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Ni-NTA Superflow Cartridge 手册用于手动或FPLC纯化His-tag蛋白目录：包装内容物（4）储存和稳定性（4）安全措施（4）介绍（7）Ni-NTA Superflow Cartridge说明书（7）QIA表达系统（7）Ni-NTA Cartirdge 接头（14）天然或变性条件下纯化蛋白（15）说明书⏹天然条件下清澈的E.coli菌液的制备（16）⏹变性条件下清澈的E.coli菌液的制备（18）⏹从E.coli细胞制备6XHis-tag的胞质蛋白（19）⏹天然条件下从昆虫细胞中制备细胞菌液（20）⏹使用注射器手动纯化6XHis-tag蛋白（21）⏹使用自动层析系统纯化6XHis-tag蛋白（22）问题的解决（23）附录A：Buffer成分（25）附录B; Ni-NTA Superflow Cartridge的清洁与再生（27）包装包含物Cat no. Ni-NTA Superflow Cartridge（1）Ni-NTA Superflow Cartridge（5）说明书30721 5 1 30725 100 1 30760 1 1 30761 5 1 30765 100 1技术支持在QIAGEN，我们为我们的技术支持的质量和有效性而感到骄傲我们的技术部门是由有广泛实验经验的技术人员和专家组成的，他们都从事分子生物学而且熟练使用QIAGEN的产品。
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Ni Seplife FF（NTA）说明书1.产品介绍Ni Seplife FF（NTA）是蓝晓科技自主研发的一种新型亲和层析介质，是将氨基三乙酸基键合在高流速琼脂糖凝胶过滤层析介质上，再螯合金属离子Ni2+形成的一种亲和层析介质，其利用样品组分中的组氨酸与金属离子的亲和吸附进行分离纯化。
镍螯合高流速琼脂糖层析介质（NTA）特异性好，流速快，螯合金属离子更稳定不易脱落，能耐受更高的还原剂，物理和化学性能稳定，批次重复性好，颗粒粒度均匀，分离效果好。
可用于分离纯化能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及带His 标签的重组蛋白。
2.性能介绍产品牌号Ni Seplife FF（NTA）外观球状凝胶，无臭无味基质Seplife 6FF形状球形最高流速（cm/h）≧370耐压（MPa）0.3粒径（μm）45～165离子结合量（Ni2+ umol/ml）：~20pH稳定性3~13（长期）；2~14（短期，在位清洗[CIP]）在常用水相溶液中稳定：0.1M氢氧化钠；0.01M盐酸；8M尿素，70%化学稳定性醋酸，30%异丙醇应用适用His 标签的重组蛋白纯化3.使用方法3.1 装柱装柱按照标准操作规程操作。
必须保证每种材料都处于工作温度，凝胶装柱前需要脱气。
3.2平衡用2~5个柱床体积的初始缓冲溶液进行平衡，直至电导率、pH值等参数不变。
3.3上样（1）样品一般溶解于pH6～8的初始缓冲液中，提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。
（2）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，同时最好避免巯基乙醇、DTT等还原剂。
（3）常用缓冲液有10～100mmol/L磷酸钠缓冲液、20～200mmol/LTris-HCl缓冲液等。
（4）缓冲液中一般要加入0.15～0.5mol/L的NaCl以消除离子交换作用。
（5）初次使用镍螯合琼脂糖凝胶时，推荐使用50mmol/L PBS（50 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4）作为初始缓冲液。
![纯泰镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)使用说明书(完全版)[1]](https://img.taocdn.com/s1/m/274baf4ec850ad02de8041eb.png)
第9卷第6期2010年12月江南大学学报(自然科学版)Journal of J iangnan U niversity(Na t ura l Science Edition)V o.l 9 N o .6D ec . 2010收稿日期:2010-05-30; 修订日期:2010-09-09。
基金项目:国家自然科学基金项目(30970056);国家863计划项目(2007AA 02Z207);江苏省自然科学基金项目(BK 2009516);江南大学自主科研基金项目(J U SR P11012)。
作者简介:夏海锋(1979)),男,浙江平湖人,副教授,工学博士。
主要从事生物分离技术和工业微生物方面的研究。
Em a i:l h f x ia @jiangnan .edu .cn镍离子亲和层析介质的制备及其用于组氨酸标记蛋白质的纯化夏海锋, 张显, 金雄华, 刘婷婷, 郑志永, 饶志明(江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122)摘 要:以交联琼脂糖微球为基质,通过环氧氯丙烷活化,偶联亚胺二乙酸并螯合N i 2+,制备得到一种镍离子亲和层析介质。
结果发现,在强碱条件下环氧活化率达到了38.0L m o l/mL,最终N i 2+配基密度达到了30.9L m o l/mL,偶联效率为81.3%。
利用得到的镍离子亲和介质对基因工程大肠杆菌表达的组氨酸标记3-羟基丁酮还原酶进行了一步层析纯化,酶活回收率达到了58.8%,纯化倍数为2.1,蛋白纯度在85%左右,纯化效果与常用商品介质基本相当。
关键词:琼脂糖微球;镍离子亲和层析;组氨酸标记;克隆表达;纯化中图分类号:O 647.316.2文献标识码:A文章编号:1671-7147(2010)06-0685-05Preparation of N i A ffi n ity Chro m atographic Adsorben t andIts Application on Purification ofH is -Tagged ProteinX I A H a-i feng , Z HANG X ian , JI N X iong -hua , LI U T i n g -ti n g , Z H ENG Zh-i yong , RAO Zh -i m i n g(K ey L abora tory o f Industr ial B i o techno logy ,M i n istry o f Educa tion ,Jiangnan U nive rsity ,W ux i 214122,Ch i na)A bstrac t :N i a ffin ity adsorbent w as prepared by ep ich lorohydr i n ac tiva tion ,im i n od iace tic ac id (I DA)coupli n g and then che la ted w ith N i 2+based on the crossli n ked ag rose particles .A s a resu l,tthe epox y group on the m a trix reached 38.0L m o l/mL ,the N i 2+ligands density reached 30.9L m o l/m L ,and the coup ling effic iency w as 81.3%.The adsorbents w ere used to pur ify theh is -tagged 2,3-bu taned io l dehydrogenase w h ich is expressed by E.co li .Itw as found tha t the enzy m e recove ry reached 58.8%,the pu rification factor reached 2.1and the purity of pro tein w as about 85%.The perfo r m ance o f prepared adsorben ts w as a l m o st equa l to tha t of N i Sepharo se 6FF .K ey w ords :agro se pa rtic les ,N i affi n ity chro m a tograph ic adsorben,th is -tag ,c lone andexpress ,pur ification亲和层析(A ffin ity chro m atog raphy ,AC)是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用,进行选择性分离的一种液相层析分离方法。
镍柱亲和层析1. 什么是镍柱亲和层析？镍柱亲和层析是一种分离和纯化蛋白质的技术方法。
通过利用镍离子和组织特异性传感器结合矩阵的亲和性，目标蛋白质可以被高效地捕获和分离。
2. 镍柱亲和层析的原理镍柱亲和层析的原理基于镍离子与组织特异性传感器结合矩阵的亲和性。
通常使用一种名为Ni-NTA的亲和树脂，其中镍离子与某些氨基酸残基（例如组氨酸，组氨酸是蛋白质中可以与金属离子结合的常见残基）具有高度的亲和力。
将该亲和树脂充填在柱子中，然后将混合物（通常是细胞裂解液或纯化液）通过柱子进行分离和纯化。
3. 镍柱亲和层析的步骤镍柱亲和层析通常包括以下步骤：3.1 树脂的准备将亲和树脂（例如Ni-NTA树脂）洗净并充填到柱子中。
在使用之前，需要以适当的缓冲液洗涤和平衡树脂。
3.2 样品的制备将要进行分离和纯化的蛋白质样品进行处理和制备。
通常，这包括细胞的裂解和去除杂质。
3.3 样品的加载将处理好的样品溶液加载到柱子中。
样品中的目标蛋白质与镍离子结合并与亲和树脂发生相互作用。
3.4 洗脱目标蛋白质通过用含有一定浓度的络合剂（例如组氨酸）的缓冲液进行洗脱，使目标蛋白质从柱子上洗脱下来。
3.5 验证纯化蛋白质对洗脱得到的蛋白质样品进行验证，通常通过SDS-PAGE凝胶电泳或其他定量方法进行。
3.6 进一步纯化（可选）如果需要进一步纯化目标蛋白质，可以使用其他的层析方法或技术进行。
4. 镍柱亲和层析的应用镍柱亲和层析是常用的蛋白质分离和纯化方法，被广泛应用于生物医学、生物技术和生命科学研究领域。
4.1 重组蛋白的纯化镍柱亲和层析在重组蛋白的纯化中具有重要作用。
许多重组蛋白在表达系统中被融合到带有镍结合标签的载体上，通过镍柱亲和层析可以高效地纯化目标蛋白质。
4.2 酶的纯化许多酶也可以通过镍柱亲和层析进行纯化。
例如，组氨酸残基在许多酶中较为常见，可以与镍离子结合，从而实现酶的有效纯化。
4.3 蛋白质结构研究在蛋白质结构研究中，镍柱亲和层析可用于纯化特定蛋白质或蛋白质复合物，以获取足够纯净的样品进行晶体学和其他结构分析方法。
High-Affinity Ni-NTA ResinTechnical Manual No. 0237 Version 20070418I Description (1)II Key Features ........................................................................................ . . (1)III His-Tagged Fusion Protein Purification Procedure (1)IV Resin Regeneration .......................................................... (4)V Troubleshooting ................................................................................... . (5)VI Ordering Information ............................................................................. (6)I. DESCRIPTIONHigh Affinity Ni-NTA Resin (Cat. No. L00250, 25 ml as 50 ml of 50% slurry) is an agarose resin (4% cross-linked) covalently coupled to a tridentate chelating agent (NTA) that binds Ni2+ ions by four coordination sites for high-affinity purification of His-tagged recombinant proteins without leacking of Ni2+. His-tagged proteins may be purified under either native or denaturing conditions from any of the common recombinant expression systems, such as bacteria, yeast, insect, and mammalian. Proteins bound to the resin are then eluted with either low pH buffer or imidazole solution or even with histidine solution.II. KEY FEATURESHigh Binding capacity: more than 20 mg of 6xHis-tagged protein (50 kD) /ml (CV).Compatible with various reagents needed in the purification process, see table 1.pH stability of 3-13 (short term 2-14).Resin can be regenerated for multiple uses.Table 1. Reagents Compatible with High Affinity Ni-NTADenaturants Detergents Reducing agents Others Salts6 M Gu·HCl 2% Triton X-100 20 mM β-ME 50% glycerol 4 M MgCl28 M Urea 2% Tween 20 30 mM DTT 20% ethanol 5 mM CaCl21% CHAPS 1 mM EDTA 2 M NaClIII. HIS-TAGGED FUSION PROTEIN PURIFICATION PROCEDURE1. Purification of polyhistidine-tagged proteins under native conditionsBefore use, prepare the following three Buffers:Lysis-Equilibration Buffer (LE buffer, 1 liter):• 50 mM NaH2PO4• 300 mM NaCl• Adjust pH to 8.0 using NaOHWash Buffer• 50 mM NaH2PO4•300 mM NaCl•10 mM imidazole• Adjust pH to 8.0 using NaO HElution buffer (1 liter):• 50 mM NaH2PO4• 300 mM NaCl• 250 mM imidazole• Adjust pH to 8.0 using NaOH(1). Sample preparation and pretreatment to remove large particles and high concentration ofreagents such as EDTA, amino acids and reducing agents, which can destroy Ni-NTA resins.A. For protein expressed in E. coli or yeast cytoplasma) Harvest cells from a 50 ml culture by centrifugation (e.g., 5,000 rpm for five minutesin a Sorvall SS-34 rotor). Resuspend the cells in 8 ml of LE buffer with appropriateamount of PMSF or other protease inhibitors. The inhibitors must have no effect onthe ability of the Ni resin.b) Sonicate the solution on ice using 180 one-second bursts at high intensity with athree-second cooling period.c) Optional: If the lysate is too viscous, add RNase A (10 μg/ml) and DNase I (5 μg/ml)and incubate on ice for 10-15 minutes.c) Centrifuge the lysate at 10,000 ×g for 15 minutes to pellet the cellular debris. Applythe supernatant onto the Ni column.B. For proteins secreted into culture medium by yeast, insect, or mammalian expressionsystemsa) If the culture supernatant does not contain EDTA, histidine, or any other reducingagents that might affect the Ni column, it can be applied directly to the. Otherwise,b) Dialyze the sample against 1× PBS before applying it to the column.d) For large volume of supernatant, concentrate the proteins by ammonium sulphateprecipitation, dialyze the dissolved protein solution against 1× PBS, and then applythe solution onto the Ni column.(2). Column preparationa) Mix the slurry by gently inverting the bottle several times to completely suspend theresin.b) Use a pipette to transfer an appropriate volume of Ni resin slurry to the column. Allowthe resin to settle and the storage buffer to drain from the column.c) Equilibrate the column with four bed volumes of LE buffer or until A280 is stable.(3). Binding the protein to the resinApply the cleared sample containing His-tagged protein to the column with a flow-rate of0.5-1 ml per minute. Collect and save the flow-through for analysis.(4). WashingWash the column with eight bed volumes of Wash buffer or until A280 is stable at the flow-rate of 1 ml per minute.(5). Elution of the target proteinElute the polyhistidine-tagged protein with five to ten bed volumes of Elution buffer.Collect the elute and dialyze it against 20 mM Tris-HCl pH 8.0 or 1×PBS, pH 7.4 according to the specific application of the target protein.Example of using this product and comparison with the commercialized Ni-NTA Resin1 2 3 4 5 6 7 8 975503525Fig. 1. Comparison of GenScript High Affinity Ni-NTA Resin with that of X Company.A soluble 30 kD recombinant His-tagged protein was purified from E. coli Cell lysate usingNi-NTA Resin from X Company (Lane 1, 2, 3 and 4) and GenScript High Affinity Ni-NTA Resin (Lane 5, 6, 7 and 8), respectively.1. Flow-through X Company2. Wash X Company3. Elute X Company4. Remainder on resion X Company5. Flow-through GenScript6. Wash GenScript7. Elute GenScript8. Remainder on resion GenScript2. Purification of polyhistidine-tagged proteins from E.coli under denaturing conditions This protocol is for target proteins that are expressed mainly in inclusion bodies.Before use, prepare the following three solutions:Buffer B Wash Buffer C Elution Buffer E • 100 mM NaH2PO4• 100 mM NaH2PO4• 100 mM NaH2PO4• 10 mM Tris•Cl • 10 mM Tris•Cl • 10 mM Tris•Cl• 8 M urea• 8 M urea• 8 M urea• Adjust pH to • Adjust pH to • Adjust pH to8.0 using 1 M NaOH 6.3 using 1 M HCI 4.5 using 1 M HCI(1). Resuspend the cell pellet in 1× PBS (about 7.5 ml per ml of pellet), and disrupt cells bysonication as described above.(2).Collect inclusion bodies by centrifuging the lysate at 12,000 rpm for 10 minutes. Washinclusion bodies with 1× PBS several times if necessary.(3). Solubilize the inclusion bodies in Buffer B (about 7.5 ml per ml of pellet), and incubate for30-60 minutes at room temperature. Homogenization or sonication may be necessary to fully solubilize the pellet.(4). Centrifuge at 12,000 rpm for 30 minutes to remove any remaining insoluble material.Carefully transfer supernatant to a clean tube without disturbing the pellet and load it onthe Ni column pre-equilibrated with Buffer B.(5). Wash the column with Buffer B until the absorption at 280 nm is close to zero.(6). Wash the column with two bed volumes of Buffer C. (Note: This buffer is more stringentthan Buffer B.)(7). Elute with minimal volume of Buffer E.Note:The process recommended here is the purification of protein from inclusion body, the eluted protein from this process may need to be refolded to obtain the active and soluble protein. IV. REGENERATION OF THE RESINFor complete regeneration, wash the resin with the following solutions:1. 2 bed volumes of 6 M GuHCl, 0.2 M acetic acid2. 5 bed volumes of deionized water3. 3 bed volumes of 2% SDS4. 5 bed volumes of deionized water5. 5 bed volumes of 100% EtOH6. 5 bed volumes of deionized water7. 5 bed volumes of 100 mM EDTA (pH 8)8. 5 bed volumes of deionized water9. 5 bed volumes of 100 mM NiSO410. 10 bed volumes of deionized waterV. TROUBLESHOOTINGVI. ORDERING INFORMATIONHigh Affinity Ni-NTA Resin: Cat. No. L00250For Research Use Only.GenScript Corporation120 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854Tel: 732-885-9188, 732-885-9688Fax: 732-210-0262, 732-885-5878E-mail: ******************Web: 。
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书1简介金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。
因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。
半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。
镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。
本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。
2性能参数：3适用范围分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
4应用实例实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存。
缓冲液组成：缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。
配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g, 加适量水溶解后定容到1000ml。
Ni-IDA亲和层析介质Cat.No. L00223I版本号: 05082017 目录I.产品描述 (1)II.纯化步骤 (2)III.故障排除 (4)IV.订购信息 (4)I.产品描述金斯瑞Ni-IDA亲和层析介质（产品编号L00223I）是把IDA（亚氨基二乙酸）共价偶联到4 %交联的琼脂糖介质上，再通过IDA的3个结合位点螯合Ni2+制备而成，并提供了三个离子键结合部位高亲和地纯化含有多聚组氨酸标签的重组蛋白。
金斯瑞 Ni-IDA亲和层析介质的Ni2+脱落程度很低，并具有高吸附量及高稳定性，在多聚组氨酸标签的重组蛋白的纯化实验中有非常好的表现力，具体特性见表1。
表1. Ni-IDA亲和层析介质的特性柱体积10 ml动态吸附量20 mg 6×His 标签蛋白（27 kD）/ml介质球形基质 4 %交联度琼脂糖平均粒径90 μm （45-165 μm）储存溶剂1× PBS（含20%乙醇）储存&稳定性2-8 ℃储存18个月1天然条件下纯化多聚组氨酸标签蛋白1.缓冲液配制用于配制缓冲液的水和化学试剂必须是高纯度的，并建议使用前用0.45 μm滤膜过滤一遍。
平衡缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，用NaOH调pH 为8.0洗涤缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM咪唑，用NaOH调pH 为8洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM咪唑，用NaOH调pH 为8.02. 样品制备A 大肠杆菌系统或酵母胞质系统表达蛋白（1）在4 ℃条件下用50 ml离心管离心收集细胞；（2）用8 ml平衡缓冲液重悬细胞，可以加入适量的PMSF或其他蛋白酶抑制剂；注意：加入的抑制剂不能对Ni-IDA亲和层析介质的性能有影响，破碎液中不能含有EDTA、EGTA等螯合剂，DTT、巯基乙醇等还原剂，尿素、盐酸胍等变性剂。
千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质是一种用于蛋白质纯化的重要工具，在生物技术领域广泛应用。
本文将从其原理、特点、应用以及未来发展方向等方面进行介绍和分析。
一、原理千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质的原理主要是利用镍离子与蛋白质中的组氨酸残基结合的特性，实现对蛋白质的选择性结合和分离。
在琼脂糖基质的支持下，镍nta螯合亲和层析介质可以与目标蛋白质发生专一性结合，并通过洗脱等步骤实现对蛋白质的分离纯化。
二、特点1.高选择性：镍nta螯合亲和层析介质具有较高选择性，能够与蛋白质中的组氨酸残基结合，实现对目标蛋白质的有效分离。
2.良好的生物相容性：介质材料琼脂糖在生物体内具有良好的生物相容性，不会对生物体产生毒副作用。
3.稳定性：介质具有良好的稳定性，可以承受一定的流速和压力，适合于在不同操作条件下进行蛋白质的层析纯化。
三、应用千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质在生物制药、基因工程、生物化学等领域有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1.蛋白质纯化：通过千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质可以实现对蛋白质的高效分离和纯化，为后续的生物学研究和药物开发提供优质的蛋白质样品。
2.蛋白质结构分析：可用于蛋白质的结构研究和功能分析，为了解蛋白质的结构和功能提供有效手段。
3.抗体制备：可用于从复杂混合物中纯化目标抗体，为抗体制备提供技术支持。
四、未来发展方向千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，其未来发展方向主要有以下几个方面：1.多功能化：将其与其他螯合亲和剂结合，开发出具有多功能性能的层析介质，实现对不同类型蛋白质的快速纯化。
2.自动化：结合自动化技术，实现对层析过程的自动控制，提高工作效率和操作便捷性。
3.高通量：发展高通量的层析介质，满足大规模蛋白质纯化的需求。
千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，在生物技术领域具有重要的应用价值，并且其具有良好的发展前景。
镍离子氮川三乙酸镍离子氮川三乙酸（简称NiNTA）是一种用于亲和层析分离的化学试剂。
它具有以下特点：1. 高亲和力：NiNTA与含有His标记的蛋白质结合的亲和力非常高。
这是因为NiNTA中含有镍离子，而His标记通常是蛋白质表面具有易于与镍离子结合的组氨酸残基。
因此，NiNTA可以高效地捕获His标记的蛋白质。
2. 可重复使用：NiNTA可以通过重复洗涤和再生来使用多次。
这使得它成为一种经济实用的试剂。
通过控制洗涤和再生条件可以延长NiNTA的使用寿命。
3. 操作简便：NiNTA可以很方便地与其他化学试剂和蛋白质结合，可以在多种实验条件下使用，如盐浓度，pH 值，温度等。
4. 纯度高：NiNTA可将目标蛋白质从混合物中高效地纯化出来。
它可以作为一种单步纯化方法，也可以与其他技术（如凝胶层析、柱层析等）结合应用。
在实验室中，NiNTA常被用于纯化含有His标记的蛋白质。
His标记是一种常用的标记方法，通过在蛋白质表面加上6-10个组氨酸残基，使得蛋白质能与NiNTA高效结合。
纯化His标记蛋白质的过程通常包括以下步骤：1. 制备NiNTA亲和色谱柱：将NiNTA吸附在亲和色谱树脂上，制备NiNTA亲和色谱柱。
2. 样品加载：将含有His标记的蛋白质混合物加到NiNTA柱中。
目标蛋白质将具有高亲和力地结合到NiNTA树脂上。
3. 洗脱：用缓冲液洗脱非特异性结合的杂质。
4. 吸附物洗脱：用含有高浓度吉氨酸的缓冲液洗脱目标蛋白质，使其从NiNTA树脂上脱离下来。
最终得到高纯度的目标蛋白质。
总之，NiNTA是一种高效、可重复使用并且易于操作的化学试剂，广泛应用于蛋白质纯化和研究领域。
nta亲和柱层析原理NTA亲和柱层析原理是一种分离和纯化蛋白质的方法，它采用了某些分子对目标蛋白的亲和作用来实现分离。
本文将对NTA亲和柱层析原理进行详细的介绍，包括定义、原理、优缺点以及应用等方面。
一、定义NTA全称为Nitrilotriacetic acid，是一种由三个羧基和一个胺基构成的有机酸，可用于制备能够结合在金属或半金属离子上的树脂，常用的是镍离子（Ni2+）。
NTA亲和柱层析是一种利用由NTA配体修饰的树脂来捕获和纯化蛋白质的技术，其原理就是基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。
二、原理NTA亲和柱层析原理的基本步骤如下：1. 准备NTA树脂，将镍离子与NTA配体修饰的树脂混合。
2. 样品制备，要提取目标蛋白，通常需要对细胞或组织进行破碎，以释放蛋白质。
3. 柱平衡，用缓冲液进行平衡，通常使用含有金属离子（如Ni2+）的缓冲液，以使NTA树脂与镍离子形成配合物。
4. 加样，将样品加入NTA亲和柱中，目标蛋白与NTA树脂上的镍离子发生亲和作用，结合在一起。
5. 洗脱，用一定的缓冲液和浓度的镍离子进行洗脱，以去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
6. 再洗脱，使用更高浓度的镍离子或其他洗脱剂再次洗脱，得到高纯度的目标蛋白。
三、优缺点优点：1. 特异性强：NTA树脂基于配体与目标蛋白的特异性结合，在选择性方面具有很好的特异性。
2. 解析度高：NTA亲和柱层析技术可以在一定程度上保留目标蛋白的构象和活性，具有较好的分离效果。
3. 操作简便：操作简单、快速、易于扩展，适合快速提取目标蛋白的应用。
1. 成本较高：采用NTA亲和柱层析的成本相对较高，需要用到昂贵的配体、镍离子等。
2. 染色质污染：在发生结合的过程中，染色质中的蛋白质也会被捕获，导致可能无法产生纯净的目标蛋白。
3. 离子抑制：在一些条件下（如浓度较高、PH值过低等），离子可能会抑制结合，从而影响洗脱蛋白的效果。
四、应用NTA亲和柱层析技术可以在许多生物领域中得到广泛应用，如下：1. 纯化蛋白质：NTA亲和柱层析技术可以用于纯化目标蛋白质，特别是带有His标签或其他标签的蛋白质。
镍离子亲和层析型号
镍离子亲和层析是一种常用的蛋白质纯化方法，其原理是利用镍离子与受体蛋白质的亲和作用，在一定条件下将目标蛋白从混合物中分离出来。
在实际应用中，需要选择适合的镍离子亲和层析型号，以达到理想的分离效果。
目前市面上常见的镍离子亲和层析型号有以下几种：
1. Ni-NTA亲和层析树脂：该型号树脂基于四乙酰亚胺改性的胶珠，具有较高的亲和力和选择性，适用于各种规模的蛋白质纯化。
2. HisPur Ni-NTA树脂：该型号树脂是基于高密度Ni-NTA柔性支撑材料制备的，具有更好的蛋白质结合能力和更短的纯化时间。
3. TALON超级亲和层析树脂：该型号树脂是基于硫氰酸异丙酯改性的胶珠，具有非常高的蛋白质结合能力和极好的选择性。
4. Ni Sepharose 6 Fast Flow树脂：该型号树脂是基于Sepharose 6 Fast Flow胶珠改性的，具有较高的亲和力和选择性，适用于中小规模的蛋白纯化。
以上是常见的几种镍离子亲和层析型号，选择适合的型号可以提高蛋白质纯化的效率和纯度，为后续的实验提供更好的样品。
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Ni-NTA琼脂糖凝胶(His标签纯化树脂)使用说明货号：P2010规格：5ml/10ml（凝胶体积）保存：4°C保存，有效期至少一年产品说明：Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF是用于纯化6×His标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由6%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得.它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6×His标签重组蛋白。
NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。
6×His可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。
该纯化介质与His标签蛋白具有极高的亲和力，可达5-20mg/ml。
可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白。
纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达95％。
Ni-NTA可再生4-6次，重复使用。
本产品悬浮液为20％乙醇，已螯合Ni2+。
操作方法：A.非变性条件下抽提His标签蛋白1)准备细胞，接种，诱导表达。
收集细胞，置于-70°C或立即进行步骤2操作。
2)加入1/20细胞生长体积的NTA-0Buffer和PMSF。
PMSF使用的工作浓度为1mM 现用现加。
3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶，混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。
该步骤冰上操作。
4)加入10%Triton X-100,使终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟。
5)12000rpm/min(20,000×g以上)，4°C离心15分钟以上。
取上清，置于冰上备用或-20°C保存。
6)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗。
7)将样品加至NTA层析柱中，流速在15ml/h左右，收集穿透部分，用SDS/PAGE分析蛋白的结合情况。
Ni-NTA RESIN(6FF、6HP) 说明动态结合能力大约40 mg Histidine-tagged 蛋白质/ml 填料建议流速＜2ml/min填料的再生注意：如果纯化同一个蛋白，每次纯化后，不需要将介质的金属离子洗脱下来，5-7次纯化工作后，再重新螯合金属。
建议按以下的步骤进行介质的再生：1. 5倍体积的20mM 磷酸钠，0.5M NaCl，50mM EDTA，pH7.4。
2. 至少5倍体积的结合液。
3. 5倍体积的去离子水。
4. 0.5倍体积的0.1M NiSO4。
5. 5倍体积的去离子水。
6. 5倍体积的结合液。
贮存在20%乙醇中。
一些操作过程中，残留的变性蛋白和脂肪在再生过程中不能去除，但是在位清洗可以将它们除去。
在位清洗当填料背压明显增大时，填料需要清洗了，清洗前，参照上述的步骤先将Ni离子洗脱下来，然后逆流清洗。
清洗后的介质贮存在20%乙醇中，或先螯合上Ni离子再贮存到20%乙醇中。
不带Ni离子的填料参照以下方法清洗：y5倍体积的1.5M NaCl洗脱离子型结合的蛋白。
y5倍体积的去离子。
y 1M NaOH浸泡柱子，1-2h，主要去除沉淀蛋白，疏水型结合的蛋白和脂蛋白。
y 10倍体积的结合液。
y 10倍体积的去离子水。
y5-10倍体积的30%异丙醇洗涤，去除疏水型结合的蛋白，脂蛋白和脂肪，约15-20min。
y10倍体积的去离子水。
可替代的方法：2倍体积的酸性或碱性的去污剂洗涤。
如含0.1-0.5%非离子型去污剂的0.1M醋酸浸泡1-2h，处理后，70%乙醇冲洗去除残余的去污剂，最后用10倍体积的去离子水洗涤。
Ni-NTA RESIN(6FF、6HP) 与下列给定浓度的试剂兼容还原试剂5mM DTE1mM DTT20mM β-巯基乙醇5mM TCEP10mM 还原性谷胱甘肽变性剂8M 尿素6M 盐酸胍去污剂2%Triton-1002%Tween202%NP-402%胆酸盐1%CHAPS其它试剂20%乙醇50%甘油100mMNa2SO41.5M NaCl1mM EDTA60mM 醋酸缓冲液组分50mM 磷酸钠，pH7.4100mM Tris-HCl，pH7.4 100mM Tris-acetate, pH7.4100mM HEPES，pH7.4100mM MOPS，pH7.4100mM 醋酸钠，pH7.4。
Ni-NTA Agarose用户手册克劳宁（北京）生物科技有限公司北京市海淀区中关村西区天创科技大厦407A邮编:100080电话: 0086-10-62698317传真: 0086-10-62698352电邮:***************.cn订购:***************.cn咨询:**************.cn网站: 目录用户手册介绍 ------------------------------------------------------------------- 1细胞裂解 ------------------------------------------------------------------------ 1昆虫细胞裂解 ------------------------------------------------------------------- 1哺乳动物细胞裂解 -------------------------------------------------------------- 1蛋白纯化-非变性条件 ----------------------------------------------------------- 2蛋白纯化-变性条件 ------------------------------------------------------------- 2蛋白纯化-混合条件 ------------------------------------------------------------- 3 Ni-NTA树脂活化 --------------------------------------------------------------- 3组成成分 ------------------------------------------------------------------------ 3疑难解答 ------------------------------------------------------------------------ 4 2011年12月修订Ni-NTA 纯化MCLAB Ni-NTA agarose beads可用于从细菌、昆虫及哺乳动物细胞中纯化高质量的6x HIS-tagged 重组蛋白。
原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述原核表达是一种重要的蛋白质表达方法，它在生物学和生物技术领域被广泛应用。
原核表达系统通常包括大肠杆菌、酵母和其他细菌等微生物，其表达效率高、表达周期短、操作简便，因此备受研究者青睐。
然而，由于细胞内含有大量的内源性蛋白和杂质，常规方法无法有效地纯化目标蛋白。
为了解决这一问题，科学家们开发了各种蛋白纯化方法。
其中，镍离子亲和纯化技术因其高选择性和高效性而备受关注。
镍离子亲和纯化的原理是基于镍离子（Ni2+）与某些蛋白的特定结构域（如组织因子蛋白A标签、组织因子蛋白S标签和组织因子蛋白H标签等）之间的特异性配位作用。
通过构建一定的表达载体，将含有目标蛋白的基因与镍离子亲和柱（如Ni-NTA柱）结合，可以实现目标蛋白在细胞裂解液中的高效富集。
在原核表达蛋白镍离子亲和纯化的方法中，首先需要构建包含目标蛋白编码序列的表达载体，并将其转化到适当的宿主细胞中。
然后，通过诱导表达剂（如异丙基β-D-硫代半乳糖苷）刺激蛋白的大量合成。
接着，使用一系列的细胞破碎方法，如超声波处理或高压细胞破碎仪，将细胞内的目标蛋白释放出来。
最后，通过镍离子亲和柱，将目标蛋白与杂质分离，得到纯化的目标蛋白。
镍离子亲和纯化在原核表达蛋白中具有广阔的应用前景。
通过该方法，可以高效地纯化大量的目标蛋白，为后续的结构解析、功能研究和药物开发提供了可靠的材料基础。
然而，该方法也存在一些局限性和可改进之处，例如对于某些难以表达的蛋白，亲和纯化的效率可能较低；此外，在某些情况下，镍离子柱可能与非特异性结合的蛋白相互作用，导致纯化产物的纯度下降。
综上所述，原核表达蛋白镍离子亲和纯化技术是一种高效、可靠的蛋白纯化方法，具有广泛的应用前景。
随着该技术的不断发展和改进，相信将为蛋白研究领域提供更多更好的工具和方法。
文章结构部分的内容可以如下所示：1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述：第一部分是引言。
Ni-NTA亲和层析介质Cat.No.L00250版本号: 05052017 目录I.产品描述 (1)II.纯化步骤 (2)III.故障排除 (4)IV.订购信息 (4)I.产品描述金斯瑞Ni-NTA亲和层析介质（产品编号L00250）是把NTA（氮川三乙酸）共价偶联到4%的琼脂糖介质上，再通过NTA的4个结合位点螯合Ni2+制备而成的亲和层析介质。
Ni-NTA亲和层析介质的Ni2+脱落率非常低，它能耐受蛋白纯化过程中使用的很多添加剂，并且有着较高的蛋白结合能力和稳定性，因此Ni-NTA亲和层析介质非常适用于多组氨酸重组蛋白的纯化。
我们提供10 ml，25ml，500 ml三种规格的包装。
表1：产品特征柱体积10 ml、25 ml和500 ml（20 ml、50 ml和1000 ml的50 %悬浆液）吸附量每毫升填料吸附量>20 mg 6xHis-tagged 蛋白（27 kDa）基质4%琼脂糖平均粒径90 μm（45-165 μm）保护液1×PBS（含20%乙醇）存储条件2-8℃保质期2‐8℃储存18个月表2：Ni-NTA亲和层析介质可耐受试剂变性剂表面活性剂还原剂盐其他6 M 盐酸胍2%Triton X-100 20 mM β-ME 4 M MgCl250%甘油8 M尿素2% Tween 20 1 mM DTT 5 mM CaCl2 20%乙醇1% CHAPS 2 M NaCl 1 mM EDTA1II.纯化步骤常规条件下纯化多组氨酸标签蛋白1试剂准备所用缓冲液需采用高纯水配制，使用前建议用0.45 μm滤膜过滤。
Lysis平衡缓冲液（LE Buffer）：50 mM Na2HPO4, 0.3 M NaCl, pH=8.0洗涤缓冲液：50 mM Na2HPO4, 0.3 M NaCl, 10 mM imidazole pH =8.0洗脱缓冲液：50 mM Na2HPO4, 0.3 M NaCl, 250 mM imidazole pH =8.02样品准备大肠杆菌或酵母细胞质中表达的重组蛋白(1) 4℃离心（如：5000 rpm 离心5分钟）收集50 ml培养基中的细胞。
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书一、简介金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。
因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。
半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。
镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。
本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。
二、性能参数：三、适用范围分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
四、应用实例实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4-8℃环境中保存。
缓冲液组成：缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。
配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。
镍离子亲和层析介质镍离子亲和层析介质，哎呀，这个名字听起来有点专业对吧？其实它就像一个超级神奇的魔术工具，能帮我们从一堆杂乱的东西中，挑选出我们需要的“珍品”。
你看啊，就像做饭的时候，我们从菜篮子里挑选食材，能不能挑到最好的食材，决定了这道菜的成败。
镍离子亲和层析介质的工作原理也差不多，就是利用镍离子和特定蛋白质之间的亲和力，把蛋白质从杂乱的混合物中筛选出来。
而镍，别看它是金属，实际上它非常“讲究”，特别擅长和那些带有组氨酸标签的蛋白质搞好关系。
嗯，讲得直白点，镍就像个“金牌婚介”，给蛋白质牵线搭桥，最终帮我们把这些蛋白质一一挑选出来。
很多人就会问了，哎呀，这个亲和层析介质到底是怎么工作的？好吧，咱们就从最简单的开始。
想象一下你在超市里，看到一堆五花八门的蔬菜水果，根本不知从何挑起。
可如果你知道，橙子比苹果更适合做果汁，苹果又适合做派，那你的选择就简单多了。
这就像镍离子亲和层析介质，它有个“招数”，就是在溶液中加入镍离子，这些镍离子就会特意和带有组氨酸标签的蛋白质相亲相爱。
而那些不带标签的蛋白质就只能乖乖地“走开”，什么都不捞到。
所以说，镍离子就像一位“高效导游”，让蛋白质在复杂的世界里，找到自己的“专属路线”。
说到这个，大家可能还会想，哎，这种“导游”是不是很贵呀？镍离子亲和层析介质的优点之一，就是效率高，成本相对较低。
你要知道，做实验也像做生意，讲究的就是性价比。
镍离子亲和层析介质的出现，帮助科学家们大大节省了时间和成本。
如果没有它，蛋白质提纯的过程就像是大海捞针，效率低得令人崩溃。
而镍离子亲和层析介质一出来，马上就让这个过程变得简单又快捷，简直就是实验室里的“效率神器”！当然了，这个亲和层析介质可不是随便哪个镍离子都能搞定的。
咱们在用镍离子的时候，可得有点讲究，镍离子必须得是纯净的，不能带有杂质。
你想啊，镍离子要跟蛋白质亲近，得干净得像一块刚擦过的玻璃，才能把蛋白质吸附住。
如果镍离子有杂质，那这些杂质就会打乱它和蛋白质之间的“浪漫关系”，蛋白质也就没办法被有效地挑出来，最终我们就白忙活一场。
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书一、简介金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。
因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。
半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。
镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。
本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。
二、性能参数：三、适用范围分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
四、应用实例实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4-8℃环境中保存。
缓冲液组成：缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。
配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。
缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。
配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5MNa2HPO481ml，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加适量，水调pH后定容到1000ml。
缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制：SDS-PAGE流程：1、BCA法测量样品蛋白浓度2、根据测定样品的蛋白浓度，算出5~10μg/孔所需的体积。
3、向1.5ml EP管中加入含5~10μg蛋白的样品溶液，若体积小于10μl，则加20mM PBS pH7.4补足10μl；若体积大于10μl，则要加入1ml无水乙醇，－20℃下浓缩1h。
4、取浓缩样品10000rpm离心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除残余的乙醇。
5、在样品加入20mM PBS pH7.4和2×loading buffer各10μl，100℃下10min。
取出后冷却30s，4000rpm离心1s。
6、点样，电泳。
实验结果：（1）使用Ni-NTA Agarose纯化His标签重组蛋白His标签重组蛋白的上样量为20ml，用分别含20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液B进行洗脱，色谱结果见图1，色谱各组分的SDS-PAGE结果见图2。
图1. Ni-NTA Agarose纯化带His标签重组蛋白色谱图图2. SDS-PAGE 图谱1、标准蛋白，2、上样液，3、流穿液， 4：20mM洗脱液， 5：50mM洗脱液，6：100mM洗脱液， 7：200mM洗脱液， 8：300mM洗脱液， 9：400mM洗脱液。
（2）使用Ni-NTA Agarose纯化His标签重组蛋白包涵体条件和前面的方法基本相同，只是缓冲液中加了8M的脲，溶液配方如下表，其纯化色谱图和电泳图分见图3、图4。
要注意的是不同的包涵体溶解度不同，也可以用6M盐酸胍代替8M脲，因为盐酸胍溶解包涵体更完全。
缓冲液组成：缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。
配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g和脲480 g，加热溶解后定容到1000ml。
缓冲液2：50mMpH7.4的PBS溶液。
配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g，咪唑34g和脲480 g，加热溶解后定容到1000ml。
缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制：图3. Ni-NTA Agarose纯化His标签重组蛋白包涵体色谱图图4.SDS-PAGE图1：包涵体，2：流穿液，3：50mM咪唑洗脱液，4：400mM咪唑洗脱液。
（3）不同金属离子及洗脱条件对纯化效果的影响使用Ni-NTA Agarose，His标签重组蛋白的上样量为10ml，用含有20、50、100、200、500mM 咪唑的缓冲液3洗脱，缓冲液1和2均加入终浓度为1%的吐温80，其结果表明加入表面活性剂可以降低杂吸附。
此外分别螯合铜钴金属离子做同样的纯化实验，结果表明在回收率和纯度上都以螯合镍离子的效果最好，其分离纯化的纯度可以＞90%，而目标蛋白的回收率高达80%，所以建议首选镍离子螯合填料，别的可以不用考虑。
五、应用注意事项：镍离子金属螯合亲和层析介质最经典的配体是IDA。
镍离子有六个螯合价数，Ni-IDA螯合了三价，剩余三价；而Ni-NTA螯合四价，剩余两价，因此Ni-IDA琼脂糖凝胶作用力要比Ni-NTA 琼脂糖凝胶的强。
也正因为这个原因，在同样条件下Ni-IDA洗杂质和目标蛋白的要比Ni-NTA 的咪唑浓度高，但是NTA的填料更稳定，耐受更强的还原剂，更不容易脱落；而IDA的载量要比NTA高，可以反复利用，更加经济。
具体用哪个填料完全看个人的习惯以及纯化的条件而决定。
六、有关操作说明1、色谱柱装填（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。
（2）在柱下端加入蒸馏水，以除去柱中空气，关闭柱出口，在柱内保留少量蒸馏水。
（3）将介质连续倒入柱子时，要用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让介质自然沉降。
（4）柱压不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则控制流速高于300cm/h，但是在使用中一般只用最大流速的75%。
2、固定金属离子（1）金属离子的固定必须用过滤好的金属离子溶液，以防止金属盐在介质上沉淀。
（2）用2-5倍柱床体积的蒸馏水充分平衡柱子。
（3）选择合适的金属离子（Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+等），溶解在中性或弱酸性的溶液中，浓度为0.1~0.3M。
如果是Fe3+必须在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe3+产生沉淀。
（4）用2-5个柱床体积的金属离子溶液上柱，再用不少于5倍柱床体积的蒸馏水洗涤色谱柱，洗去未螯合的金属离子。
（当然也可以把洗净没有螯合的填料直接和需要的金属离子溶液在摇床上震荡过夜，这样螯合效果更好，Ni-NTA Agarose尤其适合用这样的方法。
）（5）用2-5倍柱床体积的起始缓冲溶液平衡柱子，再上样。
（6）如果是螯合铁离子，要注意的是在中性条件下，Fe3+很容易被还原而生成沉淀，所以Fe3+溶液的pH最好是3-5。
螯合Fe3+的色谱柱不能长时间保存在中性溶液中。
建议每次用完后都要将螯合的Fe3+用50 mMEDTA溶液洗净，下次使用时再重新螯合。
如果洗不干净，也可以将介质浸在50mM的EDTA中过夜后再清洗保存。
3、上样（1）样品通溶解在pH5.5~8.5的缓冲液中，提高上样缓冲液的pH值，可以增大载量。
（2）选择起始缓冲液，主要是依据金属离子的特性及样品与金属离子的结合特性。
（3）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，也最好不含巯基乙醇等还原剂。
（4）常用缓冲液有10~20m M磷酸钠盐缓冲液和50mM醋酸钠缓冲液（5）在缓冲液中要加入0.15~0.5M的NaCl，以消除离子交换作用。
（6）使用金属螯合层析有一个通常的法则，如果不了解蛋白的结合特性，建议先选用Zn2+，缓冲液可以选择中性的磷酸盐或者醋酸盐缓冲液，NaCl的含量为0.15-0.5M，作为起始缓冲液。
（7）缓冲液中的去污剂一般不会影响对蛋白的吸附作用。
（8）蛋白被吸附时，经常会有一部分的螯合金属离子被替换，这种现象通常是可见的，尤其是使用有色的金属离子时，比如Cu2+，所以使用几次后可以先把金属离子洗下来，然后再重新螯合金属离子。
4、洗脱（1）线性降低或一步降低pH，大多数蛋白在pH6~4会被洗脱下来，也可以在pH3~4，缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸、磷酸盐缓冲体系。
（2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质，如0~0.5M咪唑，0~50 mM 组氨酸，0~2M NH4Cl。
梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH下进行。
（3）EDTA、EGTA等螯合剂会与金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来，这种方法不能使不同的蛋白分离，此外会影响蛋白吸附，导致融合蛋白不能挂柱。
（4）所有上述情况中，缓冲液中必须加入0.15~0.5M的NaCl 以消除离子交换作用。
（5）当螯合离子配基是Cu2+时，有以下的三种操作方式：降低pH：上样缓冲液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 7.4洗脱缓冲液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 3.5竞争洗脱：上样缓冲液：50 mM Na2HPO4， 1M NaCl， pH 7.4洗脱缓冲液：50 mM Na2HPO4， 1M NH4Cl， pH 7.4脱落洗脱：上样缓冲液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 7.4洗脱缓冲液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4使用降低pH和脱落洗脱都会使金属离子掉下来，下次使用就得重新螯合金属离子。
七、再生、清洗、保存1、凝胶的再生（1）螯合一种新的金属离子之前，必须将胶再生。
用5~10倍体积的50mM EDTA淋洗柱子，再用2~3倍体积的0.5M NaCl洗掉残留的EDTA。
（2）金属离子的重新固定的方法如前文所述。
在一些操作中，变性蛋白和脂质不能在柱子的再生过程中被洗脱下来，他们可以通过在位清洗被除去。
2、在位清洗（1）除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2~3倍柱床体积2M NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗。
（2）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，用1M NaOH以100cm/h的速度淋洗柱子1h。
（3）所有操作中，都要用至少3倍柱床体积的初始缓冲液洗柱子。
（4）除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4倍柱床体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇洗柱子，再反向淋洗。
