葡 萄 皮 原 花 青 素 的 提 取 工 艺 研 究

葡萄皮原花青素的提取工艺研究陈国文兰州理工大学石油化工学院2008级应用化学四班摘要:以野生毛葡萄皮为原料,以原花青素提取率考察指标, 研究提取溶剂种类、浓度、料液比、提取温度、提取时间、提取次数等因素对原花青素提取效果的影响。

通过正交实验, 确定野生毛葡萄皮中原花青素的最佳提取工艺条件为: 提取溶剂为60% 乙醇, 料液比1：9 , 提取温度60o C , 提取时间25 h, 提取3 次。

在此优化条件下野生毛葡萄皮中原花青素的平均提取率为5.02% 。

关键词:野生毛葡萄; 原花青素; 提取引言：山葡萄（Vitis amurensis Pupr）人工家植近４０年，由于该树种生产栽培易管理，产量和效益高，目前在我国内蒙古和东北地区生产栽培近1.1万ｈｍ２，年总产量１２.８万ｔ，果实发酵酿酒产生废皮渣近１.８万ｔ，目前这些皮渣大多被当作肥料、饲料甚至垃圾处理，附加值很低。

随着国内外不断深入研究发现，葡萄皮渣中存在着大量的、多种的有益成分，蕴含着巨大的经济效益，其中低聚原花青素、白藜芦醇、齐墩果酸、葡萄籽油等多种功能性成分，具有良好的医疗、保健作用[1-2] 。

因此，开展葡萄皮渣综合利用，不仅可以获得良好的社会效益，而且能够有效减轻环保压力，获得巨大的经济效益[3] 。

于2009-2010 年对山葡萄发酵酿酒皮渣中的原花青素、籽油和白藜芦醇含量进行测定分析，取得了良好的效果。

野生毛葡萄是喀斯特地区特有的生态植物 , 所酿造的葡萄酒以独特的风味和具有软化血管和驻颜益寿的功效著称。

葡萄皮中还具富含黄酮类化合物[4-5] , 原花青素作为黄酮类化合物的一种, 由于其优越的抗氧化活性和能预防心血管疾病、抗肿瘤、抗辐射、防血小板凝结, 且能调节哺乳动物关键生物途径, 抑制多种细菌, 以高效、低毒、高生物利用率等功效越来越受到国内外的广泛关注 [6-7]。

我国西部地区有着丰富的野生毛葡萄资源 , 其中大部分用于酿酒 , 另一部分用于葡萄汁饮料。

葡萄酿酒或果汁加工的下脚料主要是葡萄籽与葡萄皮。

如何将这些资源充分利用 , 变废为宝 , 用来开发研制高附加值产品 , 成为亟待解决的问题, 虽然目前国内对葡萄籽原花青素的研究有了广泛基础[8-9] , 但都是以普通葡萄为原料 , 原花青素的提取率都比较低 , 对于从野生毛葡萄中提取原花青素的研究未见相关报道。

本论文对野生毛葡萄皮中原花青素的提取工艺进行了研究 , 为开发纯天然抗氧化剂提供一定的科学依据。

1 简介原花青素，英文名是Oligomeric Proantho Cyanidins（OPC），是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。

一般为红棕色粉末，气微、味涩，溶于水和大多有机溶剂。

一般为葡皮提取物或法国海岸松树皮从蓝莓叶中提取的原花青素可以抵抗丙肝病毒提取物。

原花青素（葡萄皮提取物）是一种新型高效抗氧化剂，是目前为止所发现的最强效的自由基清除剂，具有非常强的体内活性。

实验证明，OPC 的抗自由基氧化能力是维生素E的50 倍，维生素C 的20 倍，并吸收迅速完全，口服20分钟即可达到最高血液浓度，代谢半衰期达7 小时之久。

在结构上，原花青素是由不同数量的儿茶素（catechin）或表儿茶素（epicatechin）结合而成。

最简单的原花青素是儿茶素、或表儿茶素、或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。

按聚合度的大小，通常将二～五聚体称为低聚体（简称OPC），将五聚体以上的称为高聚体（简称PPC）。

2 实验仪器及材料2.1 仪器设备RE--52 旋转蒸发仪 ( 上海亚荣生化仪器厂 ) ; ZKD-6090B 全自动新型真空干燥箱( 上海智城分析仪器制造有限公司) ; AL104 电子分析天平( 梅特勒托利多仪器有限公司 ) ; SHZ-2000 循环水式多用真空泵 ( 巩义市予华仪器有限公司) ; 2003 型恒温磁力加热搅拌器( 上海闵行虹浦仪器厂) ; HWY-2112 型恒温调速振荡器( 上海智城分析仪器制造有限公司) ; WFZUV- 2000 紫外/可见分光光度计( 尤尼柯仪器有限公司) 。

2.2 材料原花青素标准品( 桂林莱茵生物制品有限公司, 纯度> 95.0% ) ; 甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯，硫酸、香草醛, 均为分析纯试剂。

野生毛葡萄皮( 由广西罗城野生毛葡萄酒厂提供) 。

3 实验方法3.1 原花青素的提取方法准确称取粉碎后的野生毛葡萄皮10 g 于250ml 圆底烧瓶中, 在一定料液比、溶剂浓度、温度等条件下热回流提取一定时间, 取出过滤, 将滤渣再经两次重复提取后过滤 , 合并三次所得滤液进行减压浓缩 , 将浓缩液定容 , 测定野生毛葡萄皮中原花青素的提取率 ( 本文中以质量分数表示, 即每100g 野生毛葡萄皮经提取得到的原花青素的质量) 。

3.2原花青素含量的测定将原花青素标准溶液稀释成不同浓度, 分别各取0.5 ml 于10 ml 具塞比色管中, 加入2.5 ml 30 g/ l 的香草醛溶液和25 ml 30% 的硫酸溶液, 在30o C 条件下避光反应 15 min, 以去离子水为空白 , 在 550nm 处测定吸光度值 , 实验数据经回归处理, 得到线性回归方程: y = 1.7644x-0.0072 , R2= 0.9961 结果表明, 原花青素浓度在0.05-0.5 mg/ml 范围内具良好的线性关系。

4 结果与分析4.1提取溶剂的确定原花青素是一种多羟基化合物, 它能溶解于乙醇、甲醇、丙酮和水等极性溶剂中。

因此, 在处理条件一致的情况下, 比较了乙醇、甲醇、丙酮及水对野生毛葡萄皮中原花青素的提取效果 , 以确定最佳提取溶剂。

结果显示采用蒸馏水提取的效果较差 ,会有一些大分子物质溶出而引入杂质, 使过滤困难。

乙醇的提取效果优于甲醇、丙酮, 且甲醇、丙酮均有一定毒性, 不适宜应用于食品工业生产。

在热回流提取条件下, 选用相同浓度的乙醇、乙酸乙酯、丙酮和蒸馏水进行提取,确定最佳提取溶剂，不同提取溶剂对提取效果的影响，可知,采用蒸馏水提取的效果较差, 而乙醇的效果最好。

由于丙酮、乙酸乙酯等均有一定毒性,若去除不完全会对人体造成伤害 ,而水的提取效果太差 ,从安全、经济的角度考虑。

因此选择乙醇作为最佳的提取溶剂。

选择提取溶剂浓度、提取温度、料液比、提取时间和提取次数等因素考察对提取物原花青素质量分数的影响, 以确定相关因素及其范围。

4.2提取剂浓度确定乙醇的溶解性能好 , 穿透细胞能力强。

随着乙醇浓度的增加 , 提取率增大 , 当乙醇浓度达到一定程度时 , 原花青素溶解度最大 , 提取率最高。

而当乙醇浓度再增加, 原花青素的提取率减少, 主要是一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出量增加 , 这些成分与原花青素竞争与乙醇一水分子结合 , 从而导致原花青素的提取率下降。

乙醇的最适浓度为60% 。

4.3料液比确定提取溶剂用量越大, 提取率越大, 但是过大的料液比会造成溶剂和能源的浪费 , 并给后工序的浓缩带来困难 , 当料液比增大到一定程度时 , 提取率趋于稳定 , 即一定比例的溶剂已将目标成分基本溶出完全, 最适宜料液比为1:12 。

4.4提取温度确定随提取温度的升高 , 原花青素的提取效果增强。

因为温度升高 , 分子运动速度加快, 渗透、扩散、溶解速度加快, 同时较高温度也可以引起细胞膜结构的变化 , 使原花青素由葡萄皮的外层细胞转移到溶剂中。

但是太高温度也使原花青素的结构被氧化破坏 , 导致其提取效果下降, 因此提取温度60o C 时, 提取效果最好。

4.5提取时间确定原花青素提取效果随提取时间的增加而变化。

当提取达到一定时间时, 葡萄皮内外有效成分浓度达到平衡, 提取效果最好。

随着时间的进一步延长 , 其提取效果有所下降 , 因为原花青素在溶液中长时间受热可能使部分酚结构被破坏。

但是, 如果提取时间过短, 原花青素则不能很快从葡萄皮细胞中溶出 , 影响提取效率 , 因此选择最适时间为2h 。

4.6 提取次数确认提取次数越多, 累计提取率越高, 但提高幅度明显降低, 第四次的提取量非常低, 因此只需提取3 次即可。

4.7正交实验在单因素试验的基础上, 选出影响原花青素提取效果的主要因素 : 提取温度、乙醇浓度、料液比、提取时间。

利用正交实验分析了上述四种因素在三个水平上对野生毛葡萄皮中原花青素提取效果的影响。

对影响原花青素提取效果的因素主次顺序依次为 : 提取温度 > 料液比> 提取时间> 乙醇浓度。

最佳条件为A3B2C3D3, 即加入9 倍于原料的60%乙醇, 在60 温度下提取3 次, 每次提取时间2.5h, 按最佳条件提取三次。

野生毛葡萄皮中原花青素的平均提取率为5.02% 。

4.8原花青素精制葡萄皮提取液不仅含原花青素，且含有其它成分。

根据原花青素结构特点和树脂性质，选用 NKA 树脂[14-16]对提取液中原花青素进行精分离。

取原花青素粗产品上柱，静置30min 后取等量样液缓慢加入NKA 树脂柱中，依次用无离子水，及20%、40%、60%、80% 及纯乙醇溶液进行洗脱，分别收集各部分洗脱液，经真空浓缩，按1.2.4 方法测定其吸光值。

结果表明，原花青素主要存在于40% 和60% 乙醇洗脱液中，水相中含有微量原花青素，60% 乙醇洗脱液吸光值最大。

因此，样液上柱后，先用水洗脱除去其它成分，再用60% 乙醇溶液洗脱，可将树脂吸附原花青素基本全部洗脱下来。

5 结论根据实验结果与分析可知 , 野生毛葡萄皮中原花青素的提取率较普通葡萄高 [7] 。

采用热回流的提取方式 , 乙醇为提取溶剂 , 通过单因素和正交实验 , 考察各因素对原花青素提取效果的影响 , 野生毛葡萄皮中原花青素提取的最佳工艺条件为: 提取溶剂为60% 乙醇, 提取温度60o C , 料液比1:9 , 提取时间2.5h, 提取3 次。

野生毛葡萄皮经乙醇热回流提取可得到原花青素得率为5.02% 。

由于提取物中仍含有一些水溶性大分子的杂质 , 如果糖类和有机酸等, 它们会影响到野生毛葡萄皮中原花青素的精制, 故今后还需要对野生毛葡萄皮中原花青素的分离纯化和抗氧化性能做进一步的研究。

6 工艺流程优质葡萄皮→粉碎→脱脂→过滤→烘干→（超声波提取）→过滤→蒸发浓缩→乙酸乙酯萃取→真空浓缩→粗产品→洗脱→真空浓缩→干燥7 参考文献:1 那娜，钟进义. 葡多酚对细胞凋亡的抑制作用研究[J] . 国外医学临床生物化学与检验学分册，2002，23：112-114.6，11：196- 201.2 王辉宪，姜晖霞，王仁才，等．葡萄籽油及原花青素研究与开发利用[J ]．果树学报，2005，22(5)：542-47．3 赵超英，姚小曼．葡萄籽提取物原花青素的营养保健功能[J]．中国食品卫生杂志，2000，(6)：38-41．4 国植，徐莉. 原花青素：具有广阔发展前景的植物药[J] . 国外医学植物药分册，1996，11：196- 201.5 Fuleki T Ricardo d a Silva J M J A gric F oo d Chem[J] 1997, 45 1156-1160 .6 郑光耀.葡萄皮原花青素提取物的生理活性、药理作用及其应用[J] .林产化工通讯, 2000, 34 ( 1) : 28- 33 .申鹏，杭湖，郝晓丽。