金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究

组氨酸标签蛋白的纯化一、简介1975年，Porath等人提出了一种新的纯化方法-固定化金属鳌合层析，利用金属离子（Ni2+，Cu2+等）与氨基酸表面的残基（如组氨酸的咪唑基）的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。

组氨酸标签由于分子量小，几乎不干扰靶蛋白的功能、活性和结构而被广泛的使用。

固定的金属离子亲和层析是纯化组氨酸标签蛋白的最常用方法。

二、组氨酸标签蛋白的纯化工具月旭Ni亲和填料Ni Tanrose 6FF（NTA）Ni Tanrose 6FF（NTA）亲和介质是将金属离子Ni2+鳌合在以氨三乙酸为配基的6%高度交联的琼脂糖凝胶上形成的亲和层析介质，月旭科技开发的Ni Tanrose 6FF（NTA）不仅纯化纯度较高，通过控制合理的Ni离子密度，结合载量可达到～40mg His标签蛋白/ml介质，可以用于各种表达来源（如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）的组氨酸标签（6xHis-tagged）蛋白的纯化。

NTA含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。

6xHis可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni Tanrose 6FF（NTA）纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低PH缓冲液被温和的洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。

具有载量高、选择性好、易于再生、成本低等优点。

有了它，老板再也不用担心你完不成纯化任务了。

PreCot Ni 6FF （NTA ）是预先装好Ni Tanrose 6FF （NTA ）填料的1ml 和5ml 柱子，用来纯化6xHis-tagged 蛋白，可以使用注射器、蠕动泵。

或者液相层析系统（例如AKTA 或FPLC ）三、Ni Tanrose 6FF （NTA ）应用案例柱子：PreCot Ni 6FF （NTA ） 5ml样品：含有His 标签蛋白（大肠杆菌表达）平衡液A ：50mM Tris-HCl ，0.5M NaCl,20mM 咪唑PH8.0 洗脱液B ：50mM Tris-HCl ，0.5M NaCl ，0.5M 咪唑，PH8.0 流速：平衡、洗脱-1.0ml/min上样-0.5ml/minPreCot Ni 6FF （NTA ）纯化His 标签蛋白的纯化色谱图Manual run 2:10_UV1_280nmManual run 2:10_Cond50010001500mAU1 2 3 4 5 61：原液2：流穿3：洗脱（100%B）4：原液5：流穿6：洗脱（100%B）备注：1-3（样品和平衡液中不含咪唑）；4-6（样品和平衡液中含20mM咪唑）由于宿主蛋白中也存在组氨酸和/或半胱氨酸氨基酸残基，其他的非特异性蛋白与靶蛋白一起与金属离子亲和层析填料结合，造成纯化样品纯度不高。

组氨酸标签蛋白纯化介质的合成及其分离纯化组氨酸标签（His-tag）蛋白纯化技术是一种广泛应用于生物技术中的标准方法。

该技术利用亲和层析技术及其介质，以特异性保留带有His-标签的蛋白质。

组氨酸标签蛋白纯化介质的合成及其分离纯化方法在生物医学等领域中具有广泛应用，本文将就此进行简要介绍。

组氨酸标签蛋白纯化介质的合成是根据组氨酸标签与亲和层析介质钴离子之间的特异性相互作用原理而进行的。

主要步骤包括选择合适的亲和层析介质、进行化学修饰，最后与蛋白质结合。

化学修饰是组氨酸标签蛋白纯化介质合成的另一重要环节。

钴柱需要进行化学修饰，以使其与组氨酸标签蛋白发生相互作用。

化学修饰需要使用二乙二胺四乙酸（EDDA）或三乙缩醛（TEG）等亲和配体进行，以增加钴柱的亲和力和选择性。

与蛋白质结合是组氨酸标签蛋白纯化介质合成的最后环节。

将经过化学修饰的钴柱与待纯化的His-标签蛋白质混合，在适当缓冲液的作用下，在室温下保持一定时间，钴柱就能与His-标签蛋白之间产生亲和相互作用，使其被钴柱吸附。

分离纯化过程组氨酸标签蛋白纯化介质的分离纯化过程包括细胞裂解、质量分析、蛋白提取和纯化。

首先，将含有His-标签蛋白的细胞进行裂解，释放出蛋白质，蛋白质在缓冲液中形成复杂混合物。

接着利用基于SDS-PAGE或Western blot方法等质量分析技术对组氨酸标签蛋白进行检测，以判断裂解是否成功、受损和是否和含有标签蛋白一起被裂解。

蛋白提取是组氨酸标签蛋白纯化的一项关键技术。

常用的蛋白提取方法包括溶剂沉淀、离心过滤、氨基酸交换柱和亲和层析柱等。

其中亲和层析柱是最为常用的蛋白提取方法，由于相对高的纯度和适当的收率相对容易地实现。

最后，利用亲和层析柱进行裂解液的纯化工作，选择特异性的组氨酸标签蛋白纯化介质进行纯化分离。

分离过程的具体操作需要参考介质的使用说明书，以确保纯化的稳定性和纯度。

总结：组氨酸标签蛋白纯化介质的合成及其分离纯化是一种高效、便捷和高纯度的蛋白质纯化方法。

镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书一、简介金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。

因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。

半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。

镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。

本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。

二、性能参数：三、适用范围分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。

四、应用实例实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4-8℃环境中保存。

缓冲液组成：缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。

配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。

第9卷第6期2010年12月江南大学学报(自然科学版)Journal of J iangnan U niversity(Na t ura l Science Edition)V o.l 9 N o .6D ec . 2010收稿日期:2010-05-30; 修订日期:2010-09-09。

基金项目:国家自然科学基金项目(30970056);国家863计划项目(2007AA 02Z207);江苏省自然科学基金项目(BK 2009516);江南大学自主科研基金项目(J U SR P11012)。

作者简介:夏海锋(1979)),男,浙江平湖人,副教授,工学博士。

主要从事生物分离技术和工业微生物方面的研究。

Em a i:l h f x ia @jiangnan .edu .cn镍离子亲和层析介质的制备及其用于组氨酸标记蛋白质的纯化夏海锋, 张显, 金雄华, 刘婷婷, 郑志永, 饶志明(江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122)摘 要:以交联琼脂糖微球为基质,通过环氧氯丙烷活化,偶联亚胺二乙酸并螯合N i 2+,制备得到一种镍离子亲和层析介质。

结果发现,在强碱条件下环氧活化率达到了38.0L m o l/mL,最终N i 2+配基密度达到了30.9L m o l/mL,偶联效率为81.3%。

利用得到的镍离子亲和介质对基因工程大肠杆菌表达的组氨酸标记3-羟基丁酮还原酶进行了一步层析纯化,酶活回收率达到了58.8%,纯化倍数为2.1,蛋白纯度在85%左右,纯化效果与常用商品介质基本相当。

关键词:琼脂糖微球;镍离子亲和层析;组氨酸标记;克隆表达;纯化中图分类号:O 647.316.2文献标识码:A文章编号:1671-7147(2010)06-0685-05Preparation of N i A ffi n ity Chro m atographic Adsorben t andIts Application on Purification ofH is -Tagged ProteinX I A H a-i feng , Z HANG X ian , JI N X iong -hua , LI U T i n g -ti n g , Z H ENG Zh-i yong , RAO Zh -i m i n g(K ey L abora tory o f Industr ial B i o techno logy ,M i n istry o f Educa tion ,Jiangnan U nive rsity ,W ux i 214122,Ch i na)A bstrac t :N i a ffin ity adsorbent w as prepared by ep ich lorohydr i n ac tiva tion ,im i n od iace tic ac id (I DA)coupli n g and then che la ted w ith N i 2+based on the crossli n ked ag rose particles .A s a resu l,tthe epox y group on the m a trix reached 38.0L m o l/mL ,the N i 2+ligands density reached 30.9L m o l/m L ,and the coup ling effic iency w as 81.3%.The adsorbents w ere used to pur ify theh is -tagged 2,3-bu taned io l dehydrogenase w h ich is expressed by E.co li .Itw as found tha t the enzy m e recove ry reached 58.8%,the pu rification factor reached 2.1and the purity of pro tein w as about 85%.The perfo r m ance o f prepared adsorben ts w as a l m o st equa l to tha t of N i Sepharo se 6FF .K ey w ords :agro se pa rtic les ,N i affi n ity chro m a tograph ic adsorben,th is -tag ,c lone andexpress ,pur ification亲和层析(A ffin ity chro m atog raphy ,AC)是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用,进行选择性分离的一种液相层析分离方法。

His标签蛋白纯化实验通过实验，学习和了解 His-Tag 融合蛋白的表达、纯化原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用。

一、实验原理金属螯合离子亲和色谱（IMAC）是常见的亲和纯化方案之一，主要利用介质配体螯合的金属离子吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。

His-tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性。

Ni IDA Beads 可以用于各种表达来源（如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）的组氨酸标签（6xHis-tagged）蛋白的纯化。

它是以 4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了三配位的亚氨基二乙酸（IDA），螯合镍离子（Ni ）后，可以形成比较稳定的平面四边形结构，从而有更多的位点与组氨酸标签上的咪唑环继续配位，达到结合目的蛋白的效果（产品化学结构见图 1.1 所示）。

二、实验准备试剂菌种、LB 培养基、氨卞青霉素、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、His-Tag 蛋白纯化试剂盒实验仪器和设备移液器、恒温振荡箱、超声破碎仪、离心机、紫外检测仪、冰箱三、实验步骤第一步、菌体制备1、取 2 支 4ml LB 培养基试管，超净台中操作。

每管加入 4ul 菌种，4ul 氨卞青霉素。

放入 37 度恒温振荡箱 180rpm，过夜培养，16 小时。

2、将菌种加入 800ml LB 培养基，800ul 氨卞青霉素，放入 37 度恒温振荡箱 180rpm培养 4 小时，OD600 约 0.6-0.8。

3、加入 IPTG 800ul，放入 37 度恒温振荡箱 180rpm 培养 4 小时。

4、离心 8000rpm 离心 10min 收集菌体，-80 度保存菌体。

第二步、菌体破碎1、将菌体取出，加入 50ml Lysis Buffer 磁力搅拌悬浮，待无明显块状即可。

2、超声 4s 停 6s，36°保护温度，超声 30min。

3、将破碎好的裂解液离心取上清（11000rpm ,20min ,4℃），准备上样。

ida金属螯合亲和层析介质引言：ida金属螯合亲和层析介质是一种重要的生物分离技术，广泛应用于生物医学、生物化学和生物工程等领域。

它是通过金属离子与靶分子之间的特异性配位作用，实现对靶分子的高效分离和纯化的方法。

本文将介绍ida金属螯合亲和层析介质的原理、制备方法、应用领域及发展前景。

一、ida金属螯合亲和层析介质的原理ida金属螯合亲和层析介质的原理基于金属离子与靶分子之间的特异性配位作用。

ida（亚铁二胺四乙酸）是一种广泛应用的金属螯合剂，它能够与多种金属离子形成稳定的配合物。

通过将ida固定在载体上，可以构建ida金属螯合亲和层析介质。

二、ida金属螯合亲和层析介质的制备方法制备ida金属螯合亲和层析介质的方法主要包括固定化ida的选择、载体的选择和固定化方法的选择。

固定化ida时，可以选择将ida 直接固定在载体上，也可以选择使用交联剂将ida与载体交联。

常用的载体包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。

三、ida金属螯合亲和层析介质的应用领域ida金属螯合亲和层析介质在生物医学、生物化学和生物工程等领域有广泛的应用。

在生物医学领域，ida金属螯合亲和层析介质可用于药物分离纯化、疾病诊断和治疗等方面。

在生物化学领域，ida 金属螯合亲和层析介质可用于蛋白质纯化、酶分离和多肽合成等方面。

在生物工程领域，ida金属螯合亲和层析介质可用于基因工程药物的纯化和制备等方面。

四、ida金属螯合亲和层析介质的发展前景ida金属螯合亲和层析介质作为一种高效、选择性的分离技术，具有广阔的发展前景。

随着生物医学和生物工程领域的不断发展，对高纯度生物分子的需求越来越大，ida金属螯合亲和层析介质作为一种有效的分离工具将会得到更广泛的应用。

同时，随着新型材料和新型固定化方法的不断涌现，ida金属螯合亲和层析介质在分离效率和选择性上将会有更大的突破。

结论：ida金属螯合亲和层析介质是一种重要的生物分离技术，通过金属离子与靶分子之间的特异性配位作用，实现对靶分子的高效分离和纯化。

千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质是一种用于蛋白质纯化的重要工具，在生物技术领域广泛应用。

本文将从其原理、特点、应用以及未来发展方向等方面进行介绍和分析。

一、原理千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质的原理主要是利用镍离子与蛋白质中的组氨酸残基结合的特性，实现对蛋白质的选择性结合和分离。

在琼脂糖基质的支持下，镍nta螯合亲和层析介质可以与目标蛋白质发生专一性结合，并通过洗脱等步骤实现对蛋白质的分离纯化。

二、特点1.高选择性：镍nta螯合亲和层析介质具有较高选择性，能够与蛋白质中的组氨酸残基结合，实现对目标蛋白质的有效分离。

2.良好的生物相容性：介质材料琼脂糖在生物体内具有良好的生物相容性，不会对生物体产生毒副作用。

3.稳定性：介质具有良好的稳定性，可以承受一定的流速和压力，适合于在不同操作条件下进行蛋白质的层析纯化。

三、应用千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质在生物制药、基因工程、生物化学等领域有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1.蛋白质纯化：通过千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质可以实现对蛋白质的高效分离和纯化，为后续的生物学研究和药物开发提供优质的蛋白质样品。

2.蛋白质结构分析：可用于蛋白质的结构研究和功能分析，为了解蛋白质的结构和功能提供有效手段。

3.抗体制备：可用于从复杂混合物中纯化目标抗体，为抗体制备提供技术支持。

四、未来发展方向千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，其未来发展方向主要有以下几个方面：1.多功能化：将其与其他螯合亲和剂结合，开发出具有多功能性能的层析介质，实现对不同类型蛋白质的快速纯化。

2.自动化：结合自动化技术，实现对层析过程的自动控制，提高工作效率和操作便捷性。

3.高通量：发展高通量的层析介质，满足大规模蛋白质纯化的需求。

千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，在生物技术领域具有重要的应用价值，并且其具有良好的发展前景。

His标签蛋白纯化原理与步骤His标签是由6至10个组氨酸残基组成的一种表位标签，很容易被标签特异性抗体识别。

His标签是蛋白纯化和检测的常用标签之一，由于其分子量小（只有0.84KD），融合到重组蛋白后，不会影响标记蛋白质的结构和生化特性。

His抗体可以用于检测和His标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测His融合表达蛋白等，应用十分广泛。

一、His标签蛋白纯化原理His标签蛋白纯化通常采用固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化的方法，主要利用介质配体螯合的金属离子吸附纯化表面带组氨酸残基的蛋白。

由于His标签可与多种金属离子（如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe2+等）发生特殊的相互作用，所以可利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。

组氨酸的残基上带有1个咪唑基团，可与Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性结合在金属离子上，这些金属离子能够用螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性结合在介质上，而其他杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。

结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到纯度较高的His标签蛋白。

Ni2+、Co2+和Cu2+是His标签蛋白纯化中使用较为广泛的金属离子，因为它们在水溶液中与组氨酸具有较好的亲和性。

其中，Ni2+是亲和纯化实验中最常使用的，根据结合基团不同，Ni2+亲和层析柱可分为两类：一类是Ni-IDA，另一类是Ni-NTA。

Ni2+有六个螯合价位，其中Ni-NTA 螯合了四价，Ni-IDA螯合了三价。

所以，IDA的载量要比NTA高，在同样条件下，Ni-IDA洗脱时所需的咪唑浓度要高于Ni-NTA，但其弱结合能力使金属离子在洗脱时容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。

组氨酸标签蛋白的纯化组氨酸标签蛋白简介His-Tag融合蛋白是目前最常见的蛋白表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是是可溶性表达的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。

IMAC是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。

1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。

经典镍填料简介Ni Focurose 6FF(IDA)载量高，高流速，纯化效率，但不适合含有8M尿素及EDTA,DTT 的样品纯化。

Ni Focurose 6FF(IMAC/NTA)载量高，耐受性，适合含有8M尿素及6M盐酸胍的样品的纯化。

Ni Focurose 6FF(TED)耐受性好，可以耐受100mM EDTA，非常适合真核外泌蛋白的纯化。

可直接使用NaOH在位清洗，无需脱镍挂镍，省时省力。

含有8M尿素及6M盐酸胍的样品用此镍填料影响结合，低丰度的样品结合效率效率差。

Ni Focurose 6HP（IMAC/NTA)小粒径基质使其有更高的分辨率。

IMAC Focurose 6FF可以自己鳌合不同的金属离子，适合纯化外露His，Cys，Try 残基的蛋白。

镍填料的选择科研微量制备Ni Focurose 6HP（IMAC/NTA)，此填料分辨率高，科研微量制备可用此填料纯化，纯度更高。

样品中含有DTT或EDTANi Fucorose 6FF(TED),此填料可以耐受100mM的EDTA及10mM的DTT,样品中含有EDTA及DTT时无需换液直接过镍柱纯化。

氨基酸金属离子螯合物合成条件及测定方法的研究一、本文概述氨基酸金属离子螯合物是一类重要的生物无机化合物，具有广泛的应用价值，包括在医药、农业、食品、环境科学等领域。

这些化合物是由氨基酸分子中的羧基、氨基和侧链功能团与金属离子通过配位键形成的稳定结构。

由于氨基酸的种类繁多，以及金属离子的多样性，使得氨基酸金属离子螯合物的种类非常丰富，其合成条件及测定方法也具有独特性和复杂性。

本文旨在深入研究氨基酸金属离子螯合物的合成条件及测定方法。

我们将探讨不同氨基酸与金属离子形成螯合物的最佳反应条件，包括反应温度、pH值、反应时间、溶剂种类等因素对螯合物形成的影响。

我们将研究氨基酸金属离子螯合物的表征方法，如红外光谱、紫外光谱、核磁共振等，以及测定其稳定性、溶解性等物化性质的方法。

我们还将探讨氨基酸金属离子螯合物的生物活性及其潜在的应用价值。

通过本文的研究，我们期望能够为氨基酸金属离子螯合物的合成提供理论依据和技术支持，为其在各个领域的应用提供基础数据和实验依据。

我们也期望通过本文的研究，能够推动氨基酸金属离子螯合物领域的研究进展，为相关领域的学者和从业者提供有价值的参考信息。

二、氨基酸金属离子螯合物的合成条件研究氨基酸金属离子螯合物的合成是一个涉及多种因素的过程，包括反应温度、pH值、反应时间、氨基酸与金属离子的摩尔比等。

为了优化合成条件，本研究对这些因素进行了系统的研究。

反应温度对螯合物的形成有显著影响。

一般来说，适当的提高温度可以加速反应速率，但过高的温度可能导致反应失控或生成不稳定的副产物。

因此，我们在室温至沸腾温度范围内设置了多个温度点，观察其对螯合物生成的影响。

实验结果显示，在60-80℃的温度范围内，氨基酸与金属离子的螯合反应进行得较为顺利，产物的生成速度和纯度均达到较优水平。

pH值也是影响螯合物合成的重要因素。

氨基酸在不同pH值下具有不同的电离状态，这直接影响其与金属离子的配位能力。

我们通过调整反应溶液的pH值，观察其对螯合物生成的影响。

镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用摘要：蛋白质纯化是进行基因工程中最重要的环节，选取纯化蛋白的工具对纯化结果影响巨大。

镍离子亲和层析柱具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，镍离子亲和层析柱的国产化将极大促进蛋白质纯化产业的发展并会产生巨大的市场效益。

关键词：镍离子亲和层析柱、蛋白质纯化、国产化亲和层析（Affinity chromatography，AC）是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用，进行选择性分离的一种液相层析分离方法。

常用的亲和层析方式为金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized metal lchelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子(Ni2+，Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。

由于IMAC 具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性及通用性较好，易于再生，成本低等优点, 逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

镍离子亲和层析柱成为金属螯合亲和层析的代表产品。

目前，国外有3-4家镍离子亲和层析柱产品在国内销售，但价格昂贵，国内已有数家公司开展了镍离子亲和层析柱产品的销售，其中，广州精达公司采用最新的镍离子亲和层析柱的制备技术，顺利完成了该种产品的国产化。

I、镍离子亲和层析柱的制备工艺1、Ni2+吸附融合蛋白原理Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组蛋白）标签的碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。

同时Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，利用咪唑梯度洗脱，从而获得纯度较高的融合蛋白。

而利用基因工程技术制备的融合蛋白常携带6个组氨酸的标签，因6个组氨酸标签因肽片段小，故对目标蛋白质的生物活性影响较小，因此被广泛用于重组蛋白的制备及纯化。

2、固相载体的选择常见的固相载体包括为普通琼脂糖颗粒及GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品。

1. 学习并掌握融合蛋白的纯化方法；2. 掌握金属螯合亲和层析技术；3. 提高蛋白质分离纯化操作技能。

二、实验原理融合蛋白是指将目的蛋白与另一个蛋白（如载体蛋白、酶等）通过化学键连接在一起形成的蛋白质。

融合蛋白的纯化可以通过多种方法实现，其中金属螯合亲和层析是一种常用的纯化技术。

该方法利用目的蛋白与载体蛋白之间特定的相互作用，将目的蛋白从混合物中分离出来。

三、实验材料1. 融合蛋白样品；2. 金属螯合亲和层析柱；3. 亲和层析介质（如Ni-NTA）；4. 洗脱缓冲液；5. 蛋白质检测试剂；6. 离心机；7. 其他实验试剂。

四、实验步骤1. 准备亲和层析柱：将亲和层析介质加入层析柱中，用洗脱缓冲液平衡层析柱。

2. 样品上柱：将融合蛋白样品加至层析柱中，让其自然流出。

3. 洗脱：用洗脱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱液。

4. 收集目标蛋白：将收集到的洗脱液进行蛋白质检测，确定目标蛋白的存在。

5. 离心分离：将收集到的目标蛋白样品进行离心，分离出纯化的融合蛋白。

6. 蛋白质检测：对纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE、Western blot等检测，验证纯化效果。

1. 亲和层析柱平衡后，样品顺利上柱，洗脱过程中目标蛋白得以分离。

2. 蛋白质检测结果显示，纯化的融合蛋白在预期位置出现条带，证明纯化效果良好。

3. SDS-PAGE结果显示，纯化的融合蛋白纯度较高，未发现其他杂蛋白。

4. Western blot结果显示，纯化的融合蛋白与特异性抗体结合良好，进一步证明纯化效果。

六、实验讨论1. 在实验过程中，应注意控制层析柱的流速，避免样品过快通过层析柱，导致目标蛋白丢失。

2. 亲和层析介质的装载量对纯化效果有较大影响，需根据实验需求调整。

3. 洗脱缓冲液的pH、离子强度等参数对目标蛋白的洗脱效果有较大影响，需根据实验需求优化。

4. 实验过程中，应注意蛋白质的稳定性，避免蛋白质降解。

七、实验结论本实验成功纯化了融合蛋白，验证了金属螯合亲和层析技术在融合蛋白纯化中的应用。

镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书一、简介金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。

因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。

半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。

镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。

本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。

二、性能参数：三、适用范围分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。

四、应用实例实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4-8℃环境中保存。

缓冲液组成：缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。

配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。

一、实验目的1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法；2. 掌握利用金属螯合亲和层析（Metal Chelating Affinity Chromatography，MCAC）纯化可溶蛋白的操作步骤；3. 了解蛋白质纯化过程中的关键参数和注意事项。

二、实验原理金属螯合亲和层析是一种基于蛋白质与金属离子特异性结合的纯化方法。

在实验中，利用带有组氨酸尾的融合蛋白与镍离子特异性结合的特性，通过金属螯合亲和层析柱进行分离纯化。

三、实验材料1. 培养基：M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基、IPTG；2. 菌株：大肠杆菌BL21（DE3）pLyaS；3. 试剂：MCAC-EDTA、Triton X-100、蛋白酶抑制剂、NiSO4、去离子水、50mmol/L MCAC-0缓冲液；4. 仪器：摇床、离心机、层析柱、分光光度计。

四、实验步骤1. 接种：将含pET载体表达带组氨酸尾融合蛋白的大肠杆菌BL21（DE3）pLyaS菌株接种于10 ml M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基中，37℃摇荡培养过夜。

2. 转接：取1 ml过夜培养物转接至100 ml M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基中，37℃摇荡培养至OD600为0.7~1.0。

3. 诱导表达：加入1 ml 0.1 mol/L IPTG，37℃继续培养1~3 h。

4. 收集菌体：4℃、4000 g离心10 min，弃上清，收集菌体沉淀。

5. 重悬菌体：将菌体沉淀加入冰浴中冻融，加入5 ml MCAC-0缓冲液和33 μl 150蛋白酶抑制剂混合液，用吸管吹打重悬，超声破菌或匀浆。

6. 纯化：将重悬的菌体加入装有1 ml NTA介质的层析柱中，用去离子水、50 mmol/L NiSO4、MCAC-0缓冲液依次洗柱。

7. 收集目的蛋白：收集结合在层析柱上的目的蛋白，用适当缓冲液洗脱。

8. 蛋白质浓度测定：利用分光光度计测定洗脱液中蛋白质浓度。

五、实验结果与分析1. 通过金属螯合亲和层析，成功纯化了带组氨酸尾的融合蛋白。