白结合容量大,可用于工业生产,如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附(EBA)技术可从哺乳动物细胞培养粗提物中一步分离纯化溶解性目标蛋白;(2)洗脱条件温和,再生后配体恢复完全,一种IMAC树脂可再生几百次而不改变其层析特性;(3)价格便宜;(4)可通过改装各种金属离子,引入目标蛋白质最适宜的金属离子进行不同蛋白质的纯化。

镍离子亲和层析型号
镍离子亲和层析是一种常用的蛋白质纯化方法，其原理是利用镍离子与受体蛋白质的亲和作用，在一定条件下将目标蛋白从混合物中分离出来。

在实际应用中，需要选择适合的镍离子亲和层析型号，以达到理想的分离效果。

目前市面上常见的镍离子亲和层析型号有以下几种：
1. Ni-NTA亲和层析树脂：该型号树脂基于四乙酰亚胺改性的胶珠，具有较高的亲和力和选择性，适用于各种规模的蛋白质纯化。

2. HisPur Ni-NTA树脂：该型号树脂是基于高密度Ni-NTA柔性支撑材料制备的，具有更好的蛋白质结合能力和更短的纯化时间。

3. TALON超级亲和层析树脂：该型号树脂是基于硫氰酸异丙酯改性的胶珠，具有非常高的蛋白质结合能力和极好的选择性。

4. Ni Sepharose 6 Fast Flow树脂：该型号树脂是基于Sepharose 6 Fast Flow胶珠改性的，具有较高的亲和力和选择性，适用于中小规模的蛋白纯化。

以上是常见的几种镍离子亲和层析型号，选择适合的型号可以提高蛋白质纯化的效率和纯度，为后续的实验提供更好的样品。

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Ni NTA Beads目录1. 产品介绍....................................................................................1 2. 纯化流程....................................................................................2 3. 在位清洗....................................................................................4 4. 填料再生....................................................................................5 5. 问题及解决方案.........................................................................5 6. 订购信息及相关产品 (6)1. 产品介绍Ni NTA Beads 是以4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸（NTA ），螯合镍离子（Ni 2+）后，可以形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构很有效的保护了镍离子免受小分子的进攻（产品结构见图1所示，三种产品结构的区别），更加稳定，具体性能见表1。

Ni NTA Beads 可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件（见表2），适用性更广，配体更稳定，选择性更高。

图1. Ni IDA Beads ，Ni NTA Beads 和Ni NTA Beads 6FF 化学结构示意图Ni 2+H 2O2+H 2O H 2O2OH 2ONi IDA BeadsNi NTA BeadsNi NTA Beads FFBeads 或者Beads FF表2. 纯化流程2.1 缓冲液的准备可使用下列推荐缓冲液，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原理就是低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。

ni离子金属螯合亲和层析嘿，大家好，今天咱们来聊聊一个听起来有点儿高大上的话题——镍离子金属螯合亲和层析。

乍一听，这个名字可能让人觉得一头雾水。

别担心，今天我就像个闲聊的朋友，把这个话题聊得轻松有趣，让你听了之后感觉“哦，原来如此”！想象一下，你在厨房里，准备做一顿丰盛的晚餐。

你有一堆食材，有肉、有菜，还有各种调料，但你得把这些材料好好搭配才能做出美味的菜肴。

科学也差不多，镍离子金属螯合亲和层析就像是科学界的“大厨”，它帮助我们从一堆复杂的东西中筛选出我们想要的那一部分。

想要的？那就是一些特定的分子，咱们的“主料”！让我们了解一下“镍离子”这个小家伙。

镍，它是一种金属，大家可能在硬币或者电池中见过。

镍离子就像一个小小的“演员”，在层析过程中，它扮演着重要角色。

就好比在一场聚会上，有些人特别受欢迎，大家都想和他们聊。

镍离子就这样在咱们的分子聚会上，吸引了许多“嘉宾”，也就是那些特定的分子。

再说说“螯合”这个词。

听起来有点儿复杂，其实就是把镍离子和某些分子紧紧绑在一起，形成一个“家庭”。

你可以把它想象成一个团结的小队，大家在一起合作，完成一个个任务。

在层析的过程中，这些“家庭”会在特定的环境中被分开。

比如说，咱们可以改变温度或者用一些化学药剂，就像是在派对上突然放了首大家都喜欢的舞曲，瞬间就能把所有人引导到一个地方。

咱们谈谈“亲和层析”。

这就像是参加一个选秀节目，所有的选手都想被评委看中。

镍离子和那些特定分子之间的亲和力就像评委对选手的青睐，越受欢迎，留在现场的机会就越大。

在层析的过程中，镍离子与分子之间的这种亲和力会帮助我们分离出想要的分子。

就好像你在选择朋友，愿意和那些有共同爱好的人交往。

镍离子就是那个把特定分子“招来”的小红人！镍离子金属螯合亲和层析有什么实际用处呢？你可能会想。

科学家们在实验室里搞这些高大上的东西跟我有什么关系？很多日常生活中的产品。

比如药物、食品添加剂。

背后都有这项技术的身影。

Ni-NTA RESIN(6FF、6HP) 说明动态结合能力大约40 mg Histidine-tagged 蛋白质/ml 填料建议流速＜2ml/min填料的再生注意：如果纯化同一个蛋白，每次纯化后，不需要将介质的金属离子洗脱下来，5-7次纯化工作后，再重新螯合金属。

建议按以下的步骤进行介质的再生：1. 5倍体积的20mM 磷酸钠，0.5M NaCl，50mM EDTA，pH7.4。

2. 至少5倍体积的结合液。

3. 5倍体积的去离子水。

4. 0.5倍体积的0.1M NiSO4。

5. 5倍体积的去离子水。

6. 5倍体积的结合液。

贮存在20%乙醇中。

一些操作过程中，残留的变性蛋白和脂肪在再生过程中不能去除，但是在位清洗可以将它们除去。

在位清洗当填料背压明显增大时，填料需要清洗了，清洗前，参照上述的步骤先将Ni离子洗脱下来，然后逆流清洗。

清洗后的介质贮存在20%乙醇中，或先螯合上Ni离子再贮存到20%乙醇中。

不带Ni离子的填料参照以下方法清洗：y5倍体积的1.5M NaCl洗脱离子型结合的蛋白。

y5倍体积的去离子。

y 1M NaOH浸泡柱子，1-2h，主要去除沉淀蛋白，疏水型结合的蛋白和脂蛋白。

y 10倍体积的结合液。

y 10倍体积的去离子水。

y5-10倍体积的30%异丙醇洗涤，去除疏水型结合的蛋白，脂蛋白和脂肪，约15-20min。

y10倍体积的去离子水。

可替代的方法：2倍体积的酸性或碱性的去污剂洗涤。

如含0.1-0.5%非离子型去污剂的0.1M醋酸浸泡1-2h，处理后，70%乙醇冲洗去除残余的去污剂，最后用10倍体积的去离子水洗涤。

Ni-NTA RESIN(6FF、6HP) 与下列给定浓度的试剂兼容还原试剂5mM DTE1mM DTT20mM β-巯基乙醇5mM TCEP10mM 还原性谷胱甘肽变性剂8M 尿素6M 盐酸胍去污剂2%Triton-1002%Tween202%NP-402%胆酸盐1%CHAPS其它试剂20%乙醇50%甘油100mMNa2SO41.5M NaCl1mM EDTA60mM 醋酸缓冲液组分50mM 磷酸钠，pH7.4100mM Tris-HCl，pH7.4 100mM Tris-acetate, pH7.4100mM HEPES，pH7.4100mM MOPS，pH7.4100mM 醋酸钠，pH7.4。

Ni-NTA亲和层析介质Cat.No.L00250版本号: 05052017 目录I.产品描述 (1)II.纯化步骤 (2)III.故障排除 (4)IV.订购信息 (4)I.产品描述金斯瑞Ni-NTA亲和层析介质（产品编号L00250）是把NTA（氮川三乙酸）共价偶联到4%的琼脂糖介质上，再通过NTA的4个结合位点螯合Ni2+制备而成的亲和层析介质。

Ni-NTA亲和层析介质的Ni2+脱落率非常低，它能耐受蛋白纯化过程中使用的很多添加剂，并且有着较高的蛋白结合能力和稳定性，因此Ni-NTA亲和层析介质非常适用于多组氨酸重组蛋白的纯化。

我们提供10 ml，25ml，500 ml三种规格的包装。

表1：产品特征柱体积10 ml、25 ml和500 ml（20 ml、50 ml和1000 ml的50 %悬浆液）吸附量每毫升填料吸附量>20 mg 6xHis-tagged 蛋白（27 kDa）基质4%琼脂糖平均粒径90 μm（45-165 μm）保护液1×PBS（含20%乙醇）存储条件2-8℃保质期2‐8℃储存18个月表2：Ni-NTA亲和层析介质可耐受试剂变性剂表面活性剂还原剂盐其他6 M 盐酸胍2%Triton X-100 20 mM β-ME 4 M MgCl250%甘油8 M尿素2% Tween 20 1 mM DTT 5 mM CaCl2 20%乙醇1% CHAPS 2 M NaCl 1 mM EDTA1II.纯化步骤常规条件下纯化多组氨酸标签蛋白1试剂准备所用缓冲液需采用高纯水配制，使用前建议用0.45 μm滤膜过滤。

Lysis平衡缓冲液（LE Buffer）：50 mM Na2HPO4, 0.3 M NaCl, pH=8.0洗涤缓冲液：50 mM Na2HPO4, 0.3 M NaCl, 10 mM imidazole pH =8.0洗脱缓冲液：50 mM Na2HPO4, 0.3 M NaCl, 250 mM imidazole pH =8.02样品准备大肠杆菌或酵母细胞质中表达的重组蛋白(1) 4℃离心（如：5000 rpm 离心5分钟）收集50 ml培养基中的细胞。

使 用 说 明 书Cat. No.: C0401包装量：5 ml (50%)操作方法产品说明主要特征组成应用储存条件Ni-NTA Resin 是用于纯化6×His 标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由4%交联的Sepharose 耦连了一种四齿螯合剂NTA 而得. 它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6xHis 标签重组蛋白。

NTA ，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni 2+。

6×His 可与Ni 2+螯合，从而使His 标签蛋白结合在Ni-NTA 纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低PH 缓冲液的温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。

50％的悬浮液（20％乙醇），已螯合Ni 2+。

4°C 保存。

该纯化介质与His 标签蛋白具有极高的亲和力，可达5-20 mg/ml 。

可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His 标签蛋白。

纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达95％。

Ni-NTA 可再生4-6次，重复使用。

His 标签蛋白的纯化。

蛋白结构与功能研究。

蛋白-蛋白以及蛋白-DNA 之间相互作用的研究。

配体-受体之间相互作用的研究。

A. 非变性条件下抽提His 标签蛋白1. 样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。

对于实验室用的pET 载体表达系列，在细胞OD 600=0.5-0.8时，用1 mM IPTG 诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。

收集细胞，置于-70°C 或立即进行步骤2操作。

2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer (20 mM Tris-HCl pH7.9,0.5 M NaCl ,10% Glycerol )和PMSF 。

PMSF 用无水乙醇配制成200 mM 储存液，-20°C 或4°C 保存；PMSF 使用的工作浓度为1 mM ；注意：PMSF 见水分解，需要在使用前加入。

High-Affinity Ni-NTA ResinTechnical Manual No. 0237 Version 20070418I Description (1)II Key Features ........................................................................................ . . (1)III His-Tagged Fusion Protein Purification Procedure (1)IV Resin Regeneration .......................................................... (4)V Troubleshooting ................................................................................... . (5)VI Ordering Information ............................................................................. (6)I. DESCRIPTIONHigh Affinity Ni-NTA Resin (Cat. No. L00250, 25 ml as 50 ml of 50% slurry) is an agarose resin (4% cross-linked) covalently coupled to a tridentate chelating agent (NTA) that binds Ni2+ ions by four coordination sites for high-affinity purification of His-tagged recombinant proteins without leacking of Ni2+. His-tagged proteins may be purified under either native or denaturing conditions from any of the common recombinant expression systems, such as bacteria, yeast, insect, and mammalian. Proteins bound to the resin are then eluted with either low pH buffer or imidazole solution or even with histidine solution.II. KEY FEATURESHigh Binding capacity: more than 20 mg of 6xHis-tagged protein (50 kD) /ml (CV).Compatible with various reagents needed in the purification process, see table 1.pH stability of 3-13 (short term 2-14).Resin can be regenerated for multiple uses.Table 1. Reagents Compatible with High Affinity Ni-NTADenaturants Detergents Reducing agents Others Salts6 M Gu·HCl 2% Triton X-100 20 mM β-ME 50% glycerol 4 M MgCl28 M Urea 2% Tween 20 30 mM DTT 20% ethanol 5 mM CaCl21% CHAPS 1 mM EDTA 2 M NaClIII. HIS-TAGGED FUSION PROTEIN PURIFICATION PROCEDURE1. Purification of polyhistidine-tagged proteins under native conditionsBefore use, prepare the following three Buffers:Lysis-Equilibration Buffer (LE buffer, 1 liter):• 50 mM NaH2PO4• 300 mM NaCl• Adjust pH to 8.0 using NaOHWash Buffer• 50 mM NaH2PO4•300 mM NaCl•10 mM imidazole• Adjust pH to 8.0 using NaO HElution buffer (1 liter):• 50 mM NaH2PO4• 300 mM NaCl• 250 mM imidazole• Adjust pH to 8.0 using NaOH(1). Sample preparation and pretreatment to remove large particles and high concentration ofreagents such as EDTA, amino acids and reducing agents, which can destroy Ni-NTA resins.A. For protein expressed in E. coli or yeast cytoplasma) Harvest cells from a 50 ml culture by centrifugation (e.g., 5,000 rpm for five minutesin a Sorvall SS-34 rotor). Resuspend the cells in 8 ml of LE buffer with appropriateamount of PMSF or other protease inhibitors. The inhibitors must have no effect onthe ability of the Ni resin.b) Sonicate the solution on ice using 180 one-second bursts at high intensity with athree-second cooling period.c) Optional: If the lysate is too viscous, add RNase A (10 μg/ml) and DNase I (5 μg/ml)and incubate on ice for 10-15 minutes.c) Centrifuge the lysate at 10,000 ×g for 15 minutes to pellet the cellular debris. Applythe supernatant onto the Ni column.B. For proteins secreted into culture medium by yeast, insect, or mammalian expressionsystemsa) If the culture supernatant does not contain EDTA, histidine, or any other reducingagents that might affect the Ni column, it can be applied directly to the. Otherwise,b) Dialyze the sample against 1× PBS before applying it to the column.d) For large volume of supernatant, concentrate the proteins by ammonium sulphateprecipitation, dialyze the dissolved protein solution against 1× PBS, and then applythe solution onto the Ni column.(2). Column preparationa) Mix the slurry by gently inverting the bottle several times to completely suspend theresin.b) Use a pipette to transfer an appropriate volume of Ni resin slurry to the column. Allowthe resin to settle and the storage buffer to drain from the column.c) Equilibrate the column with four bed volumes of LE buffer or until A280 is stable.(3). Binding the protein to the resinApply the cleared sample containing His-tagged protein to the column with a flow-rate of0.5-1 ml per minute. Collect and save the flow-through for analysis.(4). WashingWash the column with eight bed volumes of Wash buffer or until A280 is stable at the flow-rate of 1 ml per minute.(5). Elution of the target proteinElute the polyhistidine-tagged protein with five to ten bed volumes of Elution buffer.Collect the elute and dialyze it against 20 mM Tris-HCl pH 8.0 or 1×PBS, pH 7.4 according to the specific application of the target protein.Example of using this product and comparison with the commercialized Ni-NTA Resin1 2 3 4 5 6 7 8 975503525Fig. 1. Comparison of GenScript High Affinity Ni-NTA Resin with that of X Company.A soluble 30 kD recombinant His-tagged protein was purified from E. coli Cell lysate usingNi-NTA Resin from X Company (Lane 1, 2, 3 and 4) and GenScript High Affinity Ni-NTA Resin (Lane 5, 6, 7 and 8), respectively.1. Flow-through X Company2. Wash X Company3. Elute X Company4. Remainder on resion X Company5. Flow-through GenScript6. Wash GenScript7. Elute GenScript8. Remainder on resion GenScript2. Purification of polyhistidine-tagged proteins from E.coli under denaturing conditions This protocol is for target proteins that are expressed mainly in inclusion bodies.Before use, prepare the following three solutions:Buffer B Wash Buffer C Elution Buffer E • 100 mM NaH2PO4• 100 mM NaH2PO4• 100 mM NaH2PO4• 10 mM Tris•Cl • 10 mM Tris•Cl • 10 mM Tris•Cl• 8 M urea• 8 M urea• 8 M urea• Adjust pH to • Adjust pH to • Adjust pH to8.0 using 1 M NaOH 6.3 using 1 M HCI 4.5 using 1 M HCI(1). Resuspend the cell pellet in 1× PBS (about 7.5 ml per ml of pellet), and disrupt cells bysonication as described above.(2).Collect inclusion bodies by centrifuging the lysate at 12,000 rpm for 10 minutes. Washinclusion bodies with 1× PBS several times if necessary.(3). Solubilize the inclusion bodies in Buffer B (about 7.5 ml per ml of pellet), and incubate for30-60 minutes at room temperature. Homogenization or sonication may be necessary to fully solubilize the pellet.(4). Centrifuge at 12,000 rpm for 30 minutes to remove any remaining insoluble material.Carefully transfer supernatant to a clean tube without disturbing the pellet and load it onthe Ni column pre-equilibrated with Buffer B.(5). Wash the column with Buffer B until the absorption at 280 nm is close to zero.(6). Wash the column with two bed volumes of Buffer C. (Note: This buffer is more stringentthan Buffer B.)(7). Elute with minimal volume of Buffer E.Note:The process recommended here is the purification of protein from inclusion body, the eluted protein from this process may need to be refolded to obtain the active and soluble protein. IV. REGENERATION OF THE RESINFor complete regeneration, wash the resin with the following solutions:1. 2 bed volumes of 6 M GuHCl, 0.2 M acetic acid2. 5 bed volumes of deionized water3. 3 bed volumes of 2% SDS4. 5 bed volumes of deionized water5. 5 bed volumes of 100% EtOH6. 5 bed volumes of deionized water7. 5 bed volumes of 100 mM EDTA (pH 8)8. 5 bed volumes of deionized water9. 5 bed volumes of 100 mM NiSO410. 10 bed volumes of deionized waterV. TROUBLESHOOTINGVI. ORDERING INFORMATIONHigh Affinity Ni-NTA Resin: Cat. No. L00250For Research Use Only.GenScript Corporation120 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854Tel: 732-885-9188, 732-885-9688Fax: 732-210-0262, 732-885-5878E-mail: ******************Web: 。

镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用2镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用摘要：蛋白质纯化是进行基因工程中最重要的环节，选取纯化蛋白的工具对纯化结果影响巨大。

镍离子亲和层析柱具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，镍离子亲和层析柱的国产化将极大促进蛋白质纯化产业的发展并会产生巨大的市场效益。

关键词：镍离子亲和层析柱、蛋白质纯化、国产化亲和层析（Affinity chromatography，AC）是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用，进行选择性分离的一种液相层析分离方法。

常用的亲和层析方式为金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized metal lchelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子(Ni2+，Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。

由于IMAC 具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性及通用性较好，易于再生，成本低等优点, 逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

镍离子亲和层析柱成为金属螯合亲和层析的代表产品。

目前，国外有3-4家镍离子亲和层析柱产品在国内销售，但价格昂贵，国内已有数家公司开展了镍离子亲和层析柱产品的销售，其中，广州精达公司采用最新的镍离子亲和层析柱的制备技术，顺利完成了该种产品的国产化。

I、镍离子亲和层析柱的制备工艺1、Ni2+吸附融合蛋白原理Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组蛋白）标签的碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。

同时Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，利用咪唑梯度洗脱，从而获得纯度较高的融合蛋白。

而利用基因工程技术制备的融合蛋白常携带6个组氨酸的标签，因6个组氨酸标签因肽片段小，故对目标蛋白质的生物活性影响较小，因此被广泛用于重组蛋白的制备及纯化。